魏曉雪，楊 臣，張文天，李德文

(1.黑龍江省科學(xué)院火山與礦泉研究所，黑龍江五大連池 164155；2.東北林業(yè)大學(xué)森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150040)

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外源一氧化氮對UV-B脅迫下紅松幼苗光合特性和活性氧代謝的影響

魏曉雪1，楊 臣1，張文天1，李德文2*

(1.黑龍江省科學(xué)院火山與礦泉研究所，黑龍江五大連池 164155；2.東北林業(yè)大學(xué)森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150040)

[目的]研究外源一氧化氮對增強UV-B輻射脅迫后紅松幼苗光合特性和活性氧代謝的影響。[方法]設(shè)4個組：①CK；②SNP (0.01 mmol/L)；③UV-B (4.22 kJ/(m2·d))；④SNP(0.01 mmol/L)+ UV-B(4.22 kJ/(m2·d))。分別于處理1、3、5、7、9 d取樣，測定各項生理指標(biāo)。[結(jié)果] 施加外源NO，顯著增加紅松幼苗針葉光合色素含量，緩解UV-B對光合作用的破壞；外源NO處理降低UV-B脅迫對紅松幼苗針葉細胞膜的膜相對透性的破壞及MDA含量的積累；UV-B處理和SNP+UV-B處理都提高了APX、SOD和POD活性。[結(jié)論]植物防衛(wèi)反應(yīng)信號分子NO廣泛參與紅松幼苗對UV-B脅迫的應(yīng)答與防御。外源NO對紅松幼苗由于UV-B輻射引起的氧化損傷有明顯的緩解作用。

外源NO；UV-B脅迫；紅松；生理指標(biāo)

一氧化氮(Nitric oxide,NO)是一種廣泛存在于生物體內(nèi)的氣體活性分子，也是一種活性氮(Reactive nitrogen species,RNS)。它在植物體內(nèi)主要通過一氧化氮合成酶(NOS)和硝酸還原酶(NR)催化形成[1]。作為一種化學(xué)性質(zhì)活躍的生物自由基，NO在植物生長發(fā)育、抗逆性等多種生命活動中充當(dāng)?shù)诙攀筟2]。來源于NOS系統(tǒng)的NO是UV輻射下產(chǎn)生的信號分子。UV輻射導(dǎo)致的植物生長受到抑制是通過影響細胞壁降解酶活性，改變細胞壁化學(xué)特性和機械延展性而實現(xiàn)的。作為UV輻射的第二信使NO介導(dǎo)了這一過程[3]。NO作為UV-B輻射產(chǎn)生的第二信使已成為現(xiàn)今植物逆境生理和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)領(lǐng)域的研究熱點[4]。

Beligni等[5]研究表明，植物細胞內(nèi)的NO具有雙重生理效應(yīng)，其中低濃度NO具有保護作用，而高濃度NO則具有生理毒性。前人研究證明，外源NO可減少脅迫條件下植物體內(nèi)的活性氧積累，從而緩解干旱、低溫等脅迫條件對植株造成的傷害[6-7]。段凱旋等[8]研究發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)濃度的外源NO可通過提高平邑甜茶根系和葉片的抗氧化酶活性，降低銅、鎘脅迫下O2-·產(chǎn)生速率、MDA含量，從而起到保護幼苗的作用。付士磊等[4,9]分別研究了外源NO對干旱脅迫下楊樹幼苗和核桃幼苗生理特性的影響。目前，關(guān)于外源NO提高植物抗逆性的報道主要集中于鹽脅迫和干旱脅迫研究方面，且多集中于草本植物。關(guān)于木本植物的研究較少，迄今很少涉及外源NO對UV-B脅迫下紅松幼苗生理作用的研究報道。

紅松(Pinuskoraiensis)是整個北半球中高緯度地區(qū)分布面積最大的三大五針?biāo)芍?，是目前世界上珍貴而稀有的多用途樹種之一[10]。選擇3年生人工種植的紅松幼苗為材料，筆者研究了外源NO對UV-B脅迫下紅松幼苗光合參數(shù)、葉綠素含量以及活性氧代謝系統(tǒng)的影響，為了解NO提高植物抗逆性的作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計 試驗于2011年1月3～10日在東北林業(yè)大學(xué)森林植物生態(tài)學(xué)重點實驗室溫室內(nèi)進行。試驗材料為3年齡紅松幼苗，將幼苗隨機分為4組，每組60株。供試土壤的基本理化性質(zhì)為：pH 5.6，速效氮200 mg/kg，速效磷90 mg/kg，速效鉀200 mg/kg，有機質(zhì)2.5%。試驗設(shè)4個處理：①CK；②SNP (0.01 mmol/L)；③UV-B (4.22 kJ/(m2·d))；④SNP(0.01 mmol/L)+ UV-B(4.22 kJ/(m2·d))。CK為溫室內(nèi)自然條件處理。UV-B處理組為在溫室內(nèi)自然光照基礎(chǔ)上人工增加4.22 kJ/(m2·d)輻射強度的UV-B(280～320 nm)光照。UV-B輻射處理通過懸在植株上方的UV-B輻射燈管產(chǎn)生。處理時間為每天12 h(6:00～18:00)。UV-B輻射強度用光譜儀AvaSpec 2048-2進行測定。生物有效輻射用Caldwell[11]文獻方法標(biāo)定到300 nm植物響應(yīng)作用光譜加權(quán)處理獲得。用文獻[12]模型，算得補增UV-B輻射的強度。

外源NO供體用硝普鈉(SNP)制得。先配制1 mmol/L SNP母液，4 ℃保存，用時按試驗所需的濃度進行稀釋。CK和UV-B處理噴施清水，SNP處理用0.01 mmol/L SNP溶液100 ml均勻噴施于葉面。每個處理均隨機取樣，處理1、3、5、7、9 d后測定各項生理指標(biāo)。

1.2 試驗方法

1.2.1 Pn-PAR響應(yīng)曲線的測定。選天氣晴好的上午，用LI-6400便攜式光合儀，在人工紅藍光源，氣溫(Tair) 24～27 ℃，相對濕度(RH) 50%～70%，CO2濃度為400 μmol/(m2·s)，光合有效輻射(PAR)強度分別設(shè)定為1 800、1 200、1 500、1 000、800、500、200、100、50、0 μmol/(m2·s)條件下，測定葉片凈光合速率(Pn)。用光響應(yīng)模型，擬合Pn-PAR響應(yīng)曲線[13]。

1.2.2 光合色素含量的測定。光合色素含量參考前人方法[14-15]測定。取0.05 g紅松針葉，剪碎，放入試管中，加入5 ml二甲基亞砜(DMSO)，黑暗下60 ℃水浴直至紅松針葉完全變白，以DMSO為空白，使用紫外可見分光光度計分別測定提取液480、649、665 nm的吸光值。根據(jù)相關(guān)公式，分別計算葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素和總?cè)~綠素的含量，單位為mg/g FW。

1.2.3 過氧化氫(H2O2)自由基含量的測定。H2O2與硫酸鈦(或氯化鈦)生成過氧化物-鈦復(fù)合物黃色沉淀，可被H2SO4溶解，在415 nm波長下采用比色法測定[16]。

1.2.4 丙二醛(MDA)含量的測定。MDA含量參照高俊鳳[17]的方法測定。

1.2.5 NO含量的測定。采用試劑盒法(試劑盒購自南京建成生物工程研究所)。取1 g針葉，加入40 mmol/L HEPES緩沖液(pH 7.2)3 ml,研磨，2 ml沖洗，用2層紗布過濾后，在8 000 r/min 4 ℃離心10 min，取上清液,參考說明書進行測定。

1.2.6 抗氧化酶活性的測定?？寡趸富钚缘臏y定參考前人方法[18]。取0.5 g新鮮紅松針葉，在液氮中充分研磨，迅速轉(zhuǎn)入含有5 ml 50 mmol/L磷酸緩沖液(pH 7.0，含1 mmol/L EDTA和濃度1%PVP)的離心管中，10 000 r/min 4 ℃離心15 min，取上清液，棄沉淀，再10 000 r/min 4 ℃離心10 min，上清液即為粗酶液，4 ℃保存，備用。過氧化氫酶(CAT)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)和過氧化物酶(POD)的活性分別以每分鐘A240、A290和A470變化值表示；超氧化物歧化酶(SOD)活性以單位時間內(nèi)抑制氮藍四唑光化還原50%為一個酶活性單位(U)。

1.3 數(shù)據(jù)分析 用Excel 2003 軟件進行數(shù)據(jù)處理。采用SPSS 13.0軟件，進行方差分析及顯著性檢驗(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 Pn-PAR響應(yīng)曲線 由圖1可知，不同處理對紅松幼苗針葉Pn-PAR響應(yīng)曲線的影響不同。處理9 d后，在PAR到達500 μmol/(m2·s)以后,SNP+UV-B處理凈光合速率顯著高于其他3個處理。與CK相比，SNP處理和UV-B處理凈光合速率數(shù)值差異不明顯。

2.2 光合色素含量 由表1可知，處理9 d后，與CK相比，SNP處理增加了紅松幼苗針葉中光合色素(葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素和總?cè)~綠素)的含量，而UV-B處理和SNP+UV-B處理則在0.05水平顯著降低光合色素的含量。

表1 4個處理對紅松幼苗針葉光合色素含量的影響 mg/g

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.3 H2O2含量 由圖2可知，4個處理對紅松幼苗針葉中H2O2含量的影響不同。處理9 d后，與CK相比，其余3個處理都在0.05水平顯著提高H2O2含量。UV-B處理H2O2含量最高，達到300 μmol/g；SNP處理H2O2含量表現(xiàn)為升高趨勢；SNP+UV-B處理H2O2含量變化規(guī)律不明顯。

2.4 MDA含量 由圖3可知，處理9 d后，與CK相比，其余3個處理紅松幼苗針葉中MDA含量都在0.05水平顯著增加。隨著處理時間的延長，與CK相比，SNP處理MDA含量表現(xiàn)為先降低后升高的趨勢，處理9 d后SNP處理MDA含量最高；SNP+UV-B處理下前2次取樣MDA含量最高，而后含量降低，表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢；UV-B處理MDA含量呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢。

2.5 NO含量 由圖4可知，處理9 d后，與CK相比，其余3個處理都提高紅松幼苗針葉中NO含量，最大值出現(xiàn)在SNP+UV-B處理。隨著處理時間的延長，不同處理對NO含量的變化各不相同。SNP和UV-B處理下NO含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，除第1次取樣外，NO含量都高于CK，NO含量最大值有2次都出現(xiàn)在UV-B處理，而SNP+UV-B處理對NO含量并無明顯的影響。

2.6 抗氧化酶活性 由表2可知，處理9 d后，4個處理對紅松幼苗針葉中抗氧化酶活性影響各不相同。與CK相比，SNP和UV-B處理在0.05水平顯著降低CAT活性，SNP+UV-B處理則在0.05水平顯著提高CAT活性；與CK相比，其余3個處理都在0.05水平顯著提高APX和SOD活性，APX和SOD活性最大值出現(xiàn)在SNP+UV-B處理；與CK相比，SNP處理在0.05水平顯著降低了POD活性。UV-B處理和SNP+UV-B處理則在0.05水平顯著提高POD活性，SNP處理下POD活性最小，僅為3.09 U/(g·min)，UV-B處理下POD活性最大，高達74.78 U/(g·min)。

3 結(jié)論

(1)施加NO顯著增加了紅松幼苗針葉光合色素含量，表明外源NO有助于維持紅松幼苗針葉的葉綠素含量，外源NO緩解了UV-B對光合作用的破壞作用。

(2)外源NO處理降低了UV-B脅迫下紅松幼苗針葉細胞膜的膜相對透性、MDA的積累。外源NO處理引起UV-B脅迫下紅松幼苗針葉H2O2含量與H2O2代謝酶活力的變化，共同保護紅松幼苗不受過多活性氧的傷害，對UV-B脅迫導(dǎo)致的紅松幼苗活性氧傷害具有保護作用。

(3)植物防衛(wèi)反應(yīng)信號分子NO參與紅松幼苗對UV-B脅迫的應(yīng)答與防御。NO作為UV-B輻射的第二信使介導(dǎo)紫外脅迫信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，并誘發(fā)植物產(chǎn)生抗性反應(yīng)。外源NO對UV-B輻射脅迫導(dǎo)致的紅松幼苗傷害具有一定的緩解作用。

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The Effects of Exogenous Nitric Oxide on Photosynthetic Characteristics and Active Oxygen Metabolism inPinuskoraiensisSeedlings under UV-B Stress

WEI Xiao-xue1, YANG Chen1, ZHANG Wen-tian1, LI De-wen2*

(1. Institute of Volcanoes and Mineral Springs, Heilongjiang Academy of Science, Wudalianchi, Heilongjiang 164155; 2. Key Laboratory of Forest Plant Ecology, Ministry of Education, Northeast Forestry University, Harbin, Heilongjiang 150040)

[Objective] To research the influence of photosynthetic characteristics and active oxygen metabolize ofPinuskoraiensisSieb. et Zucc. seedling what was in UV-B stress which had been enhanced by exogenous NO. [Method] Four groups in this experiment were set up: ① CK; ② SNP (0.01 mmol/L), ③ UV-B (4.22 kJ/(m2·d), ④ SNP (0.01 mmol/L)+UV-B(4.22 kJ/(m2·d).Then took samples from each group and measured physiological indexes when they had been disposed 1, 3, 5, 7, 9 days. [Result] Adding exogenous NO had not only significantly increased the photosynthetic pigment content ofPinuskoraiensisseedling needles but also reduced damage of UV-B to photosynthesis. Adding exogenous NO reduced damage of UV-B stress to the membrane relatively permeability ofPinuskoraiensisseedling needles cytomembrane and accumulation of MDA content. Not only UV-B-dispose but SNP+UV-B-dispose could raise activity of APX, SOD and POD. [Conclusion] As the plant defense reaction signal molecule, NO partook reply and defense ofPinuskoraiensisseedling to UV-B-dispose widely. Exogenous NO could relievePinuskoraiensisseedling oxidation harm from UV-B radiation evidently.

Exogenous nitric oxide; UV-B radiation;Pinuskoraiensis; Physiological indexes

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項(2572015CA03)；黑龍江省科學(xué)院科學(xué)研究基金項目；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項(2572014EA01-02)。

魏曉雪(1982-)，女，黑龍江蘭西人，助理研究員，博士，從事植物生理生態(tài)方面的研究。*通訊作者，副教授，博士，從事植物生理生態(tài)方面的研究。

2015-04-20

S 791.247

A

0517-6611(2015)17-009-03