張慶 茹慶國 林紅梅 劉艷 康倩 李輝 吳清

中藥當歸為傘形科植物當歸Angelica sinensis(Oliv．)Diels．的干燥根，有補血活血、調(diào)經(jīng)止痛、潤腸通便的功效［1］，廣泛應(yīng)用于中醫(yī)臨床，素有“十方九歸”之稱。當歸揮發(fā)油是當歸的主要有效成分之一，現(xiàn)代藥理研究證明其有提高免疫力、消炎鎮(zhèn)痛和抗血小板聚集等作用［2-3］。

在本研究中，用分子蒸餾對超臨界流體萃法取制備的當歸揮發(fā)油進行進一步分餾，應(yīng)用氣質(zhì)聯(lián)用色譜(gas chromatography-mass spectroscopy，GC-MS)分析所得餾分的化學(xué)組成，用LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細胞模型評價各餾分的抗炎作用，用PLSR分析各餾分中的化學(xué)成分與抗炎藥效的相關(guān)性。本研究為當歸及其他中藥揮發(fā)油的進一步開發(fā)利用及中藥揮發(fā)油質(zhì)量控制提供了有價值的資料。

1 材料

1．1 材料與試劑

當歸飲片購自北京本草方源藥業(yè)有限公司，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥鑒定系劉春生教授鑒定為傘形科植物當歸的干燥根。提取前將當歸飲片粉碎成粗粉。

脂多糖，二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購自Sigma-Aldrich公司;磷酸鹽緩沖液(PBS)、青霉素—鏈霉素溶液、MTT試劑購自北京索來寶公司;NO試劑盒購自江蘇碧云天生物科技研究所;DMEM培養(yǎng)基、色譜級乙酸乙酯購自Fisher公司。

1．2 儀器與設(shè)備

HA220-50-01超臨界流體萃取儀(江蘇南通華安超臨界萃取有限公司)，BSA224S分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)，VLK-70分子蒸餾設(shè)備(德國瑞達有限公司)，Thermo Finnigan 2000 Trace DSQ氣相色譜-質(zhì)譜儀器(美國Thermo公司)，Multiskan GO多功能酶標儀(美國Thermo公司)。

2 實驗方法

2．1 超臨界流體萃取及分子蒸餾

根據(jù)實驗室前期已確定的最佳提取工藝對當歸進行超臨界流體萃取，以CO2為萃取溶劑。提取的工作條件如下:工作壓力:30 MPa，工作溫度:50℃，提取時間:2小時，CO2的流量:25 L/h;分離器Ⅰ的工作壓力:8 MPa，溫度:50℃;分離器Ⅱ的壓力為提取系統(tǒng)尾部的壓力，工作溫度:35℃。

用分子蒸餾設(shè)備對所得揮發(fā)油進行分餾，工作條件如下:刮刀的轉(zhuǎn)速:300 rpm/min，分子蒸餾過程真空度:0．35 mbar，滴速:每秒1～2滴。本研究中，通過改變溫度來獲得不同的餾分。將所得到的餾分保存在－20℃冰箱中用于進一步的研究。

2．2 總提取物與各餾分的GC-MS分析

將各餾分適當稀釋后，用無水硫酸鈉脫水，然后用GC-MS進行分析，GC-MS條件:柱子型號:安捷倫 DB-5 MS(0．25 mm ×30 m，0．25 μm)，進樣口溫度:230℃，升溫程序:80℃以3℃/min升溫至167℃，保持2．5 min;以2℃/min升至202℃，以4℃/min升至280℃，保持15分鐘，載氣為高純氦氣，流速:1 mL/min，進樣量:1μL，溶劑延遲:4分鐘。離子源溫度:230℃，電離源:EI，電子能量:70 ev;傳輸線溫度:250℃;四級桿溫度:150℃，掃描質(zhì)量范圍:35～550 amu。

2．3 抗炎能力的測定—餾分對 LPS誘導(dǎo)的RAW264．7釋放NO的抑制作用

2．3．1 RAW264．7 細胞培養(yǎng)及傳代 小鼠單核巨噬細胞系細胞RAW264．7細胞購自國家實驗細胞資源共享平臺。細胞用含有10%胎牛血清，1%青霉素—鏈霉素溶液的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)環(huán)境為37℃、5%CO2，當細胞生長密度達到70% ～80%的時候進行傳代，1～2天換液1次，2～3隔天傳代。

2．3．2 MTT 測定各餾分對 RAW264．7 生長的影響 將處于對數(shù)生長期的 RAW264．7細胞，按1×104/孔的密度接種于96孔板中，置于37℃、5%CO2的環(huán)境中培養(yǎng)24小時，然后分別加入不同濃度的含藥培養(yǎng)基，使藥物的最終濃度分別為100 μg/mL、50 μg/mL、25 μg/mL、12．5 μg/mL、6．25 μg/mL、3.13 μg/mL、1．56 μg/mL，同時設(shè)置空白對照組與調(diào)零孔。繼續(xù)培養(yǎng)24小時后，加入5 mg/mL的MTT 20μL，置于細胞培養(yǎng)箱中孵育4小時，吸出上清液后，每孔加入150μL DMSO，放置于搖床上搖10分鐘，用酶標儀測定其在450 nm處的吸光度。

2．3．3 餾分對NO釋放的影響 將處于對數(shù)生長期的RAW264．7細胞，按照1×104/孔的密度接種于96孔板中，于37℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)24小時，然后分別加入含藥培養(yǎng)基，使其最終濃度為12．5μg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)1小時后，加入 LPS進行誘導(dǎo)，LPS的終濃度是10μg/mL，對照組加入等量的PBS，繼續(xù)培養(yǎng)24小時后，吸取細胞上清液進行離心，用Griss試劑法測定每組細胞的上清液中的NO，按照試劑盒上的操作步驟進行測定，通過計算NO抑制率評價餾分的抗炎作用。

2．4 統(tǒng)計學(xué)處理

3 結(jié)果

3．1 超臨界流體萃取及分子蒸餾

本研究用超臨界流體萃取法制得了棕色澄明的當歸揮發(fā)油，得率為1．4%，其中當歸揮發(fā)油中主要有效成分藁本內(nèi)酯的相對含量為65．98%。

當歸揮發(fā)油進行分子蒸餾后得到6個不同的餾分，在100℃下分離得到了餾分1，然后將殘渣進一步分離，在110℃時，得到餾分2，并將所得的殘渣按照上述方法進一步分離，在120℃、130℃、140℃、150℃下分別獲得了餾分3、餾分4、餾分5、餾分6。餾分1到餾分6從淺黃色變化到橙黃色，顏色逐漸加深，黏度增大。

3．2 當歸揮發(fā)油分子蒸餾后所得餾分的GC-MS分析

通過與NIST 2．0質(zhì)譜圖庫提供的標準圖譜進行比較，并查閱參考文獻，確定各餾分中的化學(xué)成分。

采用面積歸一化法確定餾分中各化學(xué)成分的相對含量。本研究為研究各餾分中化學(xué)成分與其抗炎作用的相關(guān)性，為簡化分析只對各餾分中相對含量大于1%的化學(xué)成分進行分析。GC-MS分析結(jié)果如表1所示。

GC-MS的結(jié)果顯示，藁本內(nèi)酯是各餾分中相對含量最高的成分，各餾分中藁本內(nèi)酯從低到高依次為:餾分6(32．77%)＜餾分5(48．63%)＜餾分 1(62．46%)＜餾分 2(72．27%)＜ 餾分 4(75．28%)＜餾分3(79．97%)。

3．3 抗炎作用

3．3．1 各餾分對 RAW264．7細胞生長的影響如表2所示，MTT結(jié)果顯示各餾分的藥物濃度在12．5 μg/mL、6．25 μg/mL、3．13 μg/mL、1．56 μg/mL時對細胞的正常生長無影響，細胞生存率與空白對照組相比，無顯著性差異，P ＞0．05。

3．3．2 各餾分的抗炎作用 本研究考察了各餾分藥物濃度在 12．5 μg/mL、6．25 μg/mL、3．13 μg/mL、1.56μg/mL時對LPS誘導(dǎo)的RAW264．7細胞 NO釋放的影響，結(jié)果顯示當藥物濃度分別為6．25 μg/mL、3．13 μg/mL、1．56 μg/mL 能夠抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264．7細胞NO的釋放，但無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0．05)。因此本研究選用各餾分濃度為12．5 μg/mL(P ＜0．05)時對 LPS誘導(dǎo)的RAW264．7細胞釋放NO的影響作為抗炎作用評價指標。結(jié)果如表3所示。

抗炎結(jié)果顯示在所得的6個餾分中餾分4的抗炎能力最強，而餾分1和餾分5的能力相對較弱。如表2所示，各餾分的抗炎能力與餾分中藁本內(nèi)酯的含量不成劑量依賴，餾分中其他成分對餾分抗炎作用的貢獻是值得關(guān)注的。

3．4 偏最小二乘法回歸分析

為了研究餾分中化學(xué)成分(相對含量＞1%)與其抗炎作用的相關(guān)性，本研究采用SIMCA-P 11．5偏最小二乘法回歸分析，分析餾分中化學(xué)成分與抗炎作用的相關(guān)性。將各餾分中含量＞1%的化學(xué)成分的相對含量作為自變量，其抑制NO釋放的百分比作為因變量進行回歸分析。

PLSR分析結(jié)果顯示餾分中的化學(xué)成分十九烷:2，2-二甲基-1-苯基-1-丙醇、Z-藁本內(nèi)酯、E-藁本內(nèi)酯、十六烷、阿魏酸、十三酸、亞油酸、油酸、5，8，11-十七碳三炔酸甲酯與餾分抗炎作用呈正相關(guān);(－ )-檸檬烯、6-丁基-1，4-環(huán)庚二烯、β-柏木烯、順-11，14，17-二十碳三烯酸甲酯、1-石竹烯、紅沒藥醇、桉油烯醇、1-(2，4-二甲基苯基)-1-丙酮、丁烯基苯酞、十五烷、2，6，10，14-四甲基十五烷、2，6，11-三甲基十二烷、十八烷、鄰苯二甲酸二異丁酯、鄰苯二甲酸二丁酯、棕櫚酸、3-羥基甲基烯-2-樟腦、(Z)-氧代環(huán)十七碳-8-烯-2-酮、Ethyl 9，9-diformylnona-2，4，6，8-tetraenoate、己二酸-1-(2-乙基己基)酯與餾分的抗炎藥效呈負相關(guān)，結(jié)果如表4所示。

在偏最小二乘法中，自變量在解釋因變量重要程度的大小時可以用投影變量重要性指標值來評價，其值越大說明自變量對因變量解釋的重要程度越大。

餾分中，各化學(xué)成分的變量重要性值如表5所示，當變量重要性值大于1時說明自變量能對因變量做一個更好的解釋，各化學(xué)成分中變量重要性值大于1的化學(xué)成分有十三酸、鄰苯二甲酸二丁酯、鄰苯二甲酸二異丁酯、β-柏木烯、順-11，14，17-二十碳三烯酸甲酯、紅沒藥醇、桉油烯醇、1-石竹烯、十九烷、亞油酸、十五烷、2，6，11-三甲基十二烷、十八烷、E-藁本內(nèi)酯、阿魏酸、油酸。結(jié)果如表5所示。

表1 各餾分GC-MS的分析結(jié)果(只顯示相對含量大于1%的化學(xué)成分)

表2 不同濃度的各餾分對細胞生存率的影響(x±s)

表3 各餾分中藁本內(nèi)酯的相對含量及其抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264．7細胞釋放NO的抑制率(±s)

表3 各餾分中藁本內(nèi)酯的相對含量及其抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264．7細胞釋放NO的抑制率(±s)

餾分 藁本內(nèi)酯相對含量(%) NO抑制率(%)62．46 11．89 ±2．43餾分2 72．27 27．58 ±9．25餾分3 79．97 32．25 ±4．76餾分4 75．28 50．27 ±3．42餾分5 48．63 13．91 ±6．75餾分6餾分1 32．77 44．76 ±13．46

表4 各餾分化學(xué)成分與抗炎作用的PLSR的回歸系數(shù)

表5 各餾分化學(xué)成分影響抗炎作用的變量重要性值(＞1)

偏最小二乘法的一個重要用途是用于預(yù)測建模，以各樣本點在Y的原始數(shù)據(jù)為觀測值，以回歸方程的擬合值y＇為預(yù)測值，繪制觀測值和預(yù)測值的散點圖，如下圖所示，所有的樣本點均排列在途中對角線附近，有關(guān)化學(xué)成分與藥效之間的預(yù)測模型的擬合結(jié)果:y=1*x+2．935e－0．07，R2=0．997，其預(yù)測結(jié)果是令人滿意的，結(jié)果如圖1所示。

圖1 各餾分化學(xué)成分影響抗炎作用PLSR回歸模型

4 討論

超臨界流體萃取法是一種快速、清潔的提取技術(shù)，是中藥揮發(fā)油常用的提取手段之一。分子蒸餾，也稱為短程蒸餾，是一種快速、高效、無污染的分離和濃縮技術(shù)，是分離和純化的天然產(chǎn)物的常用的方法，特別適用于高沸點、高黏度且熱敏性物質(zhì)分離，被廣泛地用于中草藥揮發(fā)油和其它精油的分離［4-6］。

偏最小二乘法是結(jié)合了主成分提取和相關(guān)性分析的綜合建模方法，被稱為第二代回歸技術(shù)，通過成分提取，以主成分分析過程通過協(xié)方差矩陣篩選出變異信息貢獻程度最大的綜合性成分，再通過這些選出來的綜合成分建立回歸模型［7］。

本研究用分子蒸餾的方法對當歸揮發(fā)油蒸餾后得到了6個餾分，GC-MS分析結(jié)果顯示藁本內(nèi)酯仍是各餾分的主要成分但有較大差異，抗炎實驗結(jié)果表明不同餾分的抗炎作用不同(P＜0．05)，且與餾分中藁本內(nèi)酯的含量沒有依賴性，PLSR結(jié)果抗炎藥效與化學(xué)成分存在較好的線性，說明模型建立是合理的，PLSR結(jié)果顯示除藁本內(nèi)酯外，當歸超臨界提取物中與藁本內(nèi)酯的共存成分對其抗炎活性也起到了重要的作用。本實驗為當歸及其他中草藥揮發(fā)油的進一步研究開發(fā)和利用提供了有價值的資料。

中藥化學(xué)成分復(fù)雜，通過多途徑多靶點發(fā)揮藥效，若僅通過某一成分或某幾個成分對其進行質(zhì)量控制不能代表中藥的整體性，通過建立藥效與化學(xué)成分的相關(guān)模型進行質(zhì)量控制是必要的。中藥揮發(fā)油的藥理作用廣泛，有抗炎、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤等藥理作用。而中藥揮發(fā)油成分復(fù)雜，中藥揮發(fā)油的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)廣泛［8］，因此有目的的針對揮發(fā)油中的多種藥效成分進行質(zhì)量控制是保證中藥揮發(fā)油質(zhì)量和藥效穩(wěn)定的一個有效手段，本研究為當歸及其他中藥揮發(fā)油的進一步開發(fā)利用和質(zhì)量控制進行了有益的探索并為其提供了數(shù)據(jù)支持。

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