武愛華， 張 霄， 劉 媛， 趙 揚(yáng)， 趙巖巖， 張存政， 謝雅晶， 劉賢金

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品質(zhì)量安全與檢測研究所/農(nóng)業(yè)部食品質(zhì)量安全監(jiān)控重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京210014; 2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，江蘇 南京210095)

蘇云金芽胞桿菌( Bacillus thuringiensis，Bt) 是一種革蘭氏陽性( G+) 細(xì)菌，是目前產(chǎn)量最大、使用最廣的生物殺蟲劑［1］。近年來，隨著轉(zhuǎn)Bt 作物在全球大規(guī)模商品化種植，使得其存在潛在的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。目標(biāo)害蟲對藥物產(chǎn)生耐受性，殺蟲基因逃逸污染環(huán)境，生物多樣性下降以及對非目標(biāo)生物的間接危害風(fēng)險(xiǎn)和破壞生態(tài)平衡等［2-6］。因此建立適當(dāng)?shù)臋z測方法對于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品成分快速鑒定與檢測，促進(jìn)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品安全管理、市場監(jiān)管和風(fēng)險(xiǎn)評估具有重要的研究意義。

近年來，隨著基因工程抗體及噬菌體展示技術(shù)的興起，利用噬菌體展示技術(shù)篩選并建立針對Bt 毒素免疫檢測方法已有很多報(bào)道。張霄、王耘等利用人源化噬菌體單鏈抗體庫篩選獲得針對Bt 毒蛋白的單鏈抗體( scFv) ，進(jìn)而建立免疫學(xué)分析方法［7-8］，但是噬菌體抗體庫抗體多數(shù)是Fab 片段或scFv 抗體，對抗體的親和力有一定的影響。隨著噬菌體展示肽庫技術(shù)的不斷改進(jìn)和完善，其在生命科學(xué)的眾多領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，在免疫分析中的應(yīng)用主要表現(xiàn)在模擬表位篩選、抗免疫復(fù)合體篩選及基于噬菌體展示多肽的特點(diǎn)建立的新免疫分析方法［9］。Renrong Liu 等從七肽庫中篩選與OTA( 赭曲霉毒素A) 相競爭的多肽，建立競爭ELISA( Enzyme-linked immunosorbent assay) 方法檢測谷物中的OTA，并與傳統(tǒng)檢測方法相比較，結(jié)果顯示檢出數(shù)值差異不顯著，且與其類似物之間的交叉反應(yīng)率低于0.01%，說明肽庫篩選特異性好，且親和性高［10］。在Bt 蛋白方面，已有李利紅等從七肽庫中篩選與Bt 蛋白結(jié)合的多肽，運(yùn)用于轉(zhuǎn)基因植物中Bt 蛋白的輔助檢測［11］。

目前已發(fā)現(xiàn)的cry2 類基因有52 個(gè)，其編碼的蛋白大小約為70 000［12］，其中以cry2Aa 的應(yīng)用和研究較多［13-17］。本研究擬通過噬菌體肽庫固相篩選，獲得特異性結(jié)合Cry2Aa 的十二肽，建立新的檢測方法，應(yīng)用于抗蟲轉(zhuǎn)基因植物中Bt 蛋白的檢測領(lǐng)域。

1 材料與方法

1.1 材料

Cry2Aa 毒素蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，購于上海佑隆生物科技有限公司;噬菌體隨機(jī)十二肽庫( Ph.D.-12 library，庫容1.9×109) 、受體菌Escherichia coli ER 2738 以及-96 gⅢ測序引物: 5'-HOCCCTCATAGTTAGCGTAACG-3'，購于New England Biolabs;HRP-抗M13 單克隆抗體購于Pharmacia 公司; 牛血清白蛋白( BSA) 、四環(huán)素( Tetracycline) 、異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷( IPTG) 及Xgal 購于SIGMA 公司; Cry2Aa 多抗( PAb-Cry2Aa) 為免疫新西蘭純種雄性大白兔獲得。

1.2 以Cry2Aa 篩選噬菌體十二肽庫

1.2.1 固相親和篩選策略 ①用包被液( pH =8. 6，0. 1 mol/L的NaHCO3) 稀釋Cry2Aa 毒素蛋白至濃度100 μg/ml，取1 ml 包被6 孔無菌酶聯(lián)免疫板，用封口膜封口，4 ℃，20 r/min震蕩過夜進(jìn)行包被; ②次日棄去包被液，加入4 ml 封閉液( 0. 1 mol/L 的NaHCO3，5 mg/ml BSA，0. 02%NaN3) 4 ℃靜置2 h; ③棄去封閉液，TBST( pH =7. 5，50 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，0. 1% Tween-20) 快速洗滌6 次，取10 μl 原始庫溶液( 含4 ×1011噬菌體) 用1 ml TBST 稀釋，加入免疫孔中，25 ℃，50 r/min搖動(dòng)1 h; ④移去肽庫溶液，TBST 洗滌免疫孔10 次，加入500 μl Cry2Aa( 100 μg/ml) 競爭洗脫，25 ℃，50 r/min搖動(dòng)1 h，把洗脫液移至1. 5 ml 離心管內(nèi)，共進(jìn)行4輪親和篩選，競爭洗脫。

第2 ～4 輪的篩選維持原Cry2Aa 的包被濃度，加入負(fù)篩選( 包被BSA 100 μg/ml，封閉5 mg/ml BSA，先將肽庫加入到此孔中，25 ℃，50 r/min 搖動(dòng)1 h) ，之后將肽庫轉(zhuǎn)移至包被有Cry2Aa 的正篩選孔中，增加Tween-20 濃度至0. 5%，第2 ～4 輪洗滌次數(shù)逐級遞加，分別為10次、20 次和30 次，依然加入500 μl Cry2Aa( 100 μg/ml) 競爭洗脫1 h。

1.2.2 洗脫噬菌體擴(kuò)增 將洗脫液加入到20 ml 對數(shù)前期的E. coli ER 2738 菌液中，37 ℃，250 r/min培養(yǎng)4. 5 h，特異性結(jié)合的噬菌體克隆得到擴(kuò)增，4 ℃12000 r/min離心15 min，將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中，用1/6 體積的PEG/NaCl( 20% PEG8000，2. 5 mol/L NaCl) 沉 淀 噬 菌 體，4 ℃過夜。次日，12 000 r/min4 ℃離心25 min，棄上清液，用1 ml TBS 重懸沉淀，再用1/6 體積的PEG/NaCl 沉淀噬菌體，4 ℃靜置1 h，14 000 r/min離心10 min，棄上清液，沉淀用200 μl TBS重懸，4 ℃14 000 r/min離心1 min，上清液即為擴(kuò)增后的噬菌體。

1.2. 3 噬菌體滴度測定 以1∶ 100 接種E. coli ER 2738 于LB-Tet 液體培養(yǎng)基中，37 ℃，250 r/min擴(kuò)增4. 5 h 至對數(shù)中期( OD600=0. 5) 。分別加200 μl 對數(shù)中期的菌液至10 個(gè)EP 管中，將各輪投入和產(chǎn)出的噬菌體用LB 培養(yǎng)液10 倍系列稀釋，每個(gè)稀釋度各取10 μl 分別加入到盛有菌液的EP 中，快速震蕩，室溫孵育5 min。將感染的菌液與3 ml 45 ℃預(yù)溫的頂層培養(yǎng)基快速混勻，快速倒入37 ℃預(yù)溫的LB/IPTG/Xgal/Tet培養(yǎng)板上，適當(dāng)傾斜培養(yǎng)板將頂層瓊脂均勻攤開。冷卻5 min 后，將培養(yǎng)板倒置放于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱避光過夜培養(yǎng)。次日觀察培養(yǎng)板，選擇藍(lán)斑數(shù)少于100 的培養(yǎng)板計(jì)數(shù)，藍(lán)斑數(shù)乘以稀釋倍數(shù)即為噬菌體滴度( pfu/ml) 。

1.3 噬菌體克隆的鑒定

1.3. 1 單克隆ELISA 4 μg/ml Cry2Aa 包被96 孔板，每孔100 μl，4 ℃過夜包被。棄去包被液，每 孔 加 200 μl 封 閉 液( 0. 1 mol/L 的NaHCO3，5 mg/ml BSA，0. 02% NaN3) ，4 ℃封閉2 h。棄去封閉液，TBST 洗板6 次，每孔加入100 μl 噬 菌 體 懸 液( 含1 × 1012個(gè) 噬 菌 體) ，室溫結(jié)合2 h。棄去一抗，TBST 洗板6 次。每孔加入100 μl 酶標(biāo)抗-M13 單抗( 1∶ 5 000) ，室溫結(jié)合1 h。TBST 洗板6 次，每孔加入100 μl ABTS 顯色液，室溫15 min，測OD450。陰性對照組采用4 μg/ml BSA 包被96 孔板，每孔100 μl，每個(gè)克隆重復(fù)3 次。

1.3.2 DNA 序列測定 擴(kuò)增以上陽性噬菌體克隆，用PEG/NaCl 沉淀噬菌體，碘化鈉溶解抽提噬菌體單鏈DNA，瓊脂糖電泳鑒定，送Sangon 公司進(jìn)行測序。

1.3.3 PAb-Cry2Aa 競爭抑制試驗(yàn) 4 μg/ml Cry2Aa包被96 孔板，每孔100 μl，4 ℃過夜包被。次日棄去包被液，每孔加200 μl 封閉液(0.1 mol/L的NaHCO3，5 mg/ml BSA，0.02% NaN3) ，4 ℃封閉2 h。棄去封閉液，TBST 洗板6 次，將培養(yǎng)好的50 μl GT 噬菌體上清液預(yù)先與50 μl 不同濃度( 用TBST 配制濃度為2.5 mg/ml的PAb-Cry2Aa，并進(jìn)行5 倍系列梯度稀釋至0.000 16 mg/ml，共設(shè)7 個(gè)濃度梯度) 的PAb-Cry2Aa充分混合，對照加入培養(yǎng)好的50 μl GT 噬菌體上清液和50 μl TBST 的混合液，每排分別加入100 μl 的上述液體，3 次重復(fù)，室溫結(jié)合2 h，洗板6 次后加入100 μl 酶標(biāo)抗-M13 單抗(1∶ 5 000) ，室溫結(jié)合1 h，洗板6 次。每孔加入100 μl ABTS 顯色液，室溫15 min，測OD450。

1.3.4 利用間接競爭ELISA 建立檢測方法 間接競爭ELISA 法:取50 μl GT 噬菌體上清液( 含108個(gè)噬菌體) 與14 種不同濃度的Cry2Aa 毒素蛋白( 用NaHCO3緩 沖 液 配 制 成20 μg/ml、10 μg/ml 和4 μg/ml Cry2Aa 毒素，再對4 μg/ml Cry2Aa 毒素進(jìn)行倍半稀釋至0.001 953 μg/ml) 混勻后先于37 ℃孵育過夜。次日將混合液加入包被有Cry2Aa( 4 μg/ml) 的96 孔板中，37 ℃孵育2 h，TBST 洗板，加入二抗( HRP-羊抗M13) 孵育1 h 后，顯色，測OD450。以噬菌體上清液( 不含Bt 蛋白) 反應(yīng)孔為陽性值，其他為反應(yīng)值，計(jì)算抑制率，抑制率( I) =( 陽性值-反應(yīng)值) /陽性值×100%［18］。

1.3.5 十二肽結(jié)合特異性測定 采用間接競爭ELISA 法測定十二肽與Bt 系列毒素蛋白之間的交叉反應(yīng)率。間接競爭ELISA 法:50 μl 噬菌體上清液分別與不同濃度的Cry1Ac、Cry1B、Cry1C、Cry1F蛋白標(biāo)準(zhǔn)品( 用NaHCO3緩沖液配制成9 種濃度:0.062 5 μg/ml、0.125 0 μg/ml、0.250 0 μg/ml、0.500 0 μg/ml、1.000 0 μg/ml、2.000 0 μg/ml、4.000 0 μg/ml、10.000 0 μg/ml和20.000 0 μg/ml)混勻后先于37 ℃孵育過夜，次日將混合液加入事先包被有Cry2Aa(4 μg/ml) 的96 孔板中，37 ℃孵育2 h 后，用TBST 洗板，加入二抗( HRP-羊抗M13) 孵育1 h 后，顯色，測OD450，以噬菌體上清液( 不含Bt 蛋白) 反應(yīng)孔為陽性值，其他為反應(yīng)值，計(jì)算抑制率，抑制率( I) =( 陽性值-反應(yīng)值) /陽性值×100%。阻斷劑分別為Cry1Ac、Cry1B、Cry1C、Cry1F，計(jì)算各抑制物的IC50、交叉反應(yīng)率( CR) 。CRCry1Ac=IC50Cry1Ac/IC50Cry2Aa×100%［18］。

2 結(jié)果

2.1 噬菌體十二肽庫的篩選結(jié)果

通過4 輪篩選，由產(chǎn)出投入比得知，特異性結(jié)合Cry2Aa 的噬菌體得到有效富集( 表1) 。

表1 從噬菌體十二肽庫親和篩選Cry2Aa 結(jié)合肽Table 1 Affinity selection of Cry2Aa-binding peptides from Ph. D. －12 library

2.2 單克隆ELISA 鑒定

對第4 輪隨機(jī)挑取的20 個(gè)克隆進(jìn)行單克隆ELISA鑒定，結(jié)果(圖1) 顯示:20 個(gè)克隆均為陽性克隆( 陽性值/陰性值＞2.1)。將20 個(gè)克隆編號為1 ～20。

圖1 單克隆噬菌體ELISA 鑒定抗Cry2Aa 噬菌體抗體Fig.1 Phage antibodies against Cry2Aa selected by monoclonal phage ELISA

2.3 噬菌體競爭性抑制PAb-Cry2Aa 與Cry2Aa 結(jié)合

在與Cry2Aa 多抗( PAb-Cry2Aa) 競爭ELISA 試驗(yàn)中，隨著反應(yīng)體系中PAb-Cry2Aa 濃度的增加，抑制了GT 噬菌體克隆與包被Cry2Aa 毒素蛋白的結(jié)合，使其吸光值逐漸降低( 圖2) 。說明GT 噬菌體克隆確實(shí)是針對Cry2Aa 毒素蛋白某一表位產(chǎn)生的。

圖2 GT 噬菌體克隆與PAb-Cry2Aa 競爭結(jié)合Cry2AaFig. 2 Competitive binding of phage clone GT and PAb-Cry2Aa to Cry2Aa

2.4 噬菌體克隆展示肽DNA 測序結(jié)果

對單克隆ELISA 試驗(yàn)得到的20 個(gè)陽性噬菌體克隆進(jìn)行DNA 測序并推導(dǎo)其相應(yīng)的氨基酸序列，獲得8 條不同序列( 表2) 。

表2 第4 輪陽性噬菌體克隆的外源DNA 序列及相應(yīng)氨基酸序列分析Table 2 The sequences of DNA and peptides of eluted phage in the fourth round

2.5 基于GT 的間接競爭ELISA 檢測方法的建立

由結(jié)果( 圖3) 得知，隨著游離Cry2Aa 濃度的增加，抑制率也增大，抑制率最高達(dá)61.35%。游離Cry2Aa 毒素蛋白對GT 的抑制中濃度( IC50) 為1.139 μg/ml，最低檢測限IC10為0.021 1 μg/ml，線性檢 測 范 圍 為0.047 8 ～22.691 0 μg/ml ( y =23.091lgx + 48.692，R2= 0.996 3) 。

圖3 間接競爭ELISA 反應(yīng)Fig.3 Indirect competitive ELISA

2.6 GT 克隆的結(jié)合特異性鑒定

由交叉反應(yīng)結(jié)果( 表3) 顯示，GT 特異性識(shí)別Cry2Aa; 對Cry1C 的交叉反應(yīng)率為1.59%; 對Cry1Ac、Cry1B、Cry1F 的交叉反應(yīng)率均小于0.10%。

表3 噬菌體GT 對Cry1Ac、Cry1B、Cry1F 的交叉反應(yīng)率Table 3 The cross-reactivity of phage-GT with Bt toxin

3 討論

噬菌體展示技術(shù)的發(fā)展具有很大優(yōu)越性，它篩選容量大，效率高，親和選擇與生物學(xué)擴(kuò)增能力有效結(jié)合，在獲得親和多肽或蛋白的同時(shí)也得到了其核酸編碼序列。本研究通過對活化的Cry2Aa 毒素采用隨機(jī)12 肽噬菌體展示文庫進(jìn)行4 輪“吸附-洗脫-擴(kuò)增”的淘選，成功獲得了針對Cry2Aa 毒素特異性和親和力較高的噬菌體多肽克隆。在噬菌體展示技術(shù)中，篩選過程對于整個(gè)試驗(yàn)的成敗起著至關(guān)重要的作用，在本試驗(yàn)的篩選過程中，為提高篩選的效率和最大程度獲得高親和力的噬菌體克隆，我們優(yōu)化和整合了以下幾種方法:①篩選過程中引入負(fù)篩選，可以有效減少與封閉蛋白結(jié)合噬菌體的克隆［19］;②保持4 輪Cry2Aa 的包被濃度不變，并在第2 ～4 輪增加洗脫液中Tween-20 的含量及洗滌次數(shù)，此手段可以減少非特異性和親和力低的克隆［20］;③在胰蛋白酶( Trypsin) 洗脫中加入游離的Cry2Aa 毒素進(jìn)行競爭洗脫，以確保獲得高親和力噬菌體克隆［21］。在單克隆ELISA 試驗(yàn)中，對第4 輪產(chǎn)出的克隆隨機(jī)挑選了20 個(gè)進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示，陽性克隆達(dá)到了100%( 其中吸光值最高可達(dá)2.0 以上) ，說明本試驗(yàn)采用的篩選方法可以十分有效地獲得與Cry2Aa毒素特異性結(jié)合的高親和力噬菌體克隆。

Bt 基因在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)水平在不同生長期不同部位差別很大，張青玲等測得Cry2Aa 蛋白表達(dá)蛋白量為33.5 ～120.0 ng/ml［22］，本試驗(yàn)利用噬菌體多肽建立的Cry2Aa 檢測方法，最低檢測限(21.1 ng/ml) ，基本能滿足Cry2Aa 蛋白檢測的要求。但考慮到Bt 蛋白提取存在損失，且本試驗(yàn)結(jié)果低于美國EnvironLogix 公司轉(zhuǎn)Bt 基因ELISA 試劑盒的最低檢測限(1 ng/ml)［22］，分析其原因，可能是單抗與十二肽對Cry2Aa 蛋白的結(jié)合存在親和力的差異以及檢測方法設(shè)計(jì)的差異，本試驗(yàn)采用間接競爭法，而商品化試劑盒采用的是雙抗夾心法，即非競爭法。非競爭檢測方法無論是在最低檢測限還是線性檢測范圍都比競爭法優(yōu)越［7-8］。下一步的研究我們將改變檢測方法，對已獲得的十二肽進(jìn)行突變，以期產(chǎn)生更高親和力的多肽噬菌體，并且將單克隆抗體技術(shù)、噬菌體展示技術(shù)和基因工程技術(shù)相結(jié)合，制備多功能重組抗體，同時(shí)檢測多種Bt 毒素，降低檢測成本。

本試驗(yàn)中篩選到的Bt 蛋白特異結(jié)合的十二肽，也可為研究毒素與受體的相互作用，進(jìn)一步探索抗性機(jī)制提供技術(shù)平臺(tái)［12］。

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