張延輝，徐 濤，趙燕輝，劉春雷

（青島市中心醫(yī)院泌尿外科，山東266042）

前列腺癌中CIP2A的表達及意義

張延輝，徐 濤，趙燕輝，劉春雷

（青島市中心醫(yī)院泌尿外科，山東266042）

目的 探討蛋白磷酸酶2A的癌性抑制因子（CIP2A）在前列腺癌組織中的表達及其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。方法 收集2011年12月至2014年11月該院泌尿外科前列腺癌（80例）和前列腺增生（25例）組織標本進行研究。應(yīng)用RT-PCR和免疫組織化學分別檢測標本組織中CIP2AmRNA和蛋白表達情況。結(jié)果 CIP2A在前列腺癌組織中的陽性表達率（70%，56/80）明顯高于前列腺增生組織（16%，4/25），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），CIP2A在前列腺癌中表達與高Gleason評分、高T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），但CIP2A表達與前列腺特異性抗原（PSA）水平無明顯相關(guān)性（P＞0.05）。結(jié)論 CIP2A在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展中可能起促進作用，與前列腺癌的發(fā)生、分化和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有一定關(guān)系，有可能成為判斷前列腺癌預后的新標志和臨床治療的新靶點。

前列腺腫瘤； 磷蛋白磷酸酶類； 免疫組織化學； 腫瘤分期； 抑制因子，免疫

前列腺癌的發(fā)病率有明顯的地理和種族差異，其在美國是危害男性健康的首位腫瘤疾??；前列腺癌在中國的發(fā)病率也有顯著上升，1994～2002年，前列腺癌發(fā)病率每年增長13.4%[1]。因此，進一步尋找診斷前列腺癌的分子標志物及治療靶點十分重要。蛋白磷酸酶2A（protein phosphortase 2A，PP2A）是三聚體全酶，其在調(diào)節(jié)相關(guān)的致癌活性和一些主要的腫瘤信號通路中起著不可或缺的作用，PP2A的癌性抑制因子（cancerous inhibitor of protein phosphatase 2A，CIP2A）通過抑制細胞內(nèi)的PP2A穩(wěn)定c-Myc蛋白表達，促進細胞轉(zhuǎn)化和腫瘤細胞的生長[2]。有報道表明，CIP2A在人乳腺癌[3]、結(jié)腸癌[4]、肝癌[5]、胃癌[6]、鼻咽癌[7]、肺癌[8]、皮膚惡性黑色素瘤[9]的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，但目前尚少見CIP2A在前列腺癌中的相關(guān)研究報道。本文探討CIP2A在前列腺癌和前列腺增生組織中表達及其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 標本來源 收集2011年12月至2014年11月本院泌尿外科前列腺癌（80例）和前列腺增生癥（25例）組織標本進行研究。標本通過經(jīng)尿道前列腺等離子汽化切除術(shù)或前列腺根治性切除術(shù)取得，其中80例前列腺癌標本中有25例通過前列腺癌根治性切除術(shù)中獲得，有55例標本通過經(jīng)尿道前列腺電切術(shù)獲得，所有標本均得到患者授權(quán)。收集所有前列腺癌患者Gleason評分、腫瘤分期和前列腺特異性抗原（prostatespecific antigen，PSA）水平。

1.1.2 試劑 兔抗人CIP2A多克隆抗體購自Imgenex公司，羊抗兔抗體購自SantaCruz公司，Trizol購自Invitrogen公司，PCR引物、100 bp DNA標準參照物、RTPCR試劑盒購自TaKaRa公司，堿性磷酸酶標記的羊抗兔抗體購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學檢測CIP2A蛋白表達 采用過氧化物酶標記的鏈霉卵蛋白素（SP）法，步驟如下：（1）石蠟切片60℃烤箱烤片2 h，常規(guī)脫蠟、水化。（2）3%過氧化氫去離子水37℃孵育10min，高溫修復抗原30min（微波法修復）并冷卻至室溫，滴加封閉血清，37℃孵育20min，滴加CIP2A一抗工作液，陰性對照以PBS代替一抗，4℃冰箱中孵育過夜。（3）滴加生物素標記二抗37℃孵育30min，滴加鏈霉親和素-過氧化物酶，室溫或37℃孵育30min，滴加二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）進行顯色，蘇木精復染，顯微鏡下觀察。CIP2A的表達主要位于細胞質(zhì)，細胞質(zhì)染色為棕黃色為陽性。根據(jù)標本細胞染色質(zhì)染色強度分為4個等級：無著色記為0，弱染色記為1，中度染色記為2，強染色記為3，對CIP2A的表達進行評分。免疫組織化學結(jié)果由2名觀察員獨立評估，觀察者獨立評估計算，當評分結(jié)果相差較大時需擴大高倍鏡選擇視野后由2名評分者討論決定評分結(jié)果。

1.2.2 RT-PCR檢測CIP2AmRNA表達 取組織冷凍標本，將冷凍樣本組織剪碎后超聲破碎，Trizol法提取細胞總RNA，RT-PCR實驗過程按照TaKaRa試劑盒中的反轉(zhuǎn)錄說明獲得總cDNA，應(yīng)用Primer 5分別設(shè)計CIP2A和β-actin引物。CIP2A上游引物為5′-GTCTGGAATGGTGGTAAA-3′，下游引物為5′-TGTGAGGGTGTACTATCG-3′，擴增長度843 bp；內(nèi)參β-actin上游引物為5′-AGCGGGAAATCGTGCGTG-3′，下游引物為5′-CAGGGTACATGGTGGTGCTGCC-3′，擴增長度452 bp。反應(yīng)結(jié)束后，取5μL擴增產(chǎn)物在按照PCR產(chǎn)物用2.0%瓊脂凝膠電泳，電泳結(jié)束后置于GeneSnap from SynGene成像系統(tǒng)成像鑒定。以CIP2A/β-actin值表示CIP2AmRNA的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，組間CIP2A陽性率比較采用χ2檢驗，CIP2A表達與前列腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系采用相關(guān)性分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 前列腺增生和前列腺癌組織中CIP2A蛋白的表達情況 CIP2A的表達主要位于細胞質(zhì)，56例（70%）前列腺癌組織標本CIP2A表達陽性，而在前列腺增生組織標本中僅檢測到4例（16%）CIP2A表達陽性，其余均為陰性，前列腺癌標本中CIP2A表達顯著高于前列腺增生標本，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），見圖1、2。

2.2 CIP2A與前列腺癌臨床病理特征的關(guān)系 CIP2A的染色強度隨著前列腺癌Gleason評分的增高而增加，Gleason評分大于或等于7分（83.7%，41/49）的CIP2A陽性率高于Gleason評分小于7分（48.4%，15/31），差異有統(tǒng)計學意義（P=0.001）。CIP2A染色強度在不同PSA值間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P=0.801）。臨床T分期：T3+T4期組中CIP2A陽性率（80.0%，44/55）明顯高于T1+ T2期組（44.0%，11/25），差異有統(tǒng)計學意義（P=0.002）。伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組CIP2A陽性率（81.5%，44/54）高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（46.2%，12/26），差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表1。

圖1 前列腺增生和前列腺癌組織中CIP2A蛋白的表達

圖2 RT-PCR檢測CIP2AmRNA表達

表1 CIP2A與前列腺癌臨床病理特征的關(guān)系[n（%）]

3 討 論

前列腺癌是威脅中老年男性健康的常見惡性腫瘤，在美國，前列腺癌的發(fā)病率已經(jīng)超過肺癌，病死率較高；在我國，隨著經(jīng)濟的發(fā)展，人壽命的不斷延長和生活方式的改變，前列腺癌的發(fā)病率和病死率也逐年上升。大部分前列腺癌患者因排尿癥狀改變或者骨痛就診，僅6.2%的患者因血清PSA升高而就診[1]。

CIP2A又稱為kiaa1524或P90的腫瘤相關(guān)抗原，是一種可以促進惡性腫瘤轉(zhuǎn)化和維持惡性表型的癌蛋白。2007年，Junttila等[10]研究發(fā)現(xiàn)，CIP2A基因定位于染色體3q13.13，其DNA長度約為38.8 kb，mRNA長為4 284 bp，有一個編碼905個氨基酸的開放讀碼框（ORF），含有21個外顯子，相對分子質(zhì)量為102×103，CIP2A通過抑制PP2A對癌轉(zhuǎn)錄因子c-Myc的S62位點的去磷酸化作用，抑制了體內(nèi)PP2A的抑癌作用，最終導致細胞轉(zhuǎn)化和腫瘤生長，結(jié)果證實，CIP2A是一種癌蛋白，且可通過與致癌性轉(zhuǎn)錄因子c-Myc直接相互作用，也通過抑制PP2A對c-Myc基因S62位點的去磷酸化作用，從而進一步抑制c-Myc蛋白水解，穩(wěn)定c-Myc蛋白的表達水平，并且CIP2A與c-Myc之間為正反饋關(guān)系。Liu等[3]通過shRNA沉默乳腺癌細胞中的CIP2A發(fā)現(xiàn)，CIP2A在通過促進癌細胞增殖并降低癌細胞凋亡起作用。Shi等[9]通過siRNA干擾CIP2A研究惡性黑色素瘤的侵襲性，證實CIP2A可促進惡性黑色素瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。Ding等[4]研究抗癌藥物硼替佐米對結(jié)腸癌的作用時，發(fā)現(xiàn)硼替佐米在抗腫瘤的同時可降低CIP2A的表達，說明CIP2A在硼替佐米抑制結(jié)腸癌中起著重要作用。在胃癌細胞系中，幽門螺桿菌通過Src蛋白和Ras、促分裂原活化蛋白激酶、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶途徑介導CIP2A的表達[6]。這些途徑在雄激素生成中起著重要作用[11]，從而可通過這些途徑治療轉(zhuǎn)移性前列腺癌。

本研究結(jié)果顯示，CIP2A在前列腺癌中高表達，在前列腺增生中低表達，表明CIP2A在前列腺癌的診斷中具有很好的靈敏性，可作為一項早期篩查指標。CIP2A的高表達更傾向于高Gleason評分、高臨床TNM分期及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，而與血清PSA無相關(guān)性。Gleason評分、高臨床TNM分期及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移被認為是評價前列腺癌預后的重要指標，因此推測，CIP2A可能在前列腺癌發(fā)生發(fā)展中起著極其重要的作用，但未發(fā)現(xiàn)CIP2A mRNA及蛋白表達與血清PSA相關(guān)，可能因為不同患者的血清PSA變化較大，同時前列腺按摩、前列腺穿刺活檢、急性尿潴留、導尿等均有可能導致PSA一過性升高，本研究樣本量有限也可能是原因之一。前列腺癌的診斷需要新的并且能反映疾病進展程度的標志物。肝細胞癌、胃癌和食管癌的血清CIP2A抗體分別為13%、5%、3%[12]。CIP2A抗體在前列腺癌血清中表達有30%，而良性前列腺增生患者只有1.5%。此外，Gleason評分大于或等于7分的前列腺癌血清CIP2A抗體表達率明顯高于Gleason評分小于或等于6分的患者，分別為29%、16%[13]。上述研究結(jié)果說明，CIP2A或CIP2A血清抗體有助于判斷前列腺癌的生物學行為。

本研究中，應(yīng)用RT-PCR可檢測CIP2AmRNA，免疫組織化學可檢測CIP2A蛋白量，更加準確表明CIP2A在前列腺癌中的表達。本研究結(jié)果表明，CIP2A蛋白在前列腺癌中表達增高，且與前列腺癌臨床生物學行為相關(guān)，說明CIP2A是前列腺癌發(fā)生發(fā)展中一個新的分子標志物。

綜上所述，CIP2A在前列腺癌中高表達，并且與高Gleason評分、高臨床T分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，提示CIP2A可能在前列腺癌的發(fā)生、分化、侵襲轉(zhuǎn)移中有一定的促進作用，可能成為診斷前列腺癌的新標志物和基因治療的新靶點。

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Expression of CIP2A and its clinical significance in prostate cancers

Zhang Yanhui，Xu Tao，Zhao Yanhui，Liu Chunlei
（DepartmentofUrinary Surgery，Qingdao CenterHospital，Shandong266042，China）

Objective To detect theexpression ofCIP2A ofprotein phosphatase2A in prostate cancer tissuesand toexplore its correlation with prostate cancer clinicopathological parameters.M ethods Itwas collected tissue samples from 80 patientswith prostate cancerand 25 patientswith prostatichyperplasia to explore further.The expression of CIP2AmRNA and protein were detected by RT-PCR and immunohistochemistry.Results The positive rate of CIP2A in prostate cancer tissues（70%，56/80）was significantly higher than thatofbenign prostatic hyperplasia tissues（16%，4/25），and therewas a statistically significantdifference（P＜0.01）.Increased expression of CIP2A wasmore often detected in prostate cancer with high Gleason scoring，advanced T stage，lymph nodemetastasis.Itshowed statistical significance in difference（P＜0.05）.Itwas detected that CIP2A expressionhad rare correlation with PSA concentration（P＞0.05）.Conclusion CIP2A may play an important role in carcinogenesisand progression of prostate cancer.The expression of CIP2A has a certain relationship with tumorigenesis，differentiation and lymph nodemetastasis.CIP2Amay bea sign for prognosisand new target for clinical treatmentand ofprostate cancer.

Prostatic neoplasms； Phosphoprotein phosphatases； Immunohistochemistry； Neoplasm staging；Suppressor factors，immunologic

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.09.006

A

1009-5519（2015）09-1295-03

2014-12-20）

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本刊編輯部

張延輝（1984-），男，山東德州人，碩士研究生，主要從事泌尿系腫瘤基礎(chǔ)與臨床研究；E-mail：zhangyanhuihs@163.com。

劉春雷（E-mail：271194250@qq.com）。