李 楊，楊向東，谷合勇，王 靜，張 斌，史憲偉＊

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院云南省動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明云南650201；2.昆明云嶺廣大種禽飼料有限公司，云南昆明650215；3.昆明學(xué)院農(nóng)學(xué)院，云南昆明650214）

雞的色素性狀，包括羽色、膚色、脛色、喙色、冠色、耳葉和內(nèi)臟組織等顏色，不僅是品種的重要特征，也與經(jīng)濟(jì)價(jià)值密切相關(guān)。雞膚色主要有白膚色、黃膚色和黑膚色3種類(lèi)型。黃膚色與黃類(lèi)胡蘿卜素在皮膚的沉積有關(guān)，主要受β－胡羅卜素雙氧酶2（BCDO2）基因變異和表達(dá)影響［1］。黑皮膚的表現(xiàn)與真黑色素與褐黑素在皮膚的沉積量與比例相關(guān)［2］。到目前為止，控制皮膚黑色素的主效基因還未見(jiàn)報(bào)道。

SLC24A5（solute carrier family 24，member 5）是溶質(zhì)載體24家族的一個(gè)成員，是依賴(lài)于鉀離子的鈉／鈣陽(yáng)離子交換體［3］。自Lamason等［4］揭示斑馬魚(yú)的金色表型是由SLC24A5基因突變以來(lái)，該基因與不同種族人群膚色的關(guān)系一直是研究熱點(diǎn)。SLC24A5基因第3外顯子的1個(gè)功能SNP是不同人種膚色變化的主要原因［5］，同時(shí)，該基因已作為人類(lèi)系統(tǒng)發(fā)育的1個(gè)重要祖先信息標(biāo)記［6］。雞SLC24A5基因位于10號(hào)染色體，編碼423個(gè)氨基酸。羅娟等［7］研究了SLC24A5基因在白來(lái)航雞、烏骨雞和北京油雞不同組織的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)烏骨雞皮膚、肌肉及眼睛中SLC24A5基因表達(dá)量均顯著高于非烏骨雞［7］。本課題組已研究了SLC24A5基因多態(tài)性與他留烏骨雞羽色和膚色性狀的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)SLC24A5基因變異與膚色性狀呈顯著相關(guān)［8］。

瓢雞是中國(guó)“十一五”期間畜禽品種資源調(diào)查發(fā)現(xiàn)的特有珍稀品種，中心產(chǎn)區(qū)為云南普洱市鎮(zhèn)沅縣，無(wú)尾性狀是該品種的重要特性，其特征為無(wú)尾椎骨、尾棕骨、尾脂腺，無(wú)主尾羽、鐮羽［9－10］。貢潘偏抽等分析了瓢雞mtDNA D－loop序列，揭示瓢雞具有較高的遺傳多樣性和較復(fù)雜的母系來(lái)源［11］。除無(wú)尾性狀為該品種的典型特征外，黑膚（烏質(zhì)）性狀也是該品種的一個(gè)重要特點(diǎn)。自然群體雖以黑膚瓢雞為主，也存在一定數(shù)量的白膚瓢雞。為了揭示瓢雞黑膚和白膚性狀的遺傳差異，本研究采用錯(cuò)配PCRRFLP技術(shù)研究云南瓢雞SLC24A5基因第4外顯子多態(tài)性，分析其與膚色性狀的關(guān)聯(lián)，以期為云南地方雞種羽色膚色選擇尋找有效的遺傳標(biāo)記，為中國(guó)地方雞種的保種利用提供相應(yīng)的分子遺傳學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源

本研究96只瓢雞樣品取自云南省鎮(zhèn)沅縣瓢雞保種場(chǎng)，其中白膚色雞52只，黑膚色雞44只。采樣時(shí)記錄每只雞的性別、年齡、膚色及家系來(lái)源，受試雞只彼此無(wú)血緣關(guān)系。利用肝素鈉抗凝真空采血管從翅靜脈采集全血3～5mL，4℃運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，－20℃保存。

1.2 基因組DNA提取與檢測(cè)

每只雞取全血5～10μL，采用蛋白酶K與酚／氯仿標(biāo)準(zhǔn)提取法提取雞基因組DNA。提取的DNA樣品用1%凝膠電泳檢測(cè)，TE緩沖液稀釋備用。

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)雞SLC24A5全基因序列（NCBI登錄號(hào)：NW＿003763854.1），利用primer3（V.0.4.0）在線引物設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)1對(duì)引物擴(kuò)增瓢雞SLC24A5基因第3至第5外顯子區(qū)域，引物序列為：正向引物序列為（SLC24A5－F1）5＇－AGGCTACATTTGCAACGGTTTA－3＇；反向引物序列為（SLC24A5－R1）5＇－GCTATGCCAAAACAGGTCAGAT－3＇，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為1 121bp。

根據(jù)SLC24A5基因C482GSNP所在位置，重新設(shè)計(jì)一對(duì)錯(cuò)配PCR－RFLP檢測(cè)引物，引入Nhe I酶切識(shí)別位點(diǎn)，用于建立雞SLC24A5基因錯(cuò)配N(xiāo)he I PCR－RFLP遺傳標(biāo)記。引物的正向序列（SLC24A5－Nhe I F）：5＇TGCAGCATGCGGGCTGCTCGCTA3＇；反向序列（SLC24A5－Nhe I R）：5＇TCTAAACAGCGGCCAACAGGATA3＇，擴(kuò)增片段產(chǎn)物為389bp。

1.4 PCR擴(kuò)增及測(cè)序

雞SLC24A5基因的PCR擴(kuò)增總體積為50 μL，包含5.0μL 10×buffers，1μL dNTPs（2.5 mmol），1.5μL正向和反向引物（10μmol），0.5μL Taq酶（10U／μL），4μL模板DNA（約50ng），36.5μL ddH2O。PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性3 min；94℃變性45s，58℃退火45s，72℃延伸90 s，40個(gè)循環(huán)；72℃延伸8min；4℃保存。

從白膚色和黑膚色兩個(gè)群體各隨機(jī)選取6個(gè)個(gè)體進(jìn)行PCR擴(kuò)增與測(cè)序，檢測(cè)SLC24A5變異位點(diǎn)。利用正反兩個(gè)引物雙向測(cè)序，測(cè)序公司為中美泰和生物科技有限公司（北京，中國(guó)）。

1.5 SLC24A5基因NheI PCR－RFLP分子標(biāo)記的建立

雞SLC24A5基因Nhe I PCR－RFLP檢測(cè)技術(shù)采用滕召純等［8］建立的方法。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

利用BioEdit（2.0）軟件查看序列質(zhì)量，DNAS－ tar（5.0）軟件包SeqMan程序查看變異位點(diǎn)，MegAlign程序進(jìn)行序列比對(duì)。采用Excel軟件計(jì)算基因頻率、基因型頻率、多態(tài)信息含量（PIC）與基因雜合度（He），利用SPSS（19.0）統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行基因型與膚色χ2獨(dú)立性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞SLC24A5基因PCR產(chǎn)物擴(kuò)增結(jié)果

以瓢雞血液基因組DNA為模板，用SLC24A5－F1／R1引物擴(kuò)增，擴(kuò)增區(qū)域?yàn)镾LC24A5基因第3至第5外顯子區(qū)域，長(zhǎng)度為1 121bp。PCR擴(kuò)增得到與預(yù)期片段大小一致的產(chǎn)物，擴(kuò)增效果良好，可用于后續(xù)的DNA測(cè)序和RFLP分析。

2.2 基因測(cè)序與SNP檢測(cè)

從白膚色和黑膚色雞群隨機(jī)各選取6只瓢雞進(jìn)行個(gè)體測(cè)序，NCBI Blast同源性比較，所測(cè)序列與GenBank的SLC24A5基因序列（基因登錄號(hào)：NW＿003763854.1）的同源性達(dá)98%以上，證明擴(kuò)增的產(chǎn)物為瓢雞SLC24A5基因。瓢雞個(gè)體間序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，在第4外顯子編碼區(qū)出現(xiàn)變異，該變異在482位核苷酸由G變?yōu)镃（c.G 482C），為異義突變，引起161位蘇氨酸變?yōu)榻z氨酸（T161S）。圖1是G 482C位點(diǎn)SNP所在位置的測(cè)序峰圖。

2.3 瓢雞SLC24A5基因錯(cuò)配N(xiāo)he I PCR－RFLP基因型檢測(cè)

采用錯(cuò)配RFLP技術(shù)，新設(shè)計(jì)的引物（SLC24A5 Nhe I F／SLC24A5 Nhe I R）引入1個(gè)Nhe I酶切位點(diǎn)，建立SLC24A5基因錯(cuò)配N(xiāo)he I PCR－RFLP標(biāo)記。PCR擴(kuò)增瓢雞DNA，得到1條389bp片段，經(jīng)NheI酶切后，出現(xiàn)3種基因型，GG型為363bp與26bp兩個(gè)片段，CC型為389bp 1個(gè)片段，GC型為389bp，363bp與26bp 3個(gè)片段。SLC24A5基因錯(cuò)配N(xiāo)he I PCR－RFLP檢測(cè)電泳圖見(jiàn)圖2。

2.4 多態(tài)信息含量（PIC）與群體雜合度（He）

根據(jù)基因型頻率與基因頻率（表1），計(jì)算了PIC和He兩個(gè)基因多態(tài)性指標(biāo)，瓢雞SLC24A5基因SNP的PIC為0.328，He為0.4160，均處于中度多態(tài)程度，表明瓢雞在膚色性狀方面受到自然選擇和人工選擇的影響較小。

2.5 SLC24A5基因G482C與膚色的相關(guān)性分析

利用錯(cuò)配N(xiāo)he I PCR－RFLP標(biāo)記對(duì)瓢雞SLC24A5基因進(jìn)行個(gè)體基因分型，基因型頻率、基因頻率及χ2獨(dú)立性檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。從表1可知，G等位基因在白膚色群體和黑膚色群體均為優(yōu)勢(shì)基因，而黑膚色群體C等位基因頻率（0.372）略高于白膚色（0.24）。兩個(gè)群體基因型間χ2獨(dú)立性檢驗(yàn)達(dá)到顯著水平（P＝0.023）。統(tǒng)計(jì)分析表明，SLC24A5基因G482C位點(diǎn)與瓢雞膚色具有一定的相關(guān)性。

圖1 瓢雞SLC24A5基因G482C位點(diǎn)SNP測(cè)序峰圖Fig.1 Sequencing image of SLC24A5gene G482C SNP in Piao chicken

圖2 瓢雞SLC14A5基因Nhe I PCR－RFLP電泳圖M.DGL2000分子量標(biāo)記，1.GG基因型；2.GC基因型；3.CC基因型Fig.2 NheI PCR－RFLP image of SLC24A5gene in Piao chickenM.DGL 2000molecular marker；1.GG genotype；2.GC genotype；3.CC genotype

表1 瓢雞SLC24A5基因G482C與膚色性狀相關(guān)分析表Table 1 Association between SLC24A5G482Cgenotypes and skin color in Piao chicken

3 討 論

本研究采用錯(cuò)配PCR－RFLP技術(shù)研究了SLC24A5基因外顯子4的1個(gè)功能SNP與雞膚色性狀的相關(guān)性。該SNP序列（CTGCTCTCTA［C／G］CGTGGTAAGA）不能被現(xiàn)有的限制性?xún)?nèi)切酶所識(shí)別，常規(guī)的RFLP技術(shù)無(wú)法檢測(cè)該位點(diǎn)SNP基因型。本文在SNP位點(diǎn)前方新設(shè)計(jì)了1個(gè)引物（SLC24A5－Nhe I F：5＇TGCAGCATGCGGGCTGCTCGCTA3＇），改變了引物3＇第4位堿基，由原來(lái)的堿基T變?yōu)閴A基G，這樣擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物就引入了Nhe I酶切位點(diǎn)（G＾CTAGC），擴(kuò)增產(chǎn)物既能被內(nèi)切酶消化產(chǎn)生不同基因型片段，又不改變?cè)械腟NP序列。該技術(shù)對(duì)沒(méi)有內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)而又有重要功能的單個(gè)SNP檢測(cè)，是1種花費(fèi)不高且快速簡(jiǎn)便的方法。

雞膚色主要有白色、黃色和黑色3種類(lèi)型，白皮膚屬于祖先型，對(duì)黃皮膚和黑皮膚均為顯性（W＊W），黃皮膚為隱性（W＊Y），黑皮膚為不完全顯性（W＊B）［12］。到目前為止，已揭示BCDO2基因是控制黃皮膚的主效基因［1］，而黑膚色的主效基因還未見(jiàn)報(bào)道。有人比較MC1R基因、SLC24A5基因和TYR基因在他留烏骨雞不同羽色和膚色性狀間的遺傳差異，結(jié)果顯示，MC1R基因和TYR基因與羽色有一定關(guān)系，而SLC24A5基因與膚色（烏質(zhì)性狀）性狀顯著相關(guān)［8，13］。本文對(duì)SLC24A5基因G482C在瓢雞兩個(gè)不同膚色群體的研究表明，雖然基因型與膚色的相關(guān)性在兩個(gè)品種中都達(dá)到顯著水平，但基因型分布和等位基因頻率卻相差較大。如他留烏骨雞黑膚色（烏質(zhì)）群體中G基因頻率為0.62，與瓢雞黑膚色群體 G基因頻率很接近（0.63），但在非烏骨群體中，他留烏骨雞的C等位基因?yàn)?.73，而在瓢雞則為0.24。顯然，除SLC24A5基因之外，還會(huì)有其他基因也參與雞皮膚色素的沉積與擴(kuò)散。另外，SLC24A5基因在不同雞種基因頻率的差異可能不僅與膚色性狀有關(guān)，還與雞種的遺傳背景以及基因純合度有關(guān)。

［1］ Eriksson J，Larson G，Gunnarsson U.Identification of the yellow skin gene reveals a hybrid origin of the domestic chicken［J］.PLoS Genet，2008，4（2）：e1000010.

［2］ Chedekel M R，Subbarao K V，Bhan P，et al.Biosynthetic and structural studies on pheomelanin［J］.Biochim Biophys Acta，1987，12（2）：239－243.

［3］ Quillen E E，Shriver M D.SLC24A5：exchanging genetic and biochemical knowledge［J］.Pigment Cell Melanoma Res，2008， 21（3）：344－345.

［4］ Lamason R L，Mohideen M A，Mest J R，et al.SLC24A5，a putative cation exchanger，affects pigmentation in zebrafish and humans［J］.Science，2005，310（5755）：1 782－1 786.

［5］ Stokowski R P，Pant P V K，Dadd T，et al.A genomewide association study of skin pigmentation in a south asian population［J］.Am J Hum Genet，2007，81（6）：1 119－1 132.

［6］ Giardina E，Pietrangeli I，Martinez－Labarga C.Haplotypes in SLC24A5gene as ancestry informative markers in different populations［J］.Current Genomics，2008，9（2）：110－114.

［7］ 羅 娟，張 煒，于 冰，等.雞SLC24A5基因的cDNA克隆、表達(dá)分析及其與黑色素沉積的關(guān)系研究［J］.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2008，35（1）：69－76.

［8］ 滕召純，孫利民，陸曉屏，等.他留烏骨雞SLC24A5基因Nhe I mismatch PCR－RFLP標(biāo)記與羽色及膚色相關(guān)性研究［J］.中國(guó)家禽，2014，36（15）：6－9.

［9］ 朱圖壽，謝強(qiáng)明，李才勇，等.瓢雞保護(hù)與利用的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2011，38（5）：250－252.

［10］ 宋 遲，韓 威，胡 艷，等.無(wú)尾瓢雞尾部骨骼缺失觀察［J］.中國(guó)家禽，2014，36（18）：53－56.

［11］ 貢潘偏抽，劉麗仙，李大林，等.基于線粒體DNA控制區(qū)（mtDNA D－loop）序列分析瓢雞的遺傳多樣性［J］.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2011，26（2）：211－214.

［12］ Smyth J R.Genetic of plumage，skin and eye pigmentation in chickens［M］∥Crawford R D.Poultry Breeding and genetics.Amsterdam：Elsevier，1990：109－167.

［13］ 滕召純，陸嘵屏，王玉祥，等.MC1R基因TaqⅠPCR－RFLP標(biāo)記與他留烏骨雞羽色性狀的相關(guān)性研究［J］.中國(guó)家禽，2013，35（20）：11－14.