杜芳靜，胡曉琴，宋 珂，李曉霞

(延安大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，陜西 延安716000)

0 引 言

電化學(xué)DNA 傳感器(elctrochemical DNA sensor)是將探針DNA 固定在電極表面上，通過檢測電化學(xué)信號進(jìn)行分析的器件。此類傳感器具有簡單、靈敏、快速、低成本及低能耗等特點(diǎn)，在疾病診斷、環(huán)境檢測和食品安全等領(lǐng)域有著重要的應(yīng)用價值和廣闊的應(yīng)用前景［1～3］。p53 抑癌基因(p53－DNA)是生物體內(nèi)一種抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)變癌細(xì)胞的基因，可誘導(dǎo)細(xì)胞生長阻滯，細(xì)胞凋亡，細(xì)胞分化以及DNA 修復(fù)［4］。目前已報(bào)道p53－DNA 的分析方法有電化學(xué)法［5～7］、光學(xué)法［8］和免疫法［9］。電化學(xué)阻抗(elctrochemical impedance spectroscopy，EIS)技術(shù)是利用小幅度交流電壓或電流對電極擾動，測量體系對擾動跟隨情況的電化學(xué)響應(yīng)的測量方法，該方法具有頻率范圍廣、對體系擾動小等特點(diǎn)，是研究電極過程動力學(xué)、電極表面現(xiàn)象等的重要工具［10，11］。

本文基于電化學(xué)阻抗技術(shù)構(gòu)建了一種檢測p53－DNA的電化學(xué)傳感器，將末端帶巰基的探針p53－DNA 固定于金電極表面，根據(jù)傳感器結(jié)合前后電子轉(zhuǎn)移阻抗值的變化，對目標(biāo)p53－DNA 進(jìn)行了分析與測定。該傳感器制備簡單、靈敏高，且無需標(biāo)記，易于操作，可用于不同序列DNA 的研究。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

CHI660E電化學(xué)工作站(上海辰華);Q5200B超聲儀(江蘇昆山);HG—9140A 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏設(shè)備);電極系統(tǒng):Au 為工作電極，Ag/AgCl 電極為參比電極，Pt 為對電極。

鐵氰化鉀和亞鐵氰化鉀(西安化學(xué)試劑廠);單鏈DNA(上海生工)序列參見文獻(xiàn)［5］;單鏈DNA 儲備液:用pH 7.0，10 mmol/L PBS 緩沖溶液配制;5.0 mmol/L K3［Fe(CN)6］－5.0 mmol/L K4［Fe(CN)6;檢測液:用pH 7.4，0.10 mol/L PBS－0.10 mol/L NaCl 配制;實(shí)驗(yàn)用水均為Millipore Milli—Q 超純水(大于18.2 MΩ·cm)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

首先將Au 進(jìn)行預(yù)處理［12］。將5 μL 5.0 μmol/L 探針p53－DNA 溶液滴涂在處理好的Au 表面，4 ℃固定12 h，然后用10 mmol/L PBS(pH 7.0)和超純水沖洗，以除去吸附的探針;用5.0 μL，1.0 mmol/L MCH 封閉1 h，得到p53－DNA傳感器，4 ℃冰箱中保存待用。將5.0 μL 不同濃度目標(biāo)p53－DNA 滴加到p53－DNA 傳感器上，37 ℃雜交反應(yīng)1 h。在5.0 mmol/L/L K3［Fe(CN)6］－5.0 mmol/L K4［Fe(CN)6］檢測液中進(jìn)行測定，根據(jù)傳感器雜交前后電子轉(zhuǎn)移阻抗值的變化分析信號，對目標(biāo)p53－DNA 進(jìn)行定量檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 傳感器的電化學(xué)表征

圖1 為不同修飾電極在檢測液中的循環(huán)伏安圖。曲線a 為裸 Au 電極上的循環(huán)伏安曲線，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，［Fe(CN)6］3－/4平衡電對的電位差為80 mV。探針p53－DNA 自組裝到Au 電極表面后，由于DNA 的磷酸骨架帶負(fù)電荷，阻礙荷負(fù)電的［Fe(CN)6］3－/4－的電子傳遞，峰電位差ΔE 明顯增大且峰電流降低(曲線b)。當(dāng)封閉劑MCH 占據(jù)了電極表面未結(jié)合的位點(diǎn)(曲線c)，峰電位差繼續(xù)增大且峰電流也繼續(xù)降低。探針DNA 與目標(biāo)DNA 雜交之后形成雙鏈DNA 結(jié)構(gòu)(曲線d)，峰電位差達(dá)到最大，峰電流降到最低。以上結(jié)果表明:探針DNA 通過巰基自組裝作用固定在電極表面，構(gòu)建的p53－DNA 傳感器與目標(biāo)p53－DNA 發(fā)生了雜交反應(yīng)。

圖2 為不同電極的電化學(xué)阻抗圖?？梢钥闯?，曲線a為裸金電極的阻抗，半圓較小，其電子傳遞阻抗Ret值為73.2 Ω。當(dāng)探針DNA 固定到電極表面后，［Fe(CN)6］3－/4－電子傳遞受阻，電子傳遞阻抗Ret值增大到3 846 Ω。MCH封閉后，電子傳遞阻抗Ret值繼續(xù)增大，說明MCH 在電極表面上形成致密的自組裝膜，使得［Fe(CN)6］3－/4－電子傳遞變得更加困難。當(dāng)雜交反應(yīng)形成DNA 雙螺旋結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步阻礙了［Fe(CN)6］3－/4在電極表面的電子傳遞，因此，其電子傳遞阻抗Ret值達(dá)到9 271 Ω。阻抗法與循環(huán)伏安法表征的結(jié)果一致，說明DNA 傳感器制備成功，并可以用于目標(biāo)p53－DNA 的檢測。

圖1 不同電極在5.0 mmol/L［Fe(CN)6］3-/4-溶液中的循環(huán)伏安圖(cProbe DNA=5.0 mol/L，cTarget DNA=1.0 mol/L)Fig 1 Cyclic voltammograms of different electrodes in 5.0 mmol/L M［Fe(CN)6］3-/4-solution(cProbe DNA=5.0 mol/L，cTarget DNA=1.0 mol/L)

圖2 不同電極在5.0 mmol/L［Fe(CN)6］3-/4-溶液中的阻抗圖Fig 2 Impedance diagram of different electrodes in 5.0 mmol/L［Fe(CN)6］3-/4-solution

2.2 實(shí)驗(yàn)條件的選擇

為了獲得更高的靈敏度，首先考察了各種電化學(xué)參數(shù)對傳感器的影響。首先研究了不同的電化學(xué)技術(shù)對靈敏度的影響，將制備好的傳感器放入5×10－7mol/L，1×10－6mol/L兩種不同濃度目標(biāo)p53－DNA 溶液中，分別采用電化學(xué)阻抗法、微分脈沖伏安法和方波伏安法進(jìn)行測定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明使用電化學(xué)阻抗法測定靈敏度更高。因此，選用電化學(xué)阻抗法對目標(biāo)p53－DNA 進(jìn)行測定。圖3 為探針DNA 不同固定時間與傳感器雜交前后電化學(xué)阻抗變化值的關(guān)系曲線，可以看出，隨著固定時間從8 h 增加到12 h，電子傳遞電阻值Ret逐漸增大，12 h 之后Ret值呈緩慢降低，說明探針固定12 h 趨于飽和。因此，實(shí)驗(yàn)選擇探針固定時間為12 h。

圖3 探針固定時間對傳感器響應(yīng)信號的影響Fig 3 Effect of immobilization time of probe on response signal of sensor

考察了雜交溫度和雜交時間對傳感器測定的影響，結(jié)果表明:雜交溫度達(dá)到37 ℃時，電化學(xué)阻抗響應(yīng)信號是最大的(圖4(a))，37 ℃之后呈下降的趨勢，說明在較高溫度時，DNA 變性導(dǎo)致DNA 分子由穩(wěn)定的雙螺旋結(jié)構(gòu)松解為無規(guī)則線性結(jié)構(gòu)，不利于雜交［13］，所以，選擇37 ℃為最佳雜交溫度。圖4(b)顯示了當(dāng)雜交時間達(dá)到1 h 時，Ret值最大，繼續(xù)增加雜交時間，其Ret值變化較小，因此，選擇DNA 雜交時間為1 h。

圖4 雜交溫度和雜交時間對響應(yīng)信號的影響Fig 4 Effect of hybridization temperature and time on response signal

2.3 分析性能

在上述優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，利用制備好的傳感器對一系列不同濃度的目標(biāo)p53－DNA 進(jìn)行定量測定。圖5 為傳感器在不同濃度目標(biāo)p53－DNA 溶液中的電化學(xué)阻抗圖。電子傳遞電阻Ret與目標(biāo)p53－DNA 濃度在1×10－8～1×10－6mol/L 范圍內(nèi)呈線性關(guān)系(見附圖)，線性回歸方程為Ret(Ω)=37.74+4.666 7 C(C(mol/L))，相關(guān)系數(shù)為0.995 5，其檢出限為3.0×10－9mol/L(S/N=3)。對5.0×10－8mol/L的目標(biāo)p53－DNA 做11 次平行測定，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.8%。比較發(fā)現(xiàn)，本文方法測定線性范圍較文獻(xiàn)［7］寬，測定方法較文獻(xiàn)［5］更簡單。

2.4 選擇性

利用制備好的DNA 傳感器對完全互補(bǔ)p53－DNA、單堿基錯配序列p53－DNA 和三堿基錯配序列p53－DNA 進(jìn)行測定。結(jié)果表明:傳感器識別互補(bǔ)p53－DNA，其響應(yīng)信號電子傳遞電阻Ret值為9 989 Ω，與單堿基錯配p53－DNA 反應(yīng)后，Ret值為4 495 Ω，與三堿基錯配p53－DNA 反應(yīng)后，Ret值為2 297 Ω，分別為完全互補(bǔ)的DNA 雜交信號的45%和23%。說明該傳感器能夠區(qū)分完全互補(bǔ)序列、單堿基錯配序列和三堿基錯配序列DNA，具有良好的選擇性。

3 結(jié) 論

圖5 傳感器檢測不同濃度目標(biāo)DNA 的電化學(xué)阻抗圖(插圖為電子傳遞電阻Ret vs 目標(biāo)p53-DNA 濃度)Fig 5 Electrochemical impedance diagram of biosensor detect different target DNA concentrations(Insert:Plots of the difference of electron transfer resistance(Ret)vs logarithmic of target p53-DNA concentration)

本文基于電化學(xué)阻抗技術(shù)構(gòu)建了一種檢測p53－DNA的電化學(xué)傳感器，該傳感器可以檢測完全互補(bǔ)DNA 的范圍是1.0×10－8～1.0×10－6mol/L，具有操作簡單、無需標(biāo)記、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，可以用于其它DNA 序列的檢測。

［1］ 常艷兵，李曉飛，張銀烽，等.基于納米金標(biāo)記的適體傳感器的研制［J］.傳感器與微系統(tǒng)，2011，30(11):108－110.

［2］ Qi H L，Li X X，Chen P，et al.Electrochemical detection of DNA hybridization based on polypyrrole/ss－DNA/multi－wall carbon nanotubes paste electrode［J］.Tanlanta，2007，72:1030－1035.

［3］ Li X X，Shen L H，Zhang D D，et al.Electrochemical impedance spectroscopy for study of aptamer－thrombin interfacial interactions［J］.Biosensor and Bioelectronics，2008，23:1624－1630.

［4］ Hamroun D，Kato S，Ishioka C，et al.The UMD TP53 database and website:Update and revisions［J］.Hum Mutat，2006，27(1):14－20.

［5］ 羅賢文，杜芳靜，吳 燁，等.基于金納米粒子組裝電化學(xué)DNA 傳感器檢測p53 抑癌基因的研究［J］.分析化學(xué)，2013，41(11):1664－1668.

［6］ Wang X Y，Zhang X Y，He P G，et al.Sensitive detection of p53 tumor suppressor gene using an enzyme－based solid－state electrochemiluminescence sensing platform［J］.Biosensors and Bioelectronic，2011，26(8):3608－3613.

［7］ 劉 萍，劉曉琴，王書民，等.非標(biāo)記型p53 抑癌基因電化學(xué)DNA 生物傳感器的研究［J］.分析測試學(xué)報(bào)，2011，30(7):739－744

［8］ 劉 萍，白金燕，金 燕.非標(biāo)記型p53 抑癌基因的熒光DNA生物傳感器［J］.陜西師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2011，39(2):45－49.

［9］ Barnes D M，Dublin E A，F(xiàn)isher C J，et al.Immunohistochemical detection of p53 protein in mammary carcinoma:An important new independent indicator of prognosis［J］.Human Pathology，1993，24(5):469－476.

［10］李叢叢，李曉霞，羅賢文，等.基于苯硼酸修飾構(gòu)建電化學(xué)阻抗糖生物傳感器的研究［J］.分析化學(xué)，2013，41(10):1537－1542.

［11］Qi H L，Shangguan L，Li C C，et al.Sensitive and antifouling impedimetric aptasensor for determination of thrombin in undiluted serum sample［J］.Biosensor and Bioelectronics，2013，39:324－328.

［12］Li X X，Qi H L，Shen L H，et al.Electrochemical aptasensor for the determination of cocaine incorporating gold nanoparticles modification［J］.Electroanalysis，2008，20(13):1475－1482.

［13］白 燕，戴小峰，劉仲明，等.電化學(xué)DNA 傳感器中DNA 的固定與雜交條件探討［J］.傳感器技術(shù)，2005，24(6):23－25.