李歡 李清懷 李筱雨 嚴(yán)麗 張霖雷

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)時(shí)最常見的并發(fā)癥，其中，一部分患者進(jìn)展為急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)，是 SAP 患者早期死亡的主要原因［1］。目前，對(duì)重癥急性胰腺炎合并急性肺損傷的自然發(fā)病的詳細(xì)過程還不甚明了，尤其是對(duì)其肺功能損傷的自然病程還沒有一個(gè)完整的監(jiān)測(cè)，其確切的發(fā)病機(jī)制也很不清楚。本文通過人工誘導(dǎo)建立大鼠SAP模型，在零干預(yù)的情況下，系統(tǒng)完整的監(jiān)測(cè)SAP合并ALI的病理生理演變過程及肺損傷的發(fā)生率及程度，動(dòng)態(tài)觀察反映肺損傷的各項(xiàng)指標(biāo)，為臨床提供診療參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 于2008年1月至2009年1月選取健康雄性SD大鼠240只(購自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)為觀察組研究對(duì)象，清潔級(jí)，體重250～300 g，平均體重(274.2 ±12.4)g，月齡1 ～3 個(gè)月，平均(1.8±0.9)個(gè)月。按照隨機(jī)數(shù)字表將240只大鼠隨機(jī)均分為 SAP 不同時(shí)間點(diǎn)組(SAP 1 h、3 h、6 h、9 h、12 h、18 h、24 h組，觀察組)和對(duì)照組，每組30只。各組大鼠體重、月齡等一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

1.2 模型制備 大鼠實(shí)驗(yàn)前14 h開始禁食，自由飲水，參照Aho等［2］的方法制備SAP模型。10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉，上腹正中切口進(jìn)入腹腔，顯露胰膽管，以血管夾阻斷近肝門處胰膽管后，用4 G鈍頭頭皮靜脈針于十二指腸乳頭附近經(jīng)十二指腸腸系膜壁穿刺，逆行插入胰膽管，在十二指腸乳頭處用無創(chuàng)血管夾夾閉膽總管末端，將3.5%?；悄懰徕c溶液用微量注射器按0.1 ml/100 g以恒速(0.1 ml/min)注入胰膽管，注射完畢后于注射孔捏閉胰膽管5 min，去掉血管夾，常規(guī)關(guān)腹。對(duì)照組大鼠進(jìn)入腹腔后僅翻動(dòng)十二指腸部數(shù)次即關(guān)腹。造模后，所有大鼠均皮下注射0.9%氯化鈉溶液5 ml，以補(bǔ)充血容量的不足。每組大鼠 SAP模型制備成功后于 1 h、3 h、6 h、9 h、12 h、18 h和24 h分批取材。

1.3 觀察指標(biāo) (1)血清淀粉酶;(2)肺組織濕干重比:肺組織濕/干重比=(肺濕重－肺干重)/肺干重;(3)肺髓過氧化物酶(MPO)活性:濕重=(測(cè)定管OD值－對(duì)照管OD值)/11.3×取樣量(g);(4)肺通透性指數(shù):肺通透性指數(shù)=血清蛋白濃度/肺泡灌洗液蛋白濃度。

1.4 肺損傷病理學(xué)評(píng)分 每張病理切片隨機(jī)選擇3個(gè)高倍視野(×400)分別評(píng)分，然后取平均值為此切片的得分。肺組織學(xué)評(píng)分按改良的Aho等［2，3］的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分。見表1。

表1 肺損傷病理學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，正態(tài)資料采用Oneway ANOVA，偏態(tài)資料采用秩和檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠血清淀粉酶檢測(cè) 對(duì)照組大鼠血清淀粉酶含量為(596.9 ± 248.13)U/L，觀察組 1 h、3 h、6 h、9 h、12 h、18 h 和24 h 組分別為(1 437.9 ±331.97)、(2 052.0 ±290.44)、(3 152.9 ±301.39)、(4 944.58±308.545)、(5 162.8 ±315.98)、(8 236.7 ±381.97)和(11 800.0 ±200.75)U/L;觀察組各時(shí)間點(diǎn)組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，觀察組各時(shí)間點(diǎn)組內(nèi)除9 h與12 h組外比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 大鼠肺組織的病理學(xué)變化

2.2.1 肉眼觀察:對(duì)照組肺組織肉眼觀察正常，無胸水。觀察組1 h組肺組織輕度水腫，無明顯胸水。3 h組觀察肺組織水腫較前加重，肺表面顏色變紅，少量黃色胸水。6 h組肺組織水腫加劇，肺表面可見散在小出血點(diǎn)。9 h組肺組織水腫更重，胸腔積液量增加，肺表面顏色暗紅，出血點(diǎn)增多。12 h組肺水腫更重，肺組織表面可見空泡及斑片狀出血，大量混濁胸腔積液。18 h組肺組織腫脹，表面局部萎陷，出血壞死范圍增大，胸腔積液淡血性。24 h組肺組織腫脹嚴(yán)重，彌漫出血壞死，血性胸腔積液。見圖1、2。

圖1 正常大鼠肺組織(HE×400)

圖2 SAP大鼠24 h后肺組織(HE×400)

2.2.2 光鏡下觀察:對(duì)照組肺組織結(jié)構(gòu)基本正常。觀察組1 h組肺間質(zhì)輕度水腫、充血，單核細(xì)胞及少量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。3 h組肺間質(zhì)水腫、充血更明顯，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)增多。6 h組間質(zhì)水腫、充血更重，大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，偶見肺泡內(nèi)出血。9 h組肺間質(zhì)廣泛水腫、充血及炎細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡內(nèi)出血增多。12 h組肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，部分肺泡融合，間質(zhì)出血、水腫嚴(yán)重，肺泡及氣管內(nèi)出血，大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。18 h組可見部分肺泡塌陷，灶性肺不張。24 h組可見片狀肺不張，部分肺泡透明膜形成。

2.3 大鼠肺損傷相關(guān)指標(biāo)變化 觀察組大鼠肺損傷組織評(píng)分隨時(shí)間延續(xù)逐漸升高，各時(shí)間點(diǎn)組均明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)，觀察組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)之間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。觀察組大鼠肺組織濕干重比隨時(shí)間的延續(xù)呈逐漸增加趨勢(shì)，除觀察組1 h組肺濕/干重比與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外其余觀察組各組與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。觀察組肺通透性指數(shù)隨時(shí)間延續(xù)呈逐漸降低趨勢(shì)，均低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，觀察組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)之間除18 h和24 h組外比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。觀察組肺髓過氧化物酶(MPO)水平隨時(shí)間延續(xù)持續(xù)升高，明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，觀察組組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)之間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表2。

2.4 相關(guān)性分析 肺組織MPO水平與肺損傷評(píng)分存在正相關(guān)(r=0.946，P＜0.01)，肺濕干重比與肺損傷評(píng)分成正相關(guān)(r=0.879，P＜0.01)，肺通透性指數(shù)與肺損傷評(píng)分存在負(fù)相關(guān)(r=－0.859，P＜0.01)。

表2 重癥急性胰腺炎大鼠肺損傷的病理生理變化情況n=30，±s

表2 重癥急性胰腺炎大鼠肺損傷的病理生理變化情況n=30，±s

注:與對(duì)照組比較，*P ＜0.05;與術(shù)后1 h組比較，#P ＜0.05;與術(shù)后1 h組比較，△P ＜0.05;與術(shù)后6 h組比較，☆P ＜0.05;與術(shù)后9 h組比較，▲P ＜0.05;與術(shù)后12 h組比較，★P ＜0.05;與術(shù)后18 h組比較，□P ＜0.05

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3 討論

SAP是臨床常見的急腹癥之一，它不僅引起胰腺本身及胰周的炎性腫脹、滲出和壞死，而且常導(dǎo)致全身重要臟器功能的損害，是一種發(fā)病急、進(jìn)展快、并發(fā)癥多、死亡率高的嚴(yán)重疾病，死亡率可達(dá)20% ～40%。SAP時(shí)常并發(fā)MODS，成為SAP的主要死亡原因。其中，SAP并發(fā)ALI的發(fā)病率占合并多器官功能衰竭的首位［1］。SAP并發(fā)ALI病情兇險(xiǎn)，病死率高，其發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜。

ALI和ARDS是急性胰腺炎導(dǎo)致腹外器官功能不全最常見的表現(xiàn)，有作者稱之為急性胰腺炎相關(guān)性肺損 傷 (acutepancreatitis associated lung injury，APALI)［4］。ALI/ARDS是在嚴(yán)重感染、休克、創(chuàng)傷及燒傷等非心源性疾病過程中，肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞損傷造成彌漫性肺間質(zhì)及肺泡水腫，導(dǎo)致的急性低氧性呼吸功能不全或衰竭。以肺容積減少、肺順應(yīng)性降低、嚴(yán)重的通氣/血流比例失調(diào)為病理生理特征，臨床上表現(xiàn)為進(jìn)行性低氧血癥和呼吸窘迫。ALI/ARDS的基本病理生理改變是肺泡上皮和肺毛細(xì)血管內(nèi)皮通透性增加所致的非心源性肺水腫。由于肺泡水腫、肺泡塌陷導(dǎo)致嚴(yán)重通氣/血流比例失調(diào)，特別是肺內(nèi)分流明顯增加，從而產(chǎn)生嚴(yán)重的低氧血癥［5］。

SAP時(shí)，中性粒細(xì)胞聚集激活是引起肺部毛細(xì)血管和肺泡受損的主要原因。正常情況下，間質(zhì)內(nèi)中性粒細(xì)胞(poly-morphonuclear neutrophil，PMN)數(shù)量相當(dāng)少。在SAP時(shí)發(fā)生SIRS，循環(huán)血液中的各種細(xì)胞因子如 IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α 和炎性介質(zhì)誘導(dǎo)肺中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞激活，引起ALI，早期肺細(xì)胞產(chǎn)生多種趨化物質(zhì)如血小板活化因子(PAF)、TNF-α、補(bǔ)體C5a，趨化激活中性粒細(xì)胞、單核和淋巴細(xì)胞，使大量PMN遷移、聚集于肺循環(huán)中，粘附于肺毛細(xì)血管表面并釋放一系列損害內(nèi)皮細(xì)胞的有害物質(zhì)［6，7］。

本文使用3.5%?；悄懰徕c溶液逆行注射大鼠胰膽管［8］，制備大鼠SAP模型，SAP 1 h組血清淀粉酶比對(duì)照組明顯升高(P＜0.05)，表示SAP模型建立成功。SAP發(fā)生后，隨著SAP病程的進(jìn)展，肺組織的損傷逐漸加重，APALI的嚴(yán)重程度與胰腺病變程度密切相關(guān)，這與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道相符合。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí):SAP大鼠1 h已有肺間質(zhì)輕度水腫、充血，單核細(xì)胞及少量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，反映中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)程度的指標(biāo)MPO活性顯著增高，這表明肺臟在SAP后1 h時(shí)已經(jīng)有了一定程度的損傷，且病理學(xué)評(píng)分明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)。隨著時(shí)間的推移肺組織呈現(xiàn)出典型的ALI病理生理改變，病理學(xué)評(píng)分逐漸升高，SAP 3 h至12 h肺間質(zhì)水腫、充血，肺實(shí)質(zhì)水腫、出血，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)逐漸加重;到18 h組可見部分肺泡塌陷，灶性肺不張;24 h組可見肺泡透明膜形成。

MPO是中性粒細(xì)胞(PMN)特有的還原酶，它主要存在于PMN的嗜天青顆粒中，能催化H2O2與CL-形成次氯酸，次氯酸具有明顯的細(xì)胞毒作用［9］。而且每個(gè)細(xì)胞所含MPO的量是恒定的，故而可通過測(cè)定組織MPO活性來反映PMN的數(shù)目，肺組織PMN細(xì)胞數(shù)目與肺組織中的MPO的活力成正比。通過測(cè)定MPO的活力，可以明確PMN在肺組織中浸潤(rùn)的程度，也可以了解MPO對(duì)組織造成的損傷。本研究結(jié)果顯示，對(duì)照組MPO活性很低，SAP制模后1 h時(shí)肺組織MPO活性明顯增加(P＜0.05)，且隨時(shí)間延長(zhǎng)其增加更顯著，并且肺組織MPO活性與肺損傷評(píng)分存在正相關(guān)(r=0.946，P＜0.01)，說明 SAP 1 h 時(shí)肺組織中已出現(xiàn)中性粒細(xì)胞的扣押與聚集，并已造成肺組織的損傷，并隨時(shí)間延長(zhǎng)SAP組肺組織中PMN的浸潤(rùn)愈發(fā)增多。目前認(rèn)為中性粒細(xì)胞的激活并浸潤(rùn)到胰腺及胰腺外組織，通過呼吸爆發(fā)釋放出大量氧自由基、蛋白水解酶等毒性物質(zhì)是胰腺炎加重并伴發(fā)MOF的主要因素［10］。激活的PMN釋放的大量炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子，進(jìn)一步損傷微血管內(nèi)皮細(xì)胞，破壞內(nèi)皮細(xì)胞的完整性，最終引起肺肺血管通透性增加，造成肺間質(zhì)水腫、出血，肺出血壞死及肺泡透明膜形成。所以，臨床可以用MPO作為炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的檢測(cè)指標(biāo)。

肺通透性指數(shù)和肺組織濕干重比是衡量肺損傷程度的重要指標(biāo)?？煞从撤谓M織的水腫、滲出程度。本研究結(jié)果顯示隨著SAP的發(fā)生，肺組織濕干重比逐漸升高，肺通透性指數(shù)逐漸降低，提示肺損傷逐漸加重，表現(xiàn)為肺毛細(xì)血管內(nèi)皮和肺泡上皮通透性增加，導(dǎo)致非特異性的肺水腫、肺間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，并伴有肺毛細(xì)血管充血，富含蛋白的水腫液滲出到間質(zhì)和肺泡中，與纖維素、變性壞死脫落的I型上皮細(xì)胞和基膜共同形成透明膜。最初由夏淑晶等［11］報(bào)道，在雨蛙肽誘導(dǎo)的大鼠AP模型中，ALI特征包括:3 h時(shí)肺泡毛細(xì)血管通透性增加1.8倍，肺濕重增加1.5倍;6 h時(shí)肺泡間質(zhì)明顯出血，血管內(nèi)皮細(xì)胞破壞。假手術(shù)組相應(yīng)的肺組織的濕干重比及肺通透性指數(shù)也低，肺組織未出現(xiàn)損傷。SAP組相應(yīng)的肺濕干重比及肺通透性指數(shù)相應(yīng)增高，肺病理改變加重。且本研究得出肺濕干重比與肺病理學(xué)評(píng)分二者存在正相關(guān)(r=0.879，P＜0.01)，肺通透性指數(shù)與肺病理學(xué)評(píng)分二者存在負(fù)相關(guān)(r=0.859，P＜0.01)。

綜上所述，SAP大鼠肺損傷的發(fā)生率及損傷程度隨SAP病程延長(zhǎng)而逐漸增加，肺組織MPO水平持續(xù)升高。隨著人們對(duì)SAP、MODS及APALI的發(fā)病機(jī)制的深入了解，特別是對(duì)早期SIRS調(diào)控機(jī)制研究的不斷進(jìn)展，我們將會(huì)對(duì)SAP肺損傷的發(fā)生、發(fā)展過程有更加清晰的認(rèn)識(shí)。

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