楊智，陳洪濤，吳詩品

肝細胞癌患者外周血單個核細胞Foxp3 mRNA水平變化*

楊智，陳洪濤，吳詩品

作者單位：518020廣東省深圳市暨南大學第二臨床醫(yī)學院深圳市人民醫(yī)院感染內科

第一作者：楊智，女，36歲，碩士研究生，主治醫(yī)師。主要從事感染性疾病臨床與基礎研究。E-mail:ccyangzhi@sina.com

【摘要】目的檢測初發(fā)現(xiàn)未治療肝細胞癌（HCC）患者外周血單個核細胞（PBMCs）中Foxp3 mRNA水平變化及其與血清AFP水平的關系。方法在HCC患者60例和健康人20例，采用RT-PCR法檢測PBMCs中Foxp3 mRNA水平，常規(guī)檢測血清AFP水平。結果HCC患者和健康對照組外周血Foxp3 mRNA水平分別為（0.976± 0.073）和（0.772±0.083），差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；經Pearson相關性分析顯示，HCC患者外周血Foxp3 mRNA水平與AFP水平呈正相關（r＝0.226，P＝0.025）。結論HCC患者PBMCs中Foxp3水平明顯升高，對腫瘤的發(fā)生發(fā)展可能具有一定的預測作用。

【關鍵詞】肝細胞癌；Foxp3；外周血單個核細胞；甲胎蛋白

在常見的惡性腫瘤中原發(fā)性肝癌全球排名第五,在常見死亡原因中排名第三[1]，每年大于60萬患者死于該病[2]。中國是肝癌的高發(fā)國家，在實體腫瘤中死亡率排第二位[3]。因其具有惡性度高、生長快、易復發(fā)和易出現(xiàn)遠處轉移等特點，早診斷早治療對患者預后的影響極大。因此，機體內早期出現(xiàn)并具有高度特異性的血清學指標對發(fā)生肝癌的預測并早期診斷尤為重要，且能作為監(jiān)測腫瘤復發(fā)的手段。目前，針對肝癌的血清學診斷應用最廣泛的腫瘤標志物有甲胎蛋白（AFP）和甲胎蛋白異質體（Lectinreactive alpha-fetoprotein，AFP-L3）等。AFP的合成部位主要是在嚙齒動物及人類胚胎的肝臟，但也可在卵黃囊及胃腸道。因此，生殖系統(tǒng)腫瘤及大量非癌癥肝病患者均可有AFP的升高，說明AFP的升高并非肝癌所特有，其診斷肝癌患者的陽性率僅為70%。鑒于AFP的這一非特異性表現(xiàn)，使其檢測對肝癌患者的早期診斷及術后復發(fā)的早發(fā)現(xiàn)存在不確定性。最近有報道指出，肝癌患者居高不下的術后復發(fā)率是導致患者難以長期生存的重要原因[4，5]。因此，我們急于尋找其它能早期提示肝癌發(fā)生的標志物，以協(xié)同AFP檢測，提高肝癌的早期診斷率。腫瘤形成的基礎與機體免疫內環(huán)境的改變和腫瘤細胞免疫逃逸能力增強有關。當機體免疫力減弱，少量的腫瘤細胞轉化后不能被有效地免疫殺傷，機體就可能會發(fā)生腫瘤。腫瘤患者免疫防御損傷及免疫功能在疾病的早期已經開始發(fā)生變化，如能對腫瘤形成過程中有重要免疫調節(jié)作用的標志物進行檢測，可比AFP更早預測肝癌的發(fā)生。CD4+CD25+調節(jié)性T細胞（Regulatory T cells，Tregs）為1995年Sakaguchi et al[6]首次報道的T細胞亞群,以表達CD4+和CD25+為表現(xiàn)型，能抑制CD4+、CD8+T細胞的效應功能，在維持免疫耐受中有重要作用。通過不同機理，Treg細胞可以抑制一系列免疫反應，最后可以促使腫瘤細胞免疫耐受、逃逸機體免疫系統(tǒng)的打擊。目前，國內外多項研究表明在肝細胞癌（HCC）患者外周血和腫瘤局部Treg細胞比例增加[7]，對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展起著重要而不可忽視的免疫病理作用。Zhao HQ et al[8]對進展期HCC患者Tregs細胞的作用進行了Metal分析，這一研究篩選了23篇文獻，其中包括1279例HCC患者和547名健康人，結論顯示，Tregs參與HCC的發(fā)生，外周血循環(huán)和HCC組織中Tregs細胞均比健康對照組明顯升高，且與腫瘤大小及AFP水平呈正相關。另有研究亦發(fā)現(xiàn)Treg細胞的多少與血清AFP水平呈正相關，提示Treg細胞聯(lián)合AFP檢測有可能成為肝癌術后隨訪的特異性指標，對預測肝癌復發(fā)及預后有參考價值[9]。而Foxp3只特異性地表達于CD4+CD25+Tregs細胞,是控制其發(fā)育及功能的關鍵基因。因此，可以將Foxp3作為鑒定CD4+CD25+Tregs細胞的一個特異性標志物[10，11]。CD4+CD25+Tregs細胞亦高表達抑制性分子CTLA4和PD-L1，以及抑制性細胞因子IL-10 和TGF-β，其部分免疫抑制功能是通過這些分子發(fā)揮作用的，并且轉導Foxp3能使它們呈現(xiàn)高表達[12]。本研究通過對初發(fā)未治療HCC患者外周血單個核細胞（PBMCs）中Foxp3和血清AFP水平的檢測，分析HCC患者與健康人Foxp3水平的差異，并分析其與血清AFP水平的相關性，以評估其對HCC發(fā)生的早期預測價值。

1　資料與方法

1.1臨床資料收集60例原發(fā)性肝癌患者，均為初發(fā)未診治患者，來源于2013年1月至2014年10月我科住院患者，男52例，女8例；平均年齡47（27～78）歲。診斷符合2001年中國抗癌協(xié)會肝癌專業(yè)委員會修訂的肝癌臨床診斷標準：1.AFP≥400μg/L，影像學檢查有肝癌特征的占位性病變者，排除妊娠、生殖系胚胎源性腫瘤、活動性肝病及轉移性肝癌；2.AFP＜400μg/L，排除妊娠、生殖系胚胎源性腫瘤、活動性肝病及轉移性肝癌，并有兩種影像學檢查符合肝癌特征的占位性病變或有兩種肝癌標志物（DCP、GGTⅡ、AFU和CA19-9等）陽性及一種影像學檢查有肝癌特征的占位性病變者；3.有肝癌的臨床表現(xiàn)并有肯定的肝外轉移病灶，排除轉移性肝癌者。所有肝癌患者均為乙型肝炎病毒表面抗原陽性，抗HCV陰性，排除患有肝外原發(fā)腫瘤者。同時選擇健康人20例作為對照，男14例，女6例；平均年齡45（20～75）歲。

1.2血清AFP和HBV DNA檢測采用ELISA法,試劑來源于羅氏公司；采用PCR法檢測HBV DNA（湖南圣湘生物科技有限公司）。

1.3影像學檢查常規(guī)進行CT（256排，西門子公司）或MRI（3.0 T,西門子公司）。

1.4 PBMCs Foxp3檢測淋巴細胞分離液購于天津市GBD公司；RT試劑盒、PCR試劑盒、DNA Marker均購于美國Fermetas公司；引物由天津金斯瑞公司合成；PCR儀由德國EPPENDORF公司提供；電泳儀、凝膠成像分析系統(tǒng)由美國BIORAD公司提供。抽取外周靜脈血3～4 ml，用密度梯度離心法分離PBMCs，提取總RNA，-20℃保存。根據(jù)GeneBank檢索的基因序列，利用Premier 5軟件分別設計FOXP3和β-actin引物（內部參照系統(tǒng)），見表1。以提取的總RNA 5μL為模板，合成cDNA，以cDNA為模板擴增Foxp3基因片段。采用同管擴增法，反應步驟：每管先加入目的基因上下游引物各1μL，加入內參β-actin上下游引物各0.1μmol（1μl），反應體系為30μl，進行30個循環(huán)，PCR反應條件為：94℃，2 min（啟動）；94℃，30 sec（變性）；57℃，30 sec（退火）；72℃，45 sec（延伸）；再從變性開始循環(huán)共30次。72℃，最后，延伸5 min。PCR產物在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，在凝膠成像系統(tǒng)中拍照分析。

1.5統(tǒng)計學分析應用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析。計量資料以（x±s）表示，兩組間均數(shù)的比較采用兩樣本t檢驗。檢測水準為α=0.05，采用雙側檢驗。

2　結果

2.1 HCC患者和健康對照人群PBMCs Foxp3 mRNA水平情況HCC患者和健康人PBMCs FoxP3水平分別為（0.976±0.073）和（0.772±0.083），差異顯著（因方差不齊，采用One-Way ANOVA Welch法校正，F(xiàn)＝37.749，P<0.001，圖1、圖2）。

2.2 HCC患者PBMCs Foxp3 mRNA水平與血清AFP水平的相關性分析經Pearson相關性分析發(fā)現(xiàn)，HCC患者FOXP3 mRNA水平與AFP水平呈顯著正相關（r＝0.226，P＝0.025，圖3）。

3　討論

Trges在腫瘤的免疫耐受及免疫應答受抑制方面起著關鍵的作用[13，14]。Tregs細胞介導的潛在的抑制作用阻止了有效的免疫應答，而這些免疫應答對腫瘤的清除及炎癥的控制是很關鍵的[15]。而且，Tregs細胞的消除或功能的抑制能增強抗腫瘤應答[16～19]。越來越多的證據(jù)表明Tregs細胞的增加與惡性腫瘤患者病情進展相關[20～23]。目前，研究表明腫瘤患者外周血循環(huán)中Tregs細胞計數(shù)增加[24～26]。在胃癌、肺癌、胰腺癌和乳腺癌患者外周血均檢測出Tregs細胞數(shù)增加[27]。動物實驗中亦有相應的發(fā)現(xiàn)。有研究顯示在患惡性腫瘤的大鼠，隨著Tregs細胞的減少，其抗腫瘤免疫隨之增強[16]。另有動物實驗研究證實，過繼輸入CD4+CD25+Treg細胞能防止或治療小鼠自身免疫性疾病，延長移植物的存活，而CD4+CD25+Tregs細胞的缺失能誘導自身免疫性疾病，增強抗腫瘤免疫[28]。基于小鼠實驗模型的研究揭示清除Treg細胞后，CD4+T細胞和CD8+T細胞介導的抗腫瘤免疫應答明顯增強；清除Treg細胞和CD8+T細胞后，CD4+T細胞也能通過IFN-γ依賴機制排斥腫瘤細胞，恢復Treg細胞后，抗腫瘤免疫應答立即被抑制[29]。這些足以說明Treg細胞和腫瘤的發(fā)生有直接的關系。Treg可能通過抑制腫瘤抗原的表達或淋巴細胞對腫瘤抗原的免疫應答，導致腫瘤的免疫耐受[29]。

近年，國內外報道Treg細胞對肝癌患者的疾病進展也起到了至關重要的作用[30]，可能因為調節(jié)性T細胞可以抑制肝癌患者外周血和肝臟CD4+和CD8+T細胞免疫反應，從而可能促進了腫瘤的進展。有相關研究報道Treg細胞可以抑制CD8+T細胞的增殖以及細胞因子的分泌和穿孔素表達，從而抑制效應細胞對腫瘤的殺傷作用。Ormandy et al研究發(fā)現(xiàn)HCC患者外周血Tregs細胞明顯增加。有學者對肝癌患者進行臨床多因素研究發(fā)現(xiàn)調節(jié)性T細胞比例增高是肝癌患者預后差的獨立危險因素。Gao et al研究表明HCC組織Tregs細胞數(shù)量與腫瘤大小及血管侵潤相關。Yang J et al研究發(fā)現(xiàn)不僅外周血及肝癌組織中Foxp3 Tregs細胞明顯增加，而且Tregs細胞的數(shù)量與血清AFP水平呈正相關。Sasaki et al研究亦發(fā)現(xiàn)Tregs與AFP間存在相關性。

Tregs細胞是CD4+T細胞的一個獨特細胞群，而Foxp3是它的關鍵轉錄因子。Treg細胞常用的分子標記有CD4+CD25+Tregs、Foxp3、CD127等。Foxp3被稱為叉狀頭（或）翅膀狀螺旋轉錄因子，在T細胞上特異性表達，并且是Treg細胞發(fā)育和功能所必需的，可反映Treg的水平和功能活性，目前被作為證實Treg細胞存在的金標準。通過對小鼠腫瘤模型的研究證實，腫瘤部位大量Treg細胞積聚的一個重要機制就是CD4+CD25-Treg向CD25+細胞的轉變，并且轉化后的細胞表達FoxP3，從而具有抑制活性。因此，通過檢測PBMCs中Foxp3 mRNA水平能較好地反映Tregs細胞的水平，且方法學上更簡單易行。我們設計這項實驗的目的是檢測HCC初發(fā)現(xiàn)未治療患者PBMCs中Foxp3 mRNA水平，同時檢測患者血清AFP水平，最后對兩組數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，以期發(fā)現(xiàn)它們之間的相關性。本研究發(fā)現(xiàn)，HCC患者FoxP3水平明顯高于健康對照組，它們之間有顯著統(tǒng)計學差異。同時發(fā)現(xiàn)，HCC患者Foxp3 mRNA水平與AFP水平呈顯著正相關，推測檢測患者外周血單個核細胞Foxp3 mRNA水平對腫瘤的發(fā)生具有一定的預測作用，但Foxp3 mRNA水平升高需持續(xù)多長時間，且需達到什么水平才能對HCC發(fā)生具預測作用，尚需更大規(guī)模的臨床試驗來進一步證實。

【參考文獻】

[1]Llovet JM，Burroughs A，Bruix J. Hepatocellular carcinoma. Lancet，2003，362:1907-1917.

[2]Forner A，Llovet JM，Bruix J. Hepatocellular carcinoma.Lancet，2012，379:1245-1255.

[3]Jemal A，Murray T，Ward E，et al. Cancer statistics，2005. CA Cancer J Clin，2005，55:10-30.

[4]Budhu A，F(xiàn)orgues M，Ye QH，et al. Prediction of venous metastases，recurrence，and prognosis in hepatocellular carcinoma based on a unique immune response signature on the liver micro-environment. Cancer Cell，2006，10:99.

[5]Kaibori M，Kubo S，Nagano H，et al. Clinicopathological features of recurrence in patients after 10-year disease-free survival following curative hepatic resection of hepatocellular carcinoma. World J Surg，2013，37（4）:820.

[6]Sakaguchi S，Sakaguchi N，Asano M，et al. Immunologic selftolerance maintained by activated T cells expressing IL -2 receptor alpha -chains（CD25）. Breakdown of a single mechanism of self -tolerance causes various autoimmune diseases. J Immunol，1995，155:1151-1164.

[7]Pedroza-Gonzalez A，Verhoef C，Ijzermans JN，et al. Activated tumor -infiltrating CD+regulatory T cells restrain antitumor immunity in patients with primary or metastatic liver cancer. Hepatology，2013，57（1）:183.

[8]李巍，葉研碩，劉宏宇，等.調節(jié)性T細胞在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用及機理.中國實驗診斷學，2013，17（12）:312-314.

[9]Zhao HQ，Li WM，Lu ZQ，et al. Roles of Tregs in development of hepatocellular carcinoma:A meta -analysis. World J Gastroenterol，2014，20（24）:7971-7978.

[10]Yagi H，Nomura T，Nakamura K，et al. Crucial role of FOXP3 in the development and function of human CD+25CD+4 regulatory T cells. Int Immunol，2004，16（11）:1643-1656.

[11]Shevach EM. Certified professionals:CD4（+）CD25（+）suppressor T cells. J Exp Med，2001，193（11）:41-46.

[12]Fontenot JD，Gavin MA，Rudensky AY.Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+regulatory T cells. Nat Immunol，2003，4:330.

[13]Sakaguchi S，Sakaguchi N，Shimizu J，et al. Immunologic tolerance maintained by CD25+CD4+regulatory T cells:their common role in controlling autoimmunity，tumor immunity，and transplantation tolerance. Immunol Rev，2001，182:18-32.

[14]Nishikawa H，Sakaguchi S. Regulatory T cells in tumor immunity. Int J Cancer，2010，127:759-767.

[15]Fu J，Xu D，Liu Z，et al. Increased regulatory T cells correlate with CD8 T-cell impairment and poor survival in hepatocellular carcinoma patients. Gastroenterology，2007，132:2328-2339.

[16]Hori S，Nomura T，Sakaguchi TJ. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science，2003，299:1057-1061.

[17]Levy MY，Sidana A，Chowdhury WH，et al. Cyclophosphamide unmasks an anti-metastatic effect of local tumor cryoablation. J Pharmacol Exp Ther，2009，330:596-601.

[18]Yamaguchi T，Sakaguchi S. Regulatory T cells in immune surveillance and treatment of cancer. Semin Cancer Biol，2006，16:115-23.

[19]Khazaie K，von Boehmer H. The impact of CD4+CD25+Treg on tumor specific CD8+T cell cytotoxicity and cancer. Semin Cancer Biol，2006，16:124-36.

[20]Curiel TJ，Coukos G，Zou L，et al. Specific recruitment of regulatory T cells in ovarian carcinoma fosters immune privilege and predicts reduced survival. Nat Med，2004，10:942-949.

[21]Sasada T，Kimura M，Yoshida Y，et al. CD4+CD25+regulatory T cells in patients with gastrointestinal malignancies:possible involvement of regulatory T cells in disease progression. Cancer，2003，98:1089-1099.

[22]Ormandy LA，Hillemann T，Wedemeyer H，et al. Increased populations of regulatory T cells in peripheral blood of patients with hepatocellular carcinoma. Cancer Res，2005，65:2457-2464.

[23]Stoop JN，van der Molen RG，Baan CC，et al. Regulatory T cells contribute to the impaired immune response in patients with chronic hepatitis B virus infection. Hepatology，2005，41:771-778.

[24]Wolf AM，Wolf D，Steurer M，et al. Increase of regulatory T cells in the peripheral blood of cancer patients. Clin Cancer Res，2003，9:606-612.

[25]Miller AM，Lundberg K，Ozenci V，et al. CD4+CD25high T cells are enriched in the tumor and peripheral blood of prostate cancer patients. J Immunol，2006，177:7398-7405.

[26]Frey DM，Droeser RA，Viehl CT，et al. High frequency of tumor-infiltrating FOXP3（+）regulatory T cells predicts improved survival in mismatch repair -proficient colorectal cancer patients. Int J Cancer，2010，126:2635-2643.

[27]Baecher-Allan C，Anderson DE. Regulatory cells and human cancer. Semin Cancer Biol，2006，16:98-105.

[28]Lee MK，Moore DJ，Jarrett BP，et al. Promotion of allograft survival by CD4+CD25+regulatory T cells:Evidence for in vivo inhibition of effector cell proliferation. J Immunol，2004，172:6539.

[29]Casares N，Arribillaga L，Sarobe P，et al. CD+/CD25+regulatory cells inhibit activation of tumor-primed CD4+T cells with IFN-gamma-dependent anti- angiogenic activity，as well as longlasting tumor immunity elicited by peptide vaccination.J Immunol，2003，171:5931.

[30]Unitt E，Rushbrook SM，Marshal LA，et al. Compromised lymphocytes infiltrate hepatocellular carcinoma:the role of T-regulatory cells. Hepatology，2005，41:722-730.

（收稿：2015-02-28）

（本文編輯：陳從新）

·原發(fā)性肝癌·

Foxp3 mRNA in peripheral blood mononuclear cells in patients with hepatocellular carcinoma

Yang

Zhi，Chen Hongtao，Wu Shipin. Department of Infectious Disease，People's Hospital，Second Clinical Medical College Affiliated to Jinan University，Shenzhen 518020，Guangdong Province，China

【Abstract】Objective To investigate Foxp3 mRNA levels in peripheral blood mononuclear cells（PBMCs）in patients with hepatocellular carcinoma（HCC）and explore its relationship with serum AFP levels. Methods 60 patients with HCC and 20 healthy persons were enrolled in this study. The Foxp3 mRNA in PBMCs was measured by RT-PCR and serum AFP was detected at the same time. Results There existed statistically significant difference in Foxp3 levels between patients with HCC and controls [（0.976±0.073）vs.（0.772±0.083），P<0.01]；Pearson correlation analysis showed positive correlation between Foxp3 levels in PBMCs and serum AFP levels in HCC patients（r＝0.226，P＝0.025）. Conclusion The Foxp3 levels in PBMCs in patients with HCC increase，which might help predict HCC development.

【Key words】Hepatocellular carcinoma；Foxp3；Peripheral blood mononuclear cells；Alpha fetal protein

DOI：10.3969/j.issn.1672-5069.2015.04.016

通訊作者：吳詩品，E-mail:wupoem@126.com

*基金項目：廣東省科技廳青年自然科學基金資助項目（編號：D2011283）