王西成， 吳偉民， 巫建華， 趙密珍， 王壯偉， 錢亞明， 解振強

(1.江蘇省農業(yè)科學院園藝研究所，江蘇 南京210014; 2. 江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點實驗室，江蘇 南京210014;3.江蘇現(xiàn)代園藝工程技術中心，江蘇 句容212400)

葡萄是中國栽培最廣泛的果樹樹種之一，截止到2011 年底，中國葡萄栽培面積為5.68×105hm2，總產量達9.17×106t，分別占世界葡萄栽培總面積和總產量的8.02%和13.17%，其中鮮食葡萄的栽培面積和產量已連續(xù)多年居世界第一位，并且繼續(xù)呈現(xiàn)逐年上升趨勢［1］。葡萄霜霉病是由葡萄霜霉病菌引起的真菌性病害，多雨季節(jié)易發(fā)生，生長早期發(fā)病可導致新梢、花穗枯死，中后期發(fā)病可引起提早落葉或葉片大面積枯斑而嚴重削弱樹勢，進而影響翌年的產量，是嚴重危害葡萄生產的四大病害之一［2］。

近年來，植物抗真菌病害基因工程研究日益受到重視，已陸續(xù)發(fā)現(xiàn)一些抗真菌蛋白質，β-1，3-葡聚糖酶是研究最多、應用最為廣泛的抗真菌蛋白質之一，其對于真菌的抗性具有廣譜性和持久性特點。該酶能夠降解以β-1，3-葡萄糖鏈連接的葡聚糖酶系( 大多數(shù)病原真菌細胞壁的主要成分之一)，從而使細胞內含物外溢，導致病原菌死亡［3］。高等植物中普遍存在著β-1，3-葡聚糖酶，在正常環(huán)境條件下該酶含量較少，活性較低，但當植物受到外界因素刺激時( 如病原菌侵染、水楊酸處理等)，β-1，3-葡聚糖酶即可被誘導產生并積累［4］。已有研究結果表明，植物體內有多個編碼β-1，3-葡聚糖酶的基因，其產物有酸性和堿性之分，分別定位于胞間和液泡內，但只有定位在液泡內的堿性β-1，3-葡聚糖酶才能夠降解真菌菌絲壁，從而抑制其生長，而定位于胞間的酸性β-1，3-葡聚糖酶則沒有抑菌活性［5］。目前，對于β-1，3-葡聚糖酶基因的研究較為深入，已從大豆［6］、毛竹［7］、白菜［8-9］、青花菜［10］、指天蕉［11］、甘蔗［12］等多種植物中分離到該基因序列，并且完成了部分基因的功能驗證工作［13］。在葡萄上，盡管已有關于β-1，3-葡聚糖酶活性及其編碼基因研究的報道［14-17］，但對于該基因在霜霉病菌誘導下的表達模式仍知之甚少。有鑒于此，本研究在完成葡萄β-1，3-葡聚糖酶基因克隆的基礎上，進一步對該基因在響應霜霉病菌誘導過程中的表達水平進行分析，以期為該基因在葡萄抗病育種基因工程中的應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與處理

試驗于2014 年9 月在江蘇省農業(yè)科學院溧水植物科學基地內進行，供試材料為抗病性較強的8年生鮮食葡萄品種金星無核。葡萄霜霉病病原菌( Plasmopara viticola) 于江蘇省農業(yè)科學院院內葡萄資源圃病葉上分離獲得。

試驗所用M-MLV 逆轉錄酶、Ex-Taq、DNaseⅠ、dNTP、pMD19-T 載體、熒光染料SYBR GreenⅠ均購自寶生物工程( 大連) 有限公司; T4 DNA 連接酶購自Promega 公司; DL2000 Marker 和DNA 回收試劑盒購自上海生物工程技術服務有限公司; DH5α 感受態(tài)大腸桿菌( Escherichia coli) 菌株由作者所在的國家農業(yè)科技華東( 江蘇) 創(chuàng)新中心高效園藝作物遺傳改良實驗室保存。

1.2 病原菌制備及接種

參考王西成等［18］的方法，從田間采回新鮮的葡萄霜霉病葉，流水沖洗干凈，經蒸餾水沖洗后置于17 ～20 ℃黑暗環(huán)境中保濕( 相對濕度為95%) 24 h，誘發(fā)新的孢子囊。用濕棉球將新產生的孢子囊剝落于無菌水中，配成1 ml 8×104個霜霉病菌孢子囊懸浮液，并加入標定體積0.1%的吐溫。接種前用載玻片萌芽法測定孢子囊的活性，萌發(fā)率高于85.0%為有效接種液。采用噴霧法對金星無核幼嫩葉片進行接種，然后套袋并放入濕棉球保濕。分別于接種后0 h、4 h、12 h、24 h、48 h 和72 h 進行6 次取樣，葉片采集后液氮速凍，并于－70 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 總RNA 提取與cDNA 合成

葡萄葉片總RNA 的提取參考北京華越洋生物科技有限公司生產的植物RNA 提取試劑盒說明書進行。以總RNA 為模板，根據(jù)北京百泰克生物技術有限公司生產的Bio Teke supermo ⅢRT Kit 試劑盒說明，利用引物P01 反轉錄合成cDNA 第一鏈，反轉錄條件為:50 ℃保溫45 min，70 ℃保溫10 min，冰上冷卻后，－70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 葡萄β-1，3-葡聚糖酶基因cDNA 克隆

根據(jù)GenBank 中已登錄的葡萄β-1，3-葡聚糖酶基因( NM _001280967. 1) 和 UBI 基 因( XM _002266714) 序列設計引物，并由上海英濰捷基貿易有限公司( http: //www.invitrogen.com) 合成，引物序列詳見表1。以cDNA 為模板，分別利用引物P02/P03、P04/P05 和P06/P07 進行PCR 擴增獲得葡萄β-1，3-葡聚糖酶基因的開放閱讀框( ORF) 及5'和3'非編碼區(qū)( UTR) 序列。反應體系均為25.00 μl:上、下游引物各1.00 μl(10 μmol/L) ，Ex-Taq (5 U/μl) 0.25 μl，10×PCR buffer ( 含Mg2+) 2.50 μl，dNTP 混合溶液(10 mmol/L) 2.00 μl，cDNA 2.00 μl，ddH2O 補至25.00 μl。反應條件:94 ℃預變性5 min;94 ℃變性40 s，退火40 s，72 ℃延伸1 min，共35 個循環(huán);72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的片段利用DNA 凝膠回收試劑盒進行回收，最后將目標片段連接到pMD-19T simple 載體上進行T/A 克隆，DNA 測序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司( http: //www.majorbio.com) 完成。

表1 引物序列及片段大小Table 1 Sequence of primers and size of amplified product

1.5 葡萄β-1，3-葡聚糖酶基因序列分析

首先利用DNAMAN 5. 22 軟件對ORF、5'末端和3'末端3 個序列進行拼接分析。核苷酸和氨基酸序列分別利用 NCBI 的 BLASTn 和BLASTp( http: //blast. ncbi. nlm. nih. gov/Blast.cgi) 進行相似性分析，用DNAMAN 5. 22 軟件分析葡萄β-1，3-葡聚糖酶氨基酸序列與其他植物的關系。

1.6 葡萄β-1，3-葡聚糖酶基因表達分析

分別提取金星無核葡萄接種霜霉病菌后不同時期的葉片總RNA，經DNase Ⅰ消化后分別取2 μg，并以P0 1 引物進行反轉錄合成cDNA。利用Primer 3 引物設計軟件( http: //frodo. wi. mit. edu/primer3 /) 進 行 相 關 引 物 的設計，研究該基因在金星無核葡萄中的時空表達情況。以葡萄看家基因UBI 作為內標基因進行qRT-PCR 分析，目的基因相關引物序列見表1。qRT-PCR 見文獻［1 9］，利用Bio-Rad My-IQ2 熒光定量PCR 儀，對目的基因的表達情況進行實時熒光定量分析。反應體系按照SYBR Green I( TOYOBO) 的說明書進行，反應條件為: 9 5 ℃預變性1 0 s; 9 5 ℃變性1 0 s，Tm 退火2 0 s，7 2 ℃延伸3 0 s，4 0 個循環(huán)，試驗共設置3 次重復，反應結束后采用△△Ct法對熒光定量PCR 擴增數(shù)據(jù)進行處理，目的基因的相對表達量通過2－△△Ct值來確定。

2 結果與分析

2.1 葡萄β-1，3-葡聚糖酶基因的cDNA 克隆及序列分析

根據(jù)GenBank 中已登錄的釀酒葡萄β-1，3-葡聚糖酶基因序列設計特異引物，以金星無核葡萄葉片的cDNA為模板進行PCR 擴增，分別獲得了1 083 bp、691 bp 和325 bp 的3 條片段。將上述3 條片段進行克隆、測序，以及拼接組裝，最終獲得1 條總長為1 244 bp 的cDNA 序列。該序列包括1 個1 083 bp 的完整開放閱讀框( ORF) ，33 bp 的5'非編碼區(qū)和128 bp 的3'非編碼區(qū)( 圖1) 。該基因ORF 區(qū)包含一個含有360 個氨基酸的蛋白質，BioXM 2.6 預測該鮮食葡萄β-1，3-葡聚糖酶基因所編碼蛋白質的分子量為89 440，理論等電點為4.83。再將獲得的ORF 序列與GenBank 中已登錄的釀酒葡萄β-1，3-葡聚糖酶基因序列進行同源性比對發(fā)現(xiàn)，在編碼的360 個氨基酸中，僅第204、234、249 和306 位上的氨基酸存在差異，兩者相似度高達98.9%( 圖2) 。

2.2 葡萄β-1，3-葡聚糖酶基因所推導的氨基酸序列及其系統(tǒng)發(fā)育關系分析

為了解不同物種β-1，3-葡聚糖酶基因的進化關系，本研究從NCBI 公共數(shù)據(jù)庫中下載了油棕、姜、百合、玉米、豌豆、桃和水稻共7 個物種的β-1，3-葡聚糖酶氨基酸序列，用DNAMAN5.22 軟件進行序列比對和系統(tǒng)進化樹的構建。結果顯示，8 條蛋白質序列含334 ～377 個氨基酸殘基，序列之間相似性均較低，說明不同物種β-1，3-葡聚糖酶基因在進化過程中發(fā)生了較大變化(圖3)。

圖1 葡萄β-1，3-葡聚糖酶基因的核苷酸序列及其推導的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide and deduced amino acid sequences of grape beta-1，3-glucanase gene

圖2 鮮食與釀酒葡萄β-1，3-葡聚糖酶氨基酸序列比對Fig.2 The alignment of beta-1，3-glucanase amino acid sequences in table and wine grapes

系統(tǒng)進化分析結果顯示，葡萄β-1，3-葡聚糖酶氨基酸序列與其他物種之間遺傳距離均較遠，在全部比較的8 個物種中，除與釀酒葡萄同源性較高(98.9%) 外，與桃、豌豆、姜、油棕、百合、玉米的同源性為50.9% ～62.1%，而與水稻的同源性最低，僅為33.1%( 圖4) 。

圖4 葡萄與其他植物β-1，3-葡聚糖酶系統(tǒng)進化分析Fig.4 Phylogenetic tree of beta-1，3-glucanase among grape and other plants based on amino acid sequence

2.3 葡萄β-1，3-葡聚糖酶基因的表達

為了解葡萄β-1，3-葡聚糖酶基因在葡萄葉片接種霜霉病菌后不同時期的表達情況，本研究以UBI作為內參基因，利用qRT-PCR 技術對該基因在葡萄葉片接種霜霉病菌后不同時期的表達情況進行了對比分析。結果顯示，在接種霜霉病菌后的72 h 內，葡萄β-1，3-葡聚糖酶基因的相對表達水平均高于處理0 h ( 對照) ，且呈現(xiàn)出先升后降的變化趨勢，尤其在處理后24 h 時，該基因的相對表達量達到最高，約為對照的5.6 倍，之后出現(xiàn)較大幅度下降( 圖5) 。上述結果表明，霜霉病菌侵染可誘導葡萄β-1，3-葡聚糖酶基因表達。

3 討論

葡萄霜霉病遍及世界各個葡萄產區(qū)，是葡萄生產上重要的真菌性病害之一［20-23］，當前對于該病害的防治主要依賴于殺菌劑，過度及不適當?shù)厥褂脷⒕鷦┎粌H會危及食品安全，還會對環(huán)境造成嚴重危害，因此培育抗病品種已成為解決這一病害的有效途徑。傳統(tǒng)的育種方法需要通過對雜交后代表型進行初步篩選，此過程不僅費時耗財，且不易選育出理想的優(yōu)質抗病葡萄新品種［24］。自20 世紀后期以來分子生物學技術取得了快速發(fā)展，這為縮短葡萄育種周期，加快抗病新品種的選育進程帶來了新的契機。將分子生物學技術充分應用到葡萄育種過程之中不僅可以大幅縮短葡萄育種年限，同時還可以有效提高定向育種效率，已引起葡萄育種工作者的高度重視。

圖5 霜霉病菌侵染后β-1，3-葡聚糖酶基因的表達Fig.5 Expression of beta-1，3-glucanase gene infected by Plasmopara vitieola

早在1992 年，Keen［25］就指出植物的抗病性是植物為了抵抗病原物的侵染、擴展和危害而在形態(tài)結構和生理生化，以及時間和空間上的綜合表現(xiàn)，其實質是抗病相關基因表達的結果。分子生物學研究結果同樣表明，植物在受到病原菌侵染時，其體內的部分轉錄因子會被激活，進而調控下游抗病基因的表達，從而達到抗病的目的［26-27］，如中國野生葡萄轉錄因子VpWRKY1 和VpWRKY2 可顯著提高轉基因擬南芥對白粉病的抗性［28］; VvPR1 基因的表達會因霜霉菌的誘導而表現(xiàn)為強烈上調［29］; 歐洲葡萄VST1 基因瞬時過量表達的葉片對于霜霉病的抗性也會增強［30］。近年來，有關葡萄轉基因抗病育種也取得了一定進展，將中國野生葡萄STS 基因轉化歐洲葡萄后，轉基因植株中的白藜蘆醇含量會顯著高于對照，這有助于提高轉基因植株的抗病性［31］; 而將環(huán)形抗菌肽基因轉化歐洲葡萄后，不僅可以大幅提高轉基因植株對于冠癭病的抗性，同時也可在一定程度上提高其對葡萄白粉病的抗性［32-33］。

鑒于β-1，3-葡聚糖酶在植物抗病過程中所發(fā)揮的重要作用，本研究以對霜霉病抗性較強的葡萄品種金星無核為試驗材料，采用RT-PCR 技術成功獲得1 個1 244 bp 的葡萄β-1，3-葡聚糖酶基因序列。葡萄霜霉病菌接種試驗結果表明，葡萄β-1，3-葡聚糖酶基因受霜霉病菌誘導上調表達，進而推測該基因能夠響應葡萄霜霉病菌的誘導，進而參與葡萄對霜霉病菌的防御反應。

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