吳 瑩 陳向陽 玄子男 李宇航

(北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京，100029)

經(jīng)方指《傷寒論》和《金匱要略》所記載之方劑。經(jīng)方具有用藥精當(dāng)、劑量準(zhǔn)確;組方嚴(yán)謹(jǐn)、配伍巧妙;劑型豐富、煎服有法;加減靈活、功效卓著等特點(diǎn)，為歷代醫(yī)家進(jìn)行方劑研究的首選對(duì)象［1］。然而，經(jīng)方的現(xiàn)代研究同樣面臨藥理作用機(jī)制復(fù)雜、有效成分不明確等問題，從而制約了經(jīng)方在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的推廣以及國(guó)際化的進(jìn)程。因此，憑借現(xiàn)代藥學(xué)、免疫學(xué)及分子生物學(xué)等技術(shù)手段，從經(jīng)方主要活性成分的鑒定、藥理作用的分子機(jī)制等方面揭示經(jīng)方的作用機(jī)制，是經(jīng)方現(xiàn)代研究的重要關(guān)節(jié)之一?；诖?，我們?cè)诒疚膶⒔榻B高效液相色譜(High-Performance Liquid Chromatography，HPLC)相關(guān)技術(shù)在經(jīng)方成分鑒定，以及免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation，Co-IP)、激光共聚焦技術(shù)在經(jīng)方藥理作用機(jī)制研究方面的應(yīng)用及思路。

1 HPLC及高效液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS)技術(shù)在經(jīng)方現(xiàn)代研究中的應(yīng)用

現(xiàn)代藥理學(xué)研究需要明確藥物成分、含量以及質(zhì)控。HPLC及其相關(guān)技術(shù)是以液體作為流動(dòng)相，采用高壓泵、高效固定相、高靈敏度檢測(cè)器發(fā)展而成的一種分離分析方法，由于具有準(zhǔn)確快速等優(yōu)勢(shì)，常用于檢測(cè)藥物的主要成分及含量，是藥物分析研究中關(guān)鍵的質(zhì)控技術(shù)。HPLC憑借其高效、高速、可分離大多數(shù)液體樣品等優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于藥物的含量測(cè)定［2-3］、成分分析［4-5］、質(zhì)量控制［6-7］等方面。同時(shí)，利用HPLC的高分離效能和質(zhì)譜技術(shù)(MS)的高選擇性、高靈敏度及能夠提供相對(duì)分子質(zhì)量與結(jié)構(gòu)信息的優(yōu)點(diǎn)，將HPLC與MS聯(lián)合使用，更加有利于準(zhǔn)確分析藥物組分［8-9］。HPLC及HPLC-MS聯(lián)用技術(shù)的優(yōu)越性，使其廣泛被應(yīng)用到經(jīng)方成分及含量的鑒定中。經(jīng)方的HPLC、HPLC-MS分析涉及經(jīng)方樣品的前處理、經(jīng)方成分的定量分析、定性分析以及經(jīng)方的藥物代謝研究等方面。

1.1 經(jīng)方樣品的前處理 經(jīng)方湯劑是我國(guó)應(yīng)用最早、最廣泛的一種劑型，是將加工炮制或未經(jīng)炮制的藥材納入飲用水(或其他專用水)中浸泡，再經(jīng)煎煮去渣取汁制成的液體制劑［10］。煎煮法是我國(guó)中藥復(fù)方傳統(tǒng)的提取方法，也是現(xiàn)代經(jīng)方研究過程中最常采用的提取方法。煎煮方法直接影響到藥物有效成分的溶出量，不同經(jīng)方煎煮方式會(huì)有所不同，需高度重視。魏惠珍等［11］將大黃36 g，厚樸27 g，枳實(shí)27 g，芒硝13.5 g浸泡在8倍量水中30 min，加熱煮沸后，文火慢煎40 min，放冷，紗布濾過得大承氣湯，用于大承氣湯HPLC指紋圖譜的研究。胡俊輝［12］稱取干姜、黃芩、黃連、人參各75 g，加10倍量的水浸泡2 h后，煎煮1 h，濾過再煎煮兩次，合并濾液，濃縮定容至2000 mL作為水煎液;采用RP-HPLC測(cè)定干姜黃芩黃連人參水煎液的11種藥效成分。

隨著科技的發(fā)展與科研的需要，許多新技術(shù)、新方法如超聲提取法、水蒸氣蒸餾法、超臨界流體萃取法、微波萃取法等被應(yīng)用到中藥化學(xué)成分提取中，其中超聲提取法也常被用于經(jīng)方有效成分的提取，尤其在經(jīng)方丸劑樣品溶液制備方面，更顯其重要性。如郭琪等［13］精密稱取麻仁潤(rùn)腸丸樣品0.5 g，加甲醇25 mL，稱重，超聲(100W，45kHz)30 min，再用甲醇補(bǔ)足重量，搖勻?yàn)V過即得麻仁潤(rùn)腸丸供試品溶液。李冬梅等［14］采用超聲提取法得止嗽定喘丸溶液，又通過固相萃取技術(shù)凈化處理樣品，用于止嗽定喘丸中鹽酸麻黃堿及鹽酸偽麻黃堿含量的測(cè)定。

1.2 HPLC及HPLC-MS聯(lián)用技術(shù)在經(jīng)方成分分析中的應(yīng)用 經(jīng)方藥物組成變化多樣，所含化學(xué)成分類型眾多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，數(shù)目龐大。如何將現(xiàn)代化的成分分析手段與現(xiàn)有的提取技術(shù)相結(jié)合，對(duì)于經(jīng)方有效成分的分離分析至關(guān)重要，而HPLC法及HPLCMS可以實(shí)現(xiàn)多種成分分離分析，展現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。

1.2.1 經(jīng)方定量分析 由于HPLC具有簡(jiǎn)便、快速、大大提高檢測(cè)效率等特點(diǎn)，已在經(jīng)方研究中占據(jù)著重要的地位。HPLC通過定量分析經(jīng)方的多種化學(xué)成分，可確定經(jīng)方有效成分的含量、分析經(jīng)方配伍效應(yīng)、實(shí)現(xiàn)經(jīng)方用藥的多指標(biāo)質(zhì)量控制，為經(jīng)方的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。HPLC定量分析結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確度還可通過標(biāo)準(zhǔn)偏差、日內(nèi)以及日間精密度來衡量。毛瑩等［15］利用 HPLC法，采用色譜柱Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm)，3種不同的流動(dòng)相，4種梯度洗脫方法分別對(duì)葛根芩連湯中葛根素、大豆苷、大豆苷元，黃芩苷、漢黃芩苷、漢黃芩素、黃芩素，鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸藥根堿、鹽酸表小檗堿、鹽酸黃連堿，甘草酸銨、甘草苷進(jìn)行了含量測(cè)定。堯愛珉等［16］采用HPLC法對(duì)梔子大黃湯中的9種特征成分進(jìn)行定量測(cè)定，并分析該經(jīng)方配伍前后成分的變化。實(shí)驗(yàn)建立了HPLC-UV測(cè)定該經(jīng)方水煎液中梔子苷、柚皮苷、橙皮苷及新橙皮苷的含量測(cè)定方法，結(jié)果顯示梔子大黃湯全方配伍能夠增加梔子苷及三種黃酮苷的含量;該實(shí)驗(yàn)又采用HPLC-DAD法對(duì)梔子大黃湯中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚及大黃素甲醚進(jìn)行含量測(cè)定，發(fā)現(xiàn)枳實(shí)-大黃配伍可以增加五種蒽醌化合物的含量。朱繼孝等［17］建立HPLC-DAD法對(duì)梔子柏皮湯中梔子苷、甘草苷、西紅花苷-I、鹽酸藥根堿、西紅花苷-Ⅱ、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿和甘草酸8種有效成分含量的同時(shí)測(cè)定，為該復(fù)方的質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)提供依據(jù)。劉晶晶等［18］采用反相HPLC法對(duì)三黃瀉心湯中生物堿類、黃酮類、游離蒽醌類、結(jié)合蒽醌類等四大類成分共16個(gè)藥效組分進(jìn)行了含量測(cè)定，為中藥藥效組分質(zhì)量評(píng)價(jià)方法的建立提供了科學(xué)依據(jù)。

1.2.2 經(jīng)方定性分析 經(jīng)方化學(xué)成分復(fù)雜，其間往往存在著復(fù)雜的相互作用關(guān)系，這正是經(jīng)方發(fā)揮療效的基礎(chǔ)。通過對(duì)經(jīng)方復(fù)雜成分體系中主要成分的定性分析，對(duì)于進(jìn)一步揭示藥效物質(zhì)基礎(chǔ)有著重要的意義。HPLC法不僅在有效成分含量測(cè)定方面展現(xiàn)了較高分析能力，而且在化學(xué)成分定性分析中也占據(jù)重要的地位。HPLC法利用樣品和對(duì)照品比對(duì)的方法進(jìn)行定性分析，方法簡(jiǎn)單，但必須是已知物，而將HPLC與質(zhì)譜聯(lián)用可以克服定性分析時(shí)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品的依賴，可作為化學(xué)成分分析簡(jiǎn)便準(zhǔn)確可靠的方法。采用HPLC-MS可以在線獲取樣品中各化合物的多級(jí)質(zhì)譜，通過與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的多級(jí)質(zhì)譜圖進(jìn)行比較，或分析對(duì)照已知化合物的多級(jí)質(zhì)譜圖［19］，可迅速對(duì)經(jīng)方化學(xué)成分進(jìn)行快速分析鑒別。汪航等［20］采用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，分析鑒定出梔子大黃湯中的20個(gè)化合物，包括黃酮類、蒽醌類以及環(huán)烯醚萜類等。Qin等［21］采用 HPLC-ESI-MS分析方法對(duì)百合知母湯中的主要成分進(jìn)行了鑒定;在正、負(fù)離子模式下獲得化合物的分子量信息，通過比對(duì)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)及對(duì)照品質(zhì)譜裂解信息，鑒定出了38個(gè)化學(xué)成分，包括4個(gè)酚酸糖苷、3個(gè)黃酮和31個(gè)皂苷。

通過將經(jīng)方有效成分提取液質(zhì)譜圖與組成該方各單味藥提取液質(zhì)譜圖相對(duì)比，可對(duì)各成分的藥材來源進(jìn)行歸屬。Xu等［22］建立了HPLC-ESI/MS/MS分析了大承氣湯組分的分析方法，采用反相C18色譜柱，梯度洗脫，負(fù)離子掃描模式，共鑒定出30個(gè)化合物;通過與標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)，確定了14個(gè)化合物，包括2個(gè)單寧酸、3個(gè)蒽醌、2個(gè)番瀉苷、5個(gè)黃酮、2個(gè)木脂素;通過與大黃、枳實(shí)、厚樸等單味藥提取液的質(zhì)譜對(duì)比，發(fā)現(xiàn)單寧酸、蒽醌和番瀉苷來源于大黃，黃酮來源于枳實(shí)，木脂素來源于厚樸。王海燕等［23］采用HPLC-MS聯(lián)用技術(shù)對(duì)不同制法四逆湯中的化學(xué)成分進(jìn)行了定性鑒別，共定性出傳統(tǒng)水提液28個(gè)化學(xué)成分，其中14個(gè)化學(xué)成分來自黑附子，7個(gè)化學(xué)成分來自干姜，余下7個(gè)化學(xué)成分來自炙甘草;有效部位組合液中30個(gè)化學(xué)成分，其中14個(gè)化學(xué)成分來自黑附子，8個(gè)化學(xué)成分來自干姜，8個(gè)化學(xué)成分來自炙甘草。楊楠等［24］為確定芍藥散中鎮(zhèn)痛活性部位中2個(gè)新化合物的來源，采用HPLC-MS/MS技術(shù)，正離子掃描，檢測(cè)方式為一級(jí)質(zhì)譜掃描，子離子掃描和多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)，對(duì)該經(jīng)方的6個(gè)組分藥材分別進(jìn)行檢測(cè)，并以2個(gè)新化合物為對(duì)照品，最終確定二者均來源于白術(shù)。

1.3 HPLC及HPLC-MS聯(lián)用技術(shù)在經(jīng)方藥物代謝中的應(yīng)用 經(jīng)方是一個(gè)的復(fù)雜體系，其藥效作用并不簡(jiǎn)單的依賴于復(fù)方中已知化學(xué)成分產(chǎn)生，也可能來源于代謝產(chǎn)物。藥物代謝就是研究藥物進(jìn)入體內(nèi)后，在體液、酶等的作用下發(fā)生生化反應(yīng)的過程，其研究?jī)?nèi)容包括代謝物的分離、鑒定、代謝途徑的追蹤、體內(nèi)體外代謝的比較以及痕量分析測(cè)定［25］。經(jīng)方本身化學(xué)成分的復(fù)雜性以及經(jīng)方藥物代謝成分的未知性，對(duì)于探明復(fù)方中發(fā)揮療效的成分具有一定的挑戰(zhàn)性，但是現(xiàn)代分析技術(shù)和儀器的發(fā)展為經(jīng)方藥物代謝研究提供了有力武器。HPLC及HPLC-MS技術(shù)不僅可以定量分析中藥復(fù)方有效成分及代謝物在體內(nèi)的含量變化，而且可以定性分析代謝成分。

隨著藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究的不斷深入，探明經(jīng)方有效成分的血清藥物濃度與藥理作用之間的關(guān)系也逐漸成為必不可少的環(huán)節(jié)。HPLC可實(shí)現(xiàn)對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)血液中有效成分的含量測(cè)定，進(jìn)而獲得血藥濃度;再以血藥濃度為指標(biāo)，采用藥動(dòng)學(xué)軟件擬合血藥濃度-時(shí)間曲線，以此來反應(yīng)中藥復(fù)方的藥動(dòng)學(xué)規(guī)律。陳月鳳等［26］采用HPLC法建立了大鼠灌胃給予葛根芩連微丸后血漿中葛根素、黃芩苷和小檗堿的濃度變化并繪制出血藥濃度-時(shí)間曲線，為進(jìn)一步開展葛根芩連方制劑有效成分的血藥濃度與藥理作用提供參考依據(jù)。高宇勤等［27］采用HPLC技術(shù)測(cè)定當(dāng)歸四逆湯中肉桂酸和甘草酸在大鼠血清中的變化，并利用3P97軟件計(jì)算這2種化合物的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，發(fā)現(xiàn)肉桂酸和甘草酸吸收都比較快，但前者代謝較快，在體內(nèi)滯留時(shí)間短。該課題組又研究了當(dāng)歸四逆湯中阿魏酸在大鼠血清中的含量變化;采用HPLC方法，通過外標(biāo)法測(cè)定其血藥濃度，發(fā)現(xiàn)大鼠口服當(dāng)歸四逆湯后，阿魏酸吸收較快，但是消除慢［28］。

HPLC-MS具有速度快、選擇性強(qiáng)、檢測(cè)限低以及高定性能力等優(yōu)點(diǎn)，已然是經(jīng)方藥物代謝研究的理想工具。徐衛(wèi)東等［29］采用HPLC-MS/MS法，對(duì)大鼠灌胃給予四逆散后血清中有效成分進(jìn)行定性鑒別;結(jié)果共鑒定出芍藥苷、柚皮素、甘草苷、橙皮苷、橙皮素、甘草酸、柴胡皂苷d等7個(gè)原型成分，同時(shí)還檢測(cè)出甘草次酸、柚皮素葡萄糖醛酸、橙皮素葡萄糖醛酸等代謝產(chǎn)物。

總之，運(yùn)用現(xiàn)代分析技術(shù)開展經(jīng)方藥物研究，對(duì)于經(jīng)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的發(fā)現(xiàn)、揭示經(jīng)方配伍效應(yīng)、闡明經(jīng)方的作用機(jī)制，指導(dǎo)臨床規(guī)范化應(yīng)用具有重要的意義。HPLC法應(yīng)用于經(jīng)方化學(xué)成分的分離分析，既簡(jiǎn)便又準(zhǔn)確可靠，而且將HPLC的高分辨能力與質(zhì)譜的強(qiáng)定性能力相結(jié)合，可以獲得更多的化合物含量和結(jié)構(gòu)信息。HPLC-MS對(duì)難以辨別的痕量化合物依然擁有較高的定性定量分析能力，其在今后的經(jīng)方研究中的地位必將大大提升。

2 免疫共沉淀及激光共聚焦技術(shù)在經(jīng)方現(xiàn)代藥理學(xué)研究中的應(yīng)用

在經(jīng)方的藥理作用機(jī)制研究方面，常用的方法有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、放射免疫法等可用于檢測(cè)可溶性蛋白的濃度、western blot用于半定量檢測(cè)蛋白、PCR及熒光定量PCR檢測(cè)DNA及mRNA水平、免疫組化檢測(cè)蛋白在組織或細(xì)胞中的分布。以上方法分別在基因及蛋白表達(dá)水平檢測(cè)經(jīng)方對(duì)于信號(hào)通路關(guān)鍵分子及目的蛋白的影響以明確經(jīng)方的作用機(jī)制。然而，經(jīng)方的成分復(fù)雜，且基于中醫(yī)“整體觀”的理論基礎(chǔ)，其藥理作用機(jī)制有“多靶點(diǎn)”“整體調(diào)節(jié)”的特點(diǎn)。因此，其作用特點(diǎn)可能不僅局限于對(duì)某個(gè)、某幾個(gè)蛋白的影響，而體現(xiàn)在對(duì)蛋白與蛋白之間、蛋白與核酸之間作用的影響?；诖?，越來越多的中醫(yī)藥研究者開始重視免疫共沉淀技術(shù)在經(jīng)方藥理作用研究中的應(yīng)用。同時(shí)，大量研究表明，經(jīng)方的藥理作用可能表現(xiàn)在對(duì)關(guān)鍵分子的細(xì)胞內(nèi)定位、轉(zhuǎn)移的影響，因此，激光共聚焦技術(shù)也被廣泛地應(yīng)用于經(jīng)方的藥理機(jī)制研究中。筆者將結(jié)合課題組的研究，介紹免疫共沉淀及激光共聚焦技術(shù)在經(jīng)方現(xiàn)代藥理研究中的應(yīng)用。

2.1 免疫共沉淀技術(shù)在經(jīng)方藥理機(jī)制研究中的應(yīng)用 免疫共沉淀技術(shù)是一門以抗原和抗體特異性結(jié)合為基礎(chǔ)發(fā)展起來的研究目的蛋白和與其結(jié)合的大分子物質(zhì)相互作用的技術(shù)。該技術(shù)主要用于蛋白質(zhì)鑒定，還可應(yīng)用于RNA和DNA鑒定等。該技術(shù)主要研究的是自然狀態(tài)下的蛋白質(zhì)間相互作用，作用對(duì)象為天然蛋白，前提需要已知目的蛋白。主要操作步驟分為細(xì)胞裂解，標(biāo)簽蛋白與目的蛋白結(jié)合，形成蛋白質(zhì)復(fù)合體，清洗，洗脫，分離蛋白。

目前常用蛋白檢測(cè)技術(shù)如Western blotting、免疫組化技術(shù)，主要針對(duì)某種特定蛋白，分析目標(biāo)過于局限，脫離了整體環(huán)境，而免疫共沉淀則針對(duì)蛋白質(zhì)復(fù)合物，側(cè)重于大分子物質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用，不再局限于一個(gè)單獨(dú)的靶點(diǎn)，通過捕獲復(fù)合物分析蛋白質(zhì)調(diào)控的過程。目前主要應(yīng)用于腫瘤研究、酶與病毒研究、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究和寄生蟲研究等［30-31］。根據(jù)大分子物質(zhì)不同，分為:

1)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)復(fù)合物，這是最常見的免疫共沉淀，分離復(fù)合物后，聯(lián)合WB實(shí)驗(yàn)，對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行驗(yàn)證，如利用免疫共沉淀技術(shù)驗(yàn)證 SET與eEF1A1在人肝細(xì)胞內(nèi)的相互作用，推斷SET蛋白可能在三氯乙烯致癌的作用機(jī)制中起著重要作用［32］。

2)DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，又稱為染色質(zhì)免疫共沉淀，分離復(fù)合物得到的DNA序列分別通過PCR技術(shù)、測(cè)序分析和芯片技術(shù)等進(jìn)行序列分析，如通過免疫共沉淀驗(yàn)證細(xì)胞內(nèi)HIF-1與Id-1啟動(dòng)子的結(jié)合部位［33］。

3)RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，分離復(fù)合物后RNA序列驗(yàn)證方法同DNA類似，如免疫共沉淀與基因芯片技術(shù)聯(lián)合建立一種RNA 5’端帽子結(jié)構(gòu)的鑒定方法［34］。另一方面，免疫共沉淀技術(shù)不僅可以驗(yàn)證某種復(fù)合物的存在，還可以發(fā)現(xiàn)新的結(jié)合物質(zhì)或作用方式，如運(yùn)用免疫沉淀聯(lián)合質(zhì)譜篩選肝核因子HNF3β相互作用蛋白質(zhì)，尋找生理水平下新的蛋白復(fù)合體［35］。

中藥藥理學(xué)主要研究中藥作用于機(jī)體的機(jī)制和機(jī)體對(duì)于藥物的代謝。目前中藥復(fù)方(包括經(jīng)方)的作用機(jī)制成為中藥藥理學(xué)的研究熱點(diǎn)，而其在機(jī)體作用過程復(fù)雜，特點(diǎn)為多靶點(diǎn)、多成分、多途徑。如果僅僅運(yùn)用WB和免疫組化技術(shù)，已滿足不了中藥藥理機(jī)制的研究，免疫共沉淀技術(shù)如今已逐步運(yùn)用于中藥復(fù)方分子機(jī)制的研究，如研究調(diào)心方對(duì)動(dòng)物阿爾茨海默病相關(guān)tau蛋白磷酸化的調(diào)節(jié)及其可能的作用機(jī)制，利用免疫共沉淀驗(yàn)證早老蛋白-1與其靶點(diǎn)tau蛋白的結(jié)合，確定兩種蛋白的確相互作用［36］。同時(shí)，免疫共沉淀與芯片技術(shù)聯(lián)合，作為一種高通量研究技術(shù)，恰恰為經(jīng)方復(fù)方分子機(jī)制研究提供了可行的方法。

當(dāng)然，免疫共沉淀技術(shù)仍有其局限性，一方面檢測(cè)的是蛋白質(zhì)粗體物，驗(yàn)證兩種蛋白質(zhì)之間的相互作用不能確定為直接作用，另一方面，實(shí)驗(yàn)具有一定的冒險(xiǎn)性，用于免疫共沉淀的抗體選擇要慎重，以免出現(xiàn)假陽性，或無反應(yīng)。

2.2 激光共聚焦技術(shù)在經(jīng)方藥理機(jī)制研究中的應(yīng)用 激光共聚焦技術(shù)是利用激光束透過照明針孔形成點(diǎn)光源對(duì)標(biāo)本焦平面上的每一點(diǎn)進(jìn)行掃描，被照射點(diǎn)在探測(cè)針孔出成像，通過光電倍增管或冷電耦器件接收，迅速在電腦屏幕上成像。由于照明針孔和探測(cè)針孔對(duì)于被照射點(diǎn)是共軛的，焦平面上的點(diǎn)可以同時(shí)在照明針孔和探測(cè)針孔處成像，焦平面以外的點(diǎn)不會(huì)成像。該技術(shù)克服了普通光學(xué)顯微鏡檢測(cè)時(shí)被檢測(cè)點(diǎn)收到附近相鄰點(diǎn)的干擾的缺點(diǎn)，可以形成清楚地光學(xué)橫斷面，圖像準(zhǔn)確清晰，能進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，同時(shí)結(jié)合Z軸掃描還能做出三維成像。

激光共聚焦常常用于蛋白質(zhì)檢測(cè)，為了提高分辨率和獲得高對(duì)比度圖像，一般需先使用帶有特殊熒光標(biāo)記的抗體孵育染色，再?zèng)_洗后進(jìn)行激光共聚焦檢測(cè)。如有需要，可以進(jìn)行活體染色，還可同時(shí)直接進(jìn)行兩色，甚至三色染色，當(dāng)然，多色染色時(shí)需注意選取熒光波長(zhǎng)差別較大的染料。筆者的課題中，曾對(duì)細(xì)胞中F-actin、細(xì)胞膜和ERM蛋白同時(shí)進(jìn)行染色，從而分析經(jīng)方對(duì)病毒感染的細(xì)胞中F-actin與ERM蛋白在細(xì)胞中分布的影響［37］。而免疫組化法無法觀察正常生理狀態(tài)下的組織形態(tài)，且進(jìn)行復(fù)染時(shí)常常會(huì)引起顏色覆蓋，或顏色交叉后變色等問題。另一方面，共聚焦技術(shù)不僅可以對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定位監(jiān)測(cè)，如分析目標(biāo)蛋白在細(xì)胞或組織中的分布，通過檢測(cè)角蛋白和波形蛋白的表達(dá)可以進(jìn)行滋養(yǎng)細(xì)胞的鑒定［38］，還可借助圖片分析軟件選取顯色部位面積求和，或統(tǒng)計(jì)熒光強(qiáng)度，進(jìn)行定量檢測(cè)，同時(shí)兼顧了免疫組化與WB實(shí)驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn);不僅可以應(yīng)用于體內(nèi)試驗(yàn)，對(duì)組織進(jìn)行染色，還可應(yīng)用于體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行細(xì)胞染色。激光共聚焦技術(shù)不僅可以檢測(cè)蛋白質(zhì)，還可實(shí)時(shí)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+、pH值及其他細(xì)胞內(nèi)離子［39］。張麗萍等研究加味溫膽湯對(duì)抑郁型大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響，采用激光共聚焦技術(shù)檢測(cè)Ca2+濃度變化情況，發(fā)現(xiàn)加味溫膽湯可能通過抑制海馬神經(jīng)細(xì)胞鈣離子大量?jī)?nèi)流，發(fā)揮其抗抑郁效應(yīng)［40］。

激光共聚焦目前已應(yīng)用于中藥組織化學(xué)研究，如對(duì)白芷根中香豆素類成分的定位和定量研究［41］，還應(yīng)用于中藥藥效學(xué)和藥理學(xué)研究，如用于中藥與天然藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的研究，觀察細(xì)胞核變化與凋亡小體、觀察線粒體膜電位變化、觀測(cè)活性氧自由基含量等，或?qū)咕兴幊煞诌M(jìn)行機(jī)制研究［42］。其應(yīng)用前景并不僅僅局限于上述方向，利用其實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)功能，可以將其運(yùn)用于藥物代謝動(dòng)力學(xué)，或者用于分析藥物結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。

3 討論

綜上所述，免疫共沉淀技術(shù)可用于研究經(jīng)方對(duì)蛋白之間相互作用的影響，激光共聚焦技術(shù)可觀察經(jīng)方不同蛋白、離子的分布、轉(zhuǎn)位及含量的影響，結(jié)合常規(guī)核酸、蛋白定量技術(shù)以及免疫共沉淀、激光共聚焦可較為全面地分析經(jīng)方對(duì)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)途徑的影響，從而分析經(jīng)方藥理作用的分子機(jī)制;HPLC及HPLC-MS是目前最常用的藥理成分分析及質(zhì)量控制的技術(shù)，同樣適用于經(jīng)方成分的鑒定及分析，在經(jīng)方藥理機(jī)制研究基礎(chǔ)上結(jié)合經(jīng)方主要活性成分的分析，可使經(jīng)方的臨床應(yīng)用得到國(guó)內(nèi)外同行的認(rèn)可，有利于經(jīng)方的推廣和應(yīng)用。

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