楊盛茹，丁長河，惠 明，殷麗君

（1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 食品系，河南 鄭州 450044；2.河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001）

0 引言

近年來，各國學(xué)者對(duì)燃料乙醇的研究逐漸深入，生產(chǎn)工藝也在不斷改進(jìn).目前乙醇生產(chǎn)的重要技術(shù)分別是超高濃度（VHG，very high gravity）乙醇發(fā)酵工藝和纖維素乙醇工藝[1-2].纖維素乙醇工藝可節(jié)約原材料成本，但預(yù)處理纖維素原材料時(shí)存在衍生問題；乙醇發(fā)酵可節(jié)約能耗成本，但底物的超高濃度抑制酵母菌的生長和發(fā)酵[3-5].學(xué)者通過研究補(bǔ)料發(fā)酵調(diào)控策略將補(bǔ)料發(fā)酵技術(shù)運(yùn)用于這兩大乙醇生產(chǎn)工藝，在解決二者的上述問題方面呈現(xiàn)出一定的潛力[6].

近年來研究主要涉及補(bǔ)料時(shí)間、補(bǔ)料成分以及補(bǔ)料策略等方面[6]；宋向陽等[7]以樹干畢赤酵母為菌種對(duì)搖瓶條件下木糖補(bǔ)料發(fā)酵進(jìn)行研究，得出總糖濃度100 g/L、發(fā)酵28 h 內(nèi)、補(bǔ)料2 次效果最佳，與一次性投料相比乙醇質(zhì)量濃度提高了10.36%，達(dá)到37.49 g/L；楊功勛[8]通過將補(bǔ)料工藝和通氣策略相結(jié)合，有效地提高了菌體的存活率，使得乙醇生產(chǎn)速率提高了36%，乙醇質(zhì)量濃度提高了19%；Unrean 等[9]研究樹干畢赤酵母發(fā)酵葡萄糖和木糖混合物生產(chǎn)乙醇時(shí)，以動(dòng)力學(xué)模型確定最佳補(bǔ)料培養(yǎng)基和補(bǔ)料策略，與分批發(fā)酵相比，乙醇產(chǎn)率和乙醇產(chǎn)量分別高出2 倍和1.3 倍，乙醇質(zhì)量濃度為40.7 g/L.

本試驗(yàn)在前期系統(tǒng)研究基礎(chǔ)上[10]，進(jìn)一步研究5 L 發(fā)酵罐條件下補(bǔ)料工藝對(duì)樹干畢赤酵母生長規(guī)律和發(fā)酵生成乙醇的影響，以期進(jìn)一步提高木糖利用率和乙醇產(chǎn)量，為燃料乙醇的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論和技術(shù)基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)菌種

樹干畢赤酵母（P.stipitis）m4：石蠟冷凍 保藏，由河南工業(yè)大學(xué)保存.

1.1.2 試驗(yàn)培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基：木糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，瓊脂粉20 g/L，酵母膏10 g/L，pH 自然，121 ℃、0.1 MPa下滅菌15 min，其中木糖與其他物質(zhì)分開單獨(dú)滅菌.

種子培養(yǎng)基：木糖150 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母 膏10 g/L，（NH4）2SO40.2 g/L，F(xiàn)eSO4[7H2O]50 mg/L，MnCl2[4H2O]25 mg/L，ZnSO4[7H2O]11 mg/L，pH 自然，121 ℃、0.1 MPa 下滅菌15 min，其中木糖與其他物質(zhì)分開單獨(dú)滅菌.

發(fā)酵培養(yǎng)基：木糖（依據(jù)試驗(yàn)具體要求稱量），蛋白胨20 g/L，酵母膏10 g/L，（NH4）2SO40.2 g/L，生物素0.5 mg/L，F(xiàn)eSO4[7H2O]50 mg/L，MnCl2[4H2O]25 mg/L，ZnSO4[7H2O]11 mg/L，pH 4.8.在發(fā)酵罐中121 ℃、0.1 MPa 下高壓蒸汽滅菌30 min，其中生物素用0.22 μm 膜過濾除菌，木糖與其他物質(zhì)分開單獨(dú)滅菌.

硫酸鋅、硫酸銨、生物素、氯化錳、硫酸亞鐵：分析純，洛陽市化學(xué)試劑廠；酵母膏、蛋白胨：生化試劑，北京奧博星生物技術(shù)公司；瓊脂粉：生化試劑，上海山浦化工有限公司.

1.1.3 主要儀器

BMR-A10USIP Auzone 5L 發(fā)酵罐：上海傲中生物工程設(shè)備有限公司；GC-2010 氣相色譜儀：日本島津公司；UV-1901 紫外可見分光光度計(jì)：上海尤尼柯有限公司.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 搖瓶種子培養(yǎng)

固體培養(yǎng)基活化培養(yǎng)P.stipitis m4：在無菌環(huán)境下將液體石蠟冷凍保藏的P.stipitis m4 菌體迅速接種到新鮮的培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)3 d.

取60 mL 滅過菌的種子培養(yǎng)基置入500 mL三角瓶中，在無菌環(huán)境下接種一環(huán)活化的酵母，在25 ℃、130 r/min 的條件下培養(yǎng).620 nm 下其吸光度值（OD620）超過50 時(shí)結(jié)束培養(yǎng)，經(jīng)5 000 r/min 離心10 min，后用無菌水溶解沉淀的酵母，放入4 ℃冰箱以作為發(fā)酵接種物.

1.2.2 發(fā)酵罐補(bǔ)料發(fā)酵

在發(fā)酵罐火焰圈保護(hù)下，將搖瓶培養(yǎng)好的種子按12.5%的接種量接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的5 L發(fā)酵罐中（工作體積為80%），控制溫度28 ℃、轉(zhuǎn)速300 r/min、通氣量30 L/h，自動(dòng)流加2 mol/L 氫氧化鈉控制pH 值4.8，在不同時(shí)間、不同流加次數(shù)補(bǔ)入新鮮物料，培養(yǎng)周期為84 h，每隔12 h 測其酵母濃度，并快速取出1 mL 發(fā)酵液置入離心管中，經(jīng)12 000 r/min 高速離心10 min，取其上清液測定乙醇質(zhì)量濃度和還原糖含量（木糖殘留量）.

1.2.3 分析方法

乙醇質(zhì)量濃度測定方法:氣相色譜法[11].

酵母濃度測定方法:濁度法[12].

木糖殘留量測定方法:3，5-二硝基水楊酸（DNS）法[13].

2 結(jié)果與討論

2.1 分批發(fā)酵中木糖濃度對(duì)乙醇生產(chǎn)的影響

試驗(yàn)研究了不同初始木糖濃度對(duì)分批發(fā)酵的影響，確定補(bǔ)料分批發(fā)酵試驗(yàn)中的木糖初始濃度以及總濃度.試驗(yàn)中木糖質(zhì)量濃度分別為108 g/L、150 g/L，其發(fā)酵規(guī)律如圖1、圖2 所示.

圖1 木糖濃度對(duì)酵母濃度與木糖殘留量的影響Fig.1 Effect of xylose content on the concentration of yeast and xylose residues

從圖1 可以看出，木糖質(zhì)量濃度不同，P.stipitis m4 的發(fā)酵規(guī)律不同且有明顯變化.當(dāng)菌種轉(zhuǎn)接到發(fā)酵液之后，酵母都經(jīng)過短暫的適應(yīng)后快速增長，木糖質(zhì)量濃度較低時(shí)酵母生長速率較大.隨著發(fā)酵時(shí)間延長，木糖逐漸被消耗，酵母增長速率均呈現(xiàn)降低趨勢，在發(fā)酵不到36 h 后木糖質(zhì)量濃度較高時(shí)酵母生長速率較大.在發(fā)酵60 h 后木糖大量被消耗，初始質(zhì)量濃度為108 g/L 的木糖殘留量僅為1.6 g/L，至此酵母濃度逐漸降低，至發(fā)酵84 h時(shí)木糖幾乎消耗完畢；而初始木糖為150 g/L 時(shí)在60 h 時(shí)仍有大量殘留，為35.3 g/L，至發(fā)酵結(jié)束時(shí)木糖仍有部分剩余，為13.1 g/L，而酵母濃度一直緩慢增加.

圖2 木糖質(zhì)量濃度對(duì)乙醇質(zhì)量濃度的影響Fig.2 Effect of xylose content on ethanol concentration

從圖2 可以看出，在發(fā)酵前60 h，木糖質(zhì)量濃度為108 g/L 的乙醇產(chǎn)量均明顯高于150 g/L 的.木糖質(zhì)量濃度為108 g/L 時(shí)，乙醇質(zhì)量濃度與酵母濃度變化趨勢相同，即在發(fā)酵60 h 達(dá)到最高值50.0 g/L 后開始下降.這是因?yàn)樵诎l(fā)酵后期，隨著木糖逐漸消耗，酵母利用乙醇作為碳源使得產(chǎn)量降低.而木糖為150 g/L 時(shí)，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，乙醇產(chǎn)量逐漸增加，直至發(fā)酵84 h 結(jié)束后，乙醇質(zhì)量濃度達(dá)到最大值49.0 g/L，木糖利用率為91.2%.可能是因?yàn)楫a(chǎn)物抑制或者是因?yàn)榈孜镔|(zhì)量濃度越高抑制作用越大，使得增加木糖質(zhì)量濃度而最終乙醇產(chǎn)量卻沒有明顯增大.

2.2 補(bǔ)料分批發(fā)酵對(duì)乙醇生產(chǎn)的影響

為進(jìn)一步提高乙醇質(zhì)量濃度和木糖轉(zhuǎn)化率，消除P.stipitis m4 發(fā)酵過程中高濃度底物的抑制作用，或者彌補(bǔ)底物濃度較低時(shí)限制酵母細(xì)胞生長發(fā)酵的缺陷，研究補(bǔ)料發(fā)酵試驗(yàn)，確定發(fā)酵初始木糖質(zhì)量濃度為108 g/L，控制木糖質(zhì)量總濃度為150 g/L.

2.2.1 補(bǔ)料時(shí)間對(duì)乙醇發(fā)酵的影響

在合適的時(shí)間加入木糖，會(huì)刺激微生物生長、提高糖分利用速度.補(bǔ)糖過早，濃度過高達(dá)不到補(bǔ)料的作用；補(bǔ)糖過晚，已合成的產(chǎn)物因底物抑制就會(huì)阻礙菌體的生長[14].試驗(yàn)中分別在發(fā)酵24 h、36 h、48 h 時(shí)一次性補(bǔ)加木糖，控制木糖總質(zhì)量濃度為150 g/L，研究結(jié)果如圖3 所示.

圖3 不同補(bǔ)料時(shí)間對(duì)乙醇發(fā)酵的影響Fig.3 Effect of feeding time on ethanol fermentation

從圖3 可以看出，發(fā)酵24 h 時(shí)木糖剩余量維持在70 g/L 左右，乙醇產(chǎn)量在20 g/L 左右.此時(shí)補(bǔ)料，酵母濃度雖逐漸增加，但是乙醇質(zhì)量濃度變化不明顯，發(fā)酵結(jié)束時(shí)濃度稍有增加，為50.5 g/L，木糖殘留量為10.3 g/L；在36 h 時(shí)，木糖含量為36.5 g/L，由于新鮮糖分的補(bǔ)入，酵母生長旺盛，發(fā)酵能力強(qiáng)，木糖含量迅速降低，最終乙醇質(zhì)量濃度達(dá)到53.4 g/L，此時(shí)木糖剩余量為5.7 g/L；發(fā)酵48 h 時(shí)酵母濃度（OD620）為44.3，乙醇含量已經(jīng)達(dá)到38.3 g/L，此時(shí)流加物料，糖濃度維持在60 g/L，此時(shí)酵母細(xì)胞濃度雖然大量增加但是最終乙醇含量并沒有明顯增加，最終為49.4 g/L，木糖殘留量為14.1 g/L.綜上所述，發(fā)酵36 h 為最佳補(bǔ)糖時(shí)間.

2.2.2 補(bǔ)加不同物料對(duì)乙醇發(fā)酵的影響

根據(jù)微生物培養(yǎng)基特點(diǎn)和生長狀態(tài)，補(bǔ)料發(fā)酵時(shí)流加的物料可以是全料培養(yǎng)基，也可以是單獨(dú)的碳源、氮源或者無機(jī)鹽等.試驗(yàn)中在發(fā)酵36 h時(shí)分別一次性流加木糖和全料培養(yǎng)基，結(jié)果如圖4所示.

圖4 補(bǔ)加不同物料對(duì)乙醇發(fā)酵的影響Fig.4 Effect of feeding different materials on ethanol fermentation

從圖4 可以看出，在發(fā)酵36 h 時(shí)分別一次性流加木糖和全料培養(yǎng)基，酵母濃度、木糖殘留量以及乙醇質(zhì)量濃度稍有變化.從圖4 可以看出，在發(fā)酵前36 h，與補(bǔ)加全料培養(yǎng)基的發(fā)酵相比，補(bǔ)加木糖發(fā)酵因其他營養(yǎng)成分較充足，酵母在轉(zhuǎn)接之后經(jīng)過短暫的適應(yīng)，其酵母濃度相對(duì)較高，而二者的乙醇生成量、木糖消耗量相似.在流加不同物料后，二者的酵母濃度、木糖消耗量并沒有太大的改變，最終乙醇質(zhì)量濃度維持在53 g/L 左右.在特定發(fā)酵條件和特定培養(yǎng)基下，補(bǔ)加全料培養(yǎng)基對(duì)于P.stipitis m4 發(fā)酵木糖生產(chǎn)乙醇影響不大.

2.2.3 補(bǔ)料次數(shù)對(duì)乙醇發(fā)酵的影響

補(bǔ)料次數(shù)越多造成發(fā)酵成本越高且染菌概率越大[14].試驗(yàn)中，在發(fā)酵36 h 時(shí)分別一次性流加木糖，在其前后完成兩次補(bǔ)料，結(jié)果如圖5 所示.

圖5 補(bǔ)料次數(shù)對(duì)乙醇發(fā)酵的影響Fig.5 Effect of feeding times on ethanol fermentation

從圖5 很明顯地看出，二者的木糖轉(zhuǎn)化利用情況相近，對(duì)于菌體，在經(jīng)過短暫的適應(yīng)后，36～60 h 內(nèi)酵母生長繁殖的速度明顯加快，且二次補(bǔ)糖時(shí)，酵母生長繁殖速度較大，乙醇產(chǎn)量變化趨勢與之相近，在補(bǔ)料后均呈現(xiàn)出迅速增加的趨勢，但二次補(bǔ)糖發(fā)酵48 h 時(shí)已經(jīng)超過50 g/L，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于一次性補(bǔ)料發(fā)酵，最終乙醇質(zhì)量濃度為54.9 g/L，木糖剩余3.9 g/L，為理論得率的67.1%.

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以樹干畢赤酵母m4 為發(fā)酵菌株，提高木糖濃度，在5 L 發(fā)酵罐中研究補(bǔ)料起始時(shí)間、補(bǔ)料次數(shù)以及補(bǔ)加不同物料時(shí)乙醇發(fā)酵的變化規(guī)律.結(jié)果表明，補(bǔ)料發(fā)酵時(shí)木糖初始濃度108 g/L，控制總濃度150 g/L，發(fā)酵84 h；在發(fā)酵36 h 時(shí)一次性補(bǔ)加木糖，酵母生長旺盛，木糖轉(zhuǎn)化乙醇的速率較大，產(chǎn)乙醇量最高為53.4 g/L，且補(bǔ)加木糖與全料培養(yǎng)基發(fā)酵相比，乙醇濃度變化不大；分兩次流加木糖發(fā)酵，乙醇產(chǎn)量最高，為54.9 g/L.與150 g/L、108 g/L 分批發(fā)酵相比，乙醇質(zhì)量濃度分別提高了11.1%、19.3%，補(bǔ)料工藝進(jìn)一步提高了乙醇的產(chǎn)量.此工藝可為其工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù).

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