諶 鑫， 王春臺(tái)， 覃永華

(中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430074)

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水稻OsVDAC5基因干涉載體的構(gòu)建和遺傳轉(zhuǎn)化

諶 鑫， 王春臺(tái)， 覃永華*

(中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430074)

[目的]構(gòu)建水稻基因OsVDAC5的RNAi表達(dá)載體，遺傳轉(zhuǎn)化獲得OsVDAC5轉(zhuǎn)基因植株以研究該基因的生物學(xué)功能。[方法] 通過(guò)PCR擴(kuò)增OsVDAC5特異片段并克隆到RNA干涉載體pMCG161，以水稻日本晴為受體，將OsVDAC5 RNAi表達(dá)載體進(jìn)行了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，利用PCR和RT-PCR技術(shù)檢測(cè)T0代轉(zhuǎn)基因植株中OsVDAC5的表達(dá)水平。[結(jié)果]OsVDAC5在絕大多數(shù)RNAi轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)量顯著降低。[結(jié)論]為進(jìn)一步研究水稻OsVDAC5基因功能提供了重要材料。

水稻；OsVDAC5基因；干涉載體；構(gòu)建；遺傳轉(zhuǎn)化

電壓依賴性離子通道蛋白(Voltage-Dependent Anion Channel VDAC)是一種多基因家族編碼的定位于線粒體外膜的離子孔道蛋白，并能同定位在線粒體外膜上的其他蛋白形成復(fù)合物，主要功能是介導(dǎo)代謝物在細(xì)胞質(zhì)和線粒體之間的運(yùn)輸[1]。VDAC作為代謝分子進(jìn)出線粒體的門(mén)戶，控制著線粒體與細(xì)胞其他結(jié)構(gòu)之間的聯(lián)系，同時(shí)VDAC在線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中也起著重要作用[2]。

VDAC基因在植物生長(zhǎng)發(fā)育及逆境脅迫應(yīng)答中扮演著重要角色[3]。擬南芥中的4個(gè)VDAC基因在高鹽脅迫下，表達(dá)量明顯下調(diào)，但冷脅迫和干旱脅迫對(duì)它們的表達(dá)沒(méi)有影響[4]。然而，抑制擬南芥中VDAC2的表達(dá)，直接導(dǎo)致幼苗對(duì)脫落酸無(wú)敏感性，使植株失去應(yīng)答鹽脅迫和干旱脅迫的能力[5]。當(dāng)水稻經(jīng)過(guò)滲透脅迫、鹽脅迫和干旱脅迫后，其VDACs的表達(dá)量明顯上升[6]。Desai等[7]研究發(fā)現(xiàn)珍珠栗中的PgVDAC雖然是鹽誘導(dǎo)基因，但在干旱、冷和水楊酸的脅迫下，表達(dá)量也明顯上調(diào)，提高了植株在脅迫環(huán)境下的應(yīng)答能力。Chika等發(fā)現(xiàn)敲除擬南芥中的VDAC2和VDAC4基因?qū)е轮仓晟L(zhǎng)緩慢，花粉育性降低。該研究還發(fā)現(xiàn)，VDAC1是植株生長(zhǎng)發(fā)育必須的，且參與植株抗病過(guò)程。同時(shí)VDAC作為HR反應(yīng)的標(biāo)志基因之一，參與擬南芥細(xì)胞中的抗病反應(yīng)[8]。敲除VDAC1的擬南芥缺陷型植株，在感染病毒avrRpt2后，感病性明顯升高，最終導(dǎo)致HR誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡途徑被抑制[9]。煙草中的3個(gè)VDAC基因在接種非宿主型病原后，表達(dá)量明顯上升[9]，且煙草中超表達(dá)VDAC會(huì)直接導(dǎo)致植株葉片中H2O2的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)植物的抗病反應(yīng)[10]。已有研究表明，水稻中存在8個(gè)VDAC基因[11]，且發(fā)現(xiàn)這8個(gè)VDAC基因在水稻中均為組成型表達(dá)[12]。超表達(dá)水稻VDAC4基因?qū)е赂腥玖瞬《拘圆≡臒煵軧Y2細(xì)胞和本薩明那煙葉片細(xì)胞死亡，表明VDACs調(diào)節(jié)活性氧的產(chǎn)生以應(yīng)答病原感染[13]。

筆者以表達(dá)載體pMCG161為基礎(chǔ)構(gòu)建了OsVDAC5基因的干涉載體，以水稻日本晴為轉(zhuǎn)化受體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化得到OsVDAC5表達(dá)下調(diào)的轉(zhuǎn)基因植株來(lái)研究OsVDAC5基因的生物學(xué)功能。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 生物材料。水稻日本晴( Nipponbare) 、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞和農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞及表達(dá)載體pMCG161(圖1)由中南民族大學(xué)生物技術(shù)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 試劑。DNA聚合酶(rTaq)、dNTP、DNA Marker、T4連接酶、限制性內(nèi)切酶均購(gòu)自TaKaRa公司，總RNA提取試劑Ttizol購(gòu)自Invitrogen公司,反轉(zhuǎn)錄試劑盒Rever Tra Ace-α-TM、熒光定量試劑盒SYBR Green-Realtime PCR Master Mix QPK-201購(gòu)自TOYOBO公司，DNA 凝膠回收試劑盒購(gòu)自Axygen公司，引物由南京金斯瑞公司合成。

1.1.3 儀器。TFL-40Gel Vue UV Transilluminator凝膠成像系統(tǒng)，SYNOPTICS LTD(英國(guó))；centrifuge 5810R離心機(jī)，Eppendorf(德國(guó))；CR22G高速離心機(jī)，Hitachi(日本)；PTC-200 PCR儀，Bio-Rad laboratories MJ Reasearch(美國(guó))；7500 Fast Real-time PCR儀，Applied Biosystems(美國(guó))；HQ45Z恒溫?fù)u床，武漢中科科儀技術(shù)發(fā)展責(zé)任有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)。在OsVDAC5基因mRNA序列中選取一段特異序列作為干涉區(qū)段(300～500 bp)，在正向引物5′端加上TAA ACTAGT GGTACC (SpeΙ和KpnΙ位點(diǎn))序列，反向引物5′端加上TAA GAGCTC GGATCC (SacΙ和BamHΙ位點(diǎn))序列。根據(jù)pMCG161載體序列設(shè)計(jì)2對(duì)鑒定引物PMCGF/PMCGR(5′-GGCTCACCAAACCTTAAACAA-3′/5′- GCCTAACCAAACATAACGAACG-3′)和PMCG2F/PMCG2R(5′- GGCTCACCAAACCTTAAACAA -3′/5′- CTGAGCTACACATGCTCAGGTT -3′)，分別檢測(cè)干涉載體中和轉(zhuǎn)化植株中插入的第一鏈和第二鏈。同時(shí)，根據(jù)基因riceActin1gene(accession no.AK060893)設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物actinF/actinR(5′-TGCTATGTACGTCGCCATCCA-3′，反向5′-AATGAGTAACCACGCTCCGTC-3′)，用于轉(zhuǎn)基因植株cDNA的檢測(cè)。引物用Primer3(v.0.4.0)在線設(shè)計(jì)。

1.2.2 RNAi植物表達(dá)載體的構(gòu)建。以日本晴幼穗的單鏈cDNA為模板，用特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，切膠回收目的片段，用KpnΙ和BamHΙ同時(shí)雙酶切該目的片段和空載pMCG161，用T4連接酶將兩者連接后熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取單克隆培養(yǎng)后提取質(zhì)粒DNA進(jìn)行PCR和雙酶切檢測(cè)。再將目的片段和中間載體用SpeΙ和SacΙ雙酶切后，用T4連接酶連接后熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，PCR檢測(cè)為陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序正確的質(zhì)粒電激轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆進(jìn)行PCR檢測(cè)。

1.2.3 水稻的遺傳轉(zhuǎn)化。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化，將成熟日本晴種子誘導(dǎo)愈傷后繼代培養(yǎng)，用農(nóng)桿菌侵染胚性愈傷，共培養(yǎng)2～3 d后，用潮霉素進(jìn)行抗性愈傷的篩選、分化、生根培養(yǎng)，待植株根系發(fā)達(dá)后打開(kāi)瓶口加入一定量的無(wú)菌水進(jìn)行煉苗，約7 d后移栽到實(shí)驗(yàn)田。

1.2.4 轉(zhuǎn)基因植株的陽(yáng)性鑒定。采用CTAB法提取轉(zhuǎn)基因植株的基因組DNA，用引物PMCGF/R和PMCG2F/2R進(jìn)行PCR檢測(cè)。取4 μl產(chǎn)物點(diǎn)用檢測(cè)。

1.2.5 RT-PCR檢測(cè)陽(yáng)性植株的表達(dá)量。采用Trizol法提取轉(zhuǎn)基因植株的總RNA，利用TOYOBO Rever Tra Ace-α-TM試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA。用內(nèi)參Actin1引物對(duì)cDNA模板進(jìn)行PCR鑒定，按一定比例稀釋后用設(shè)計(jì)的OsVDAC5基因的RT-PCR引物和actin引物同時(shí)對(duì)cDNA模板進(jìn)行RT-PCR。

2 結(jié)果與分析

2.1 干涉表達(dá)載體的構(gòu)建

2.1.1 目的片段的克隆。通過(guò)PCR擴(kuò)增出目的片段，切膠回收后進(jìn)行電泳檢測(cè)，獲得大小約為400 bp的條帶(圖 2)，測(cè)序結(jié)果顯示目的條帶正確。

2.1.2 重組質(zhì)粒的鑒定。利用引物PMCGF/R和PMCG2F/2R對(duì)構(gòu)建的OsVDAC5干涉載體進(jìn)行PCR鑒定(圖3)，獲得的條帶同目標(biāo)帶一致，同時(shí)測(cè)序結(jié)果顯示正確。

2.2 遺傳轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)基因植株T0代鑒定 構(gòu)建好的干涉載體通過(guò)電激轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法侵染日本晴的愈傷組織，經(jīng)過(guò)篩選、分化、生根、煉苗，然后種植于田間(圖4)。

取5 cm左右的幼嫩葉片，以CTAB法提取的基因組DNA為模板，用引物PMCGF/R和PMCG2F/2R對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR鑒定(圖5)，共獲得21株轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株。

2.3 陽(yáng)性植株的表達(dá)量檢測(cè) 取5 cm左右的葉片用Trizol試劑提取其總RNA，電泳可見(jiàn)清晰的3條主帶，轉(zhuǎn)基因植株RNA提取成功(圖6)。利用TOYOBO Rever Tra Ace-α-TM試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA,用內(nèi)參actin引物對(duì)cDNA模板進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果表明，cDNA模板質(zhì)量良好(圖7)，可用于后續(xù)的RT-PCR檢測(cè)。按一定比例稀釋cDNA模板，用設(shè)計(jì)的RT-PCR引物OsVDAC5(F、R)和Actin1引物同時(shí)對(duì)cDNA模板進(jìn)行RT-PCR。結(jié)果顯示，相比野生型日本晴(Nipponbare)，所有陽(yáng)性植株中OsVDAC5基因的表達(dá)水平均有不同程度的顯著下調(diào)(圖8)，僅v5-3和v5-5植株中OsVDAC5的表達(dá)量相對(duì)較高，表明基因OsVDAC5的表達(dá)在陽(yáng)性植株中被抑制，可作為下一步轉(zhuǎn)基因植株功能分析的材料。

3 討論

該試驗(yàn)成功構(gòu)建了基因OsVDAC5的干涉表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化獲得了多株T0代轉(zhuǎn)基因植株，并對(duì)這些轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行陽(yáng)性鑒定和RNA水平的表達(dá)量分析。結(jié)果表明，基因OsVDAC5在轉(zhuǎn)基因植株中表達(dá)量顯著下調(diào)，基因OsVDAC5干涉植株的獲得為該基因的后續(xù)深入研究提供了材料和基礎(chǔ)。試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株在花粉育性和株高方面，相比野生型日本晴植株有明顯降低的趨勢(shì)，暗示抑制OsVDAC5基因的表達(dá)可能會(huì)對(duì)水稻發(fā)育造成一定影響，這些表型的確定還需要進(jìn)一步深入鑒定。

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Construction and Genetic Transformation of RNAi Vector ofOsVDAC5 Gene in Rice

KAN Xin, WANG Chun-tai, QIN Yong-hua*

(School of Life Sciences, South-central University for Nationalities,Hubei Provincial Key Laboratory of Plant Germplasm Resources Protection and Utilization in Wuling Mountainous Areas, Wuhan, Hubei 430074)

[Objective]To construct and transform the expression vector for RNA interference of riceOsVDAC5 gene, and to obtain transgenic plants in which the expression level ofOsVDAC5 was down-regulated for research the biological function ofOsVDAC5. [Method] RNAi-special sequence ofOsVDAC5 gene was cloned into the plant expression vector pMCG161, and transformed into callus of rice Nipponbare mediated by Agrobacterium. Further, the expression level ofOsVDAC5 in T0generation transgenic plant was checked by PCR and RT-PCR. [Result] The results showed that the expression level ofOsVDAC5 in RNAi-transgenic plants was down-regulated obviously. [Conclusion] The study can provide important materials for further research of geneOsVDAC5.

Rice;OsVDAC5 gene; RNAi vector; Construction; Genetic transformation

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31170226)。

諶鑫 (1987- )，男，湖北武漢人，碩士研究生，研究方向：遺傳學(xué)。*通訊作者，講師，博士，從事水稻逆境分子生物學(xué)研究。

2015-04-24

S 188+.1

A

0517-6611(2015)17-017-03