西安市中心醫(yī)院口腔科(西安710004)

張 新 劉艷麗?

牙髓血運(yùn)重建術(shù)對延遲再植牙根部組織bFGF及PDGF表達(dá)的影響*

西安市中心醫(yī)院口腔科(西安710004)

張 新 劉艷麗?

目的：研究牙髓血運(yùn)重建術(shù)對延遲再植的犬年輕恒牙根部組織堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)及血小板衍生生長因子(PDGF)表達(dá)的影響。方法：選擇4只約5月齡健康雜種犬，取11、13、15、41、43、45恒牙為實(shí)驗(yàn)組，對側(cè)同名牙為對照組。1d后實(shí)驗(yàn)組再植后行牙髓血運(yùn)重建術(shù)，對照組再植后不做附加處理。軟食分籠喂養(yǎng)3、6月時(shí)拔除實(shí)驗(yàn)牙并取牙槽窩新鮮血液1m1離心，凍融后檢測bFGF及PDGF含量并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果：術(shù)后實(shí)驗(yàn)牙有3個(gè)未形成血凝塊，7個(gè)三氧化物凝聚體(MTA)充填不佳，5個(gè)出現(xiàn)牙槽骨Ⅱ-Ⅲ°吸收，3個(gè)根折。3、6個(gè)月時(shí)實(shí)驗(yàn)組bFGF和PDGF的濃度升高，與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義， bFGF濃度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，而PDGF的濃度隨時(shí)間變化呈有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論：牙髓血運(yùn)重建術(shù)可以促使牙根發(fā)育、根尖孔閉合、根管壁增厚。但其長期療效，生物學(xué)機(jī)制，以及可能出現(xiàn)的不良影響仍需繼續(xù)研究。

牙外傷是口腔常見病之一[1]。在牙外傷病例中，牙完全脫位約占12%～26%[2]，牙齒脫落后第一時(shí)間不能就診并且或在保存脫落牙齒方面沒有經(jīng)驗(yàn)會造成患牙缺失，而牙齒再植術(shù)后常出現(xiàn)牙根外吸收[3,4]，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致牙槽骨吸收、牙松動(dòng)、牙脫落而造成治療失敗。牙髓血運(yùn)重建術(shù)(Dental pulp revascularization)是由Iwaya等[5]在2001年首次提出，作為治療年輕恒牙牙髓感染或壞死的新選擇，通過徹底的根管清理、消毒，保護(hù)牙髓干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞，為增殖和分化提供良好的環(huán)境，并使用MTA進(jìn)行冠方封閉。當(dāng)根管內(nèi)血管再生后，根尖周炎癥可以逐漸愈合，出現(xiàn)根尖閉合、牙根長度增加及管壁增厚等現(xiàn)象，但其分子機(jī)制仍不明確。本研究擬通過建立犬牙髓血運(yùn)重建術(shù)動(dòng)物學(xué)模型，觀察延遲再植的年輕恒牙根部組織堿性成纖維活細(xì)胞生長因子(bFGF)以及對血小板衍生生長因子(PDGF)的表達(dá)情況以及不同時(shí)期牙髓血運(yùn)重建術(shù)bFGF以及PDGF的影響作用，對牙延遲再植術(shù)后牙根周組織炎癥吸收愈合機(jī)制提供理論依據(jù)，為深入研究牙髓血運(yùn)重建術(shù)的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 4只本地約5月齡健康雜種犬，雌雄不限，體重約6kg，選取11、13、15、41、43、45恒牙為實(shí)驗(yàn)組(再植后行牙髓血運(yùn)重建術(shù))，同名對側(cè)牙做為對照組(再植后不做附加處理)。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)X線影像確定牙根未發(fā)育完成、根尖孔敞開的上頜和下頜單根管牙齒。排除標(biāo)準(zhǔn)：牙根已發(fā)育完成、牙冠或牙根存在裂隙。篩選出46顆牙(其中實(shí)驗(yàn)組和對照組各1顆下前牙牙根已發(fā)育完成，未納入試驗(yàn))進(jìn)行試驗(yàn)。

2 主要試劑和儀器 bFGF、PDGF酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒(武漢博士德生物公司，中國)；MTA(登士柏公司，美國)；牙科X射線機(jī)(北京普朗公司，中國)；口腔顯微鏡(蔡司公司，德國)。

3 實(shí)驗(yàn)方法 拔除犬實(shí)驗(yàn)牙后靜置于生理鹽水培養(yǎng)皿中，1d后將實(shí)驗(yàn)牙置于2 mmol/L濃度的ALN溶液中浸泡10 min，進(jìn)行再植。實(shí)驗(yàn)組牙齒常規(guī)開髓、拔髓、預(yù)備至25#針并徹底消毒，將實(shí)驗(yàn)組牙植入對應(yīng)原牙槽窩中，刺激根尖周組織緩慢出血，顯微鏡下觀察出血達(dá)到釉牙骨質(zhì)界后停止刺激，靜置15min后觀察到血凝塊形成后使用MTA墊底封閉和玻璃離子充填修復(fù)。對照組牙齒浸泡后直接植入對應(yīng)原牙槽窩。術(shù)后使用羊腸線逐個(gè)拉攏縫合唇舌側(cè)牙齦固定牙齒。

4 標(biāo)本制備 分籠喂養(yǎng)軟食3、6月時(shí)分別將兩只實(shí)驗(yàn)狗進(jìn)行標(biāo)本制備。首先實(shí)驗(yàn)牙拍攝X線片后拔除該牙，牙槽窩取新鮮血液1m1靜置于離心管，3h后4000rpm離心15min并用移取血清至空離心管，-70℃保存。標(biāo)本收集完成后進(jìn)行檢測，以避免試劑和人員產(chǎn)生的誤差影響。

5 ELISA檢測 按試劑盒要求進(jìn)行ELISA檢測，終止操作后測定各孔的吸光度(OD450值)，每組重復(fù)測試3次，計(jì)算均值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及OD值計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線方程后算出樣品濃度。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用SPSS方法21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 臨床檢驗(yàn) 標(biāo)本制備的過程中，3顆實(shí)驗(yàn)牙刺激后無法形成血凝塊，排除本實(shí)驗(yàn)。喂養(yǎng)結(jié)束時(shí)牙齒叩診呈金屬音，牙齦無明顯退縮、充血以及水腫，松動(dòng)1度內(nèi)的實(shí)驗(yàn)牙進(jìn)行制備。3月時(shí)2只實(shí)驗(yàn)犬由于損壞或松動(dòng)脫落共喪失4顆牙齒(實(shí)驗(yàn)組1顆，對照組3顆)，最后，實(shí)驗(yàn)組10顆，對照組8顆受試牙被納入進(jìn)行比較研究；6月時(shí)實(shí)驗(yàn)組8顆，對照組6顆受試牙進(jìn)行比較研究。

2 X線觀察結(jié)果 術(shù)前實(shí)驗(yàn)牙根尖孔均開放。喂養(yǎng)3月時(shí)22個(gè)實(shí)驗(yàn)牙牙根中有3個(gè)MTA充填不佳，2個(gè)出現(xiàn)牙槽骨2～3度吸收，1個(gè)牙根根折；6月時(shí)24個(gè)實(shí)驗(yàn)牙牙根中有4個(gè)MTA充填不佳，3個(gè)出現(xiàn)牙槽骨2～3度吸收，2個(gè)牙根根折，均不進(jìn)行標(biāo)本制備。其余實(shí)驗(yàn)牙部分出現(xiàn)根尖孔、牙根管壁厚度縮窄的趨勢(圖1,圖2)。

圖1 CBCT再植牙血運(yùn)重建術(shù)后1d 圖2 CBCT再植牙血運(yùn)重建術(shù)后6m

3 ELISA檢測結(jié)果 與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組3、6個(gè)月時(shí)bFGF及PDGF的濃度升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)組組內(nèi)按時(shí)間比較時(shí)顯示bFGF濃度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，而PDGF的濃度隨時(shí)間變化呈現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，見表1，表2。

表1 不同時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)、對照組bFGF濃度水平

注：與對照組比較，*P<0.05

表2 不同時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)、對照組PDGF濃度水平

注：與對照組比較，*P<0.05；與3月比較，△P<0.05

討 論

外傷引起的年輕恒牙脫落會造成牙根停止發(fā)育、根管內(nèi)壁變薄、根尖孔不能閉合等問題。以往的治療中，脫落牙齒完成根管治療及再植后使用氫氧化鈣或礦化三氧化聚合體(MTA)進(jìn)行誘導(dǎo)根尖成形，可以促進(jìn)根尖孔閉合，形成鈣化屏障[6,7]，但氫氧化鈣的使用容易造成微滲漏和牙根折裂[8]，而MTA的作用是使根尖孔原位關(guān)閉、牙齒失去感覺及防御功能，繼發(fā)性牙本質(zhì)無法形成，治療后根管仍然需要充填。但這兩種方法均不能促進(jìn)牙根的繼續(xù)生長及根管壁增厚[8～10]。

血管再生法是一種治療死髓、外傷等年輕恒牙疾病的新方法，Banchs等[11]對壞死感染的年輕恒牙聯(lián)合應(yīng)用甲硝唑，米諾環(huán)素和環(huán)丙沙星沖洗液進(jìn)行徹底消毒，刺激根尖組織出血充盈根管，血凝塊形成后采用MTA封閉冠方，術(shù)后2年發(fā)現(xiàn)根尖病變愈合，根尖閉合以及管壁增厚，部分患者出現(xiàn)牙髓活力反應(yīng)。近年來的研究表明[12]部分采取血管再生法的病例取得了良好的治療效果。

牙髓血管再生取得成功的關(guān)鍵包括徹底消毒、良好的血凝塊以及嚴(yán)密的冠方封閉。本實(shí)驗(yàn)對于實(shí)驗(yàn)牙采用ALN溶液浸泡，治療后又使用3%次氯酸鈉液蕩洗以保證消毒的徹底。血凝塊作為組織生長的支架[13]，含有PDGF、bFGF和組織生長因子等可以刺激未分化的間充質(zhì)細(xì)胞分化的因子。本實(shí)驗(yàn)刺激根尖出血時(shí)，使用口腔顯微鏡可以有效的控制血凝塊的形成過程，為嚴(yán)密封閉根管提供有效保障。本實(shí)驗(yàn)有3顆實(shí)驗(yàn)牙未形成血凝塊，分析可能原因有：①過強(qiáng)的根尖刺激，無法控制出血量；②藥物刺激性過強(qiáng)造成根尖感染：③局部血運(yùn)不佳無法形成血凝塊。MTA的正確使用是冠方封閉的保證， MTA一般充填在根管口下方2～3mm的釉-牙骨質(zhì)界。本實(shí)驗(yàn)共有7個(gè)MTA充填不良而失敗的牙齒，推測可能是因?yàn)槿拦诓繛殄F形，根管口的直徑小且移行不明顯，操作不當(dāng)或血凝塊質(zhì)量不佳都有可能造成MTA推進(jìn)根管的情況。

bFGF是一種肝素粘合多肽的成纖維生長因子，具有促進(jìn)創(chuàng)傷組織愈合，修復(fù)軟硬組織等作用。相關(guān)研究表明， bFGF 與牙本質(zhì)基質(zhì)的沉積及成釉細(xì)胞 成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化成熟有關(guān)。PDGF是一種多肽生長因子，參與各種炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖以及組織修復(fù)等過程，也可與破骨細(xì)胞受體結(jié)合促進(jìn)破骨細(xì)胞對骨的吸收，同時(shí)誘發(fā)釋放前列腺素類物質(zhì)促進(jìn)血管擴(kuò)張，使局部組織發(fā)生充血反應(yīng)，有利于傷口早期修復(fù)。同時(shí)，PDGF也是一種促進(jìn)有絲分裂以及生物趨化因子，可調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞功能，刺激成骨細(xì)胞復(fù)制，降解膠原，促進(jìn)骨形成。本實(shí)驗(yàn)通過ELISA實(shí)驗(yàn)檢測不同時(shí)期牙槽窩新鮮血液中bFGF和PDGF的含量，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組3、6個(gè)月時(shí)bFGF和PDGF的濃度升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)組組內(nèi)按時(shí)間比較時(shí)顯示bFGF濃度無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而PDGF的濃度隨時(shí)間變化呈現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。該結(jié)果表明，通過血管再生法進(jìn)行延遲再植的實(shí)驗(yàn)牙根尖周出現(xiàn)新血管和牙體硬組織生成，對于延遲再植的效果有著積極的作用。

牙髓血管再生是近年來出現(xiàn)的新型治療方法，可以有效縮短治療時(shí)間，促使牙根發(fā)育、根尖孔閉合、根管壁增厚。但牙髓血管再生的長期效果、生物學(xué)機(jī)制以及可能出現(xiàn)的不良影響仍需繼續(xù)研究，本實(shí)驗(yàn)為該項(xiàng)技術(shù)的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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(收稿：2015-09-16)

The effects of bFGF and PDGF expression in pulp revascularization. Department of Stomatology,Central Hospital of Xi’an

(Xi’an 710004 )

Zhang Xin Liu Yanli

Objective： To study the effects of pulp revascularization on the expression of bFGF and PDGF in the root tissue of young permanent dog teeth through delayed tooth replantation .Methods:4 dogs with immature teeth aged approximately 5 months were selected. The experimental group contained 11，13，15，41，43，45 and the teeth in other side as the control group. The replantation was proceeded 24 hours later when pulp revascularization was finished in experimental group and none treatment in control group. Statistical analysis was performed to detect bFGF and PDGF content after 3 and 6 months feed. Results:There were 3 blood clots without formation of, 7 poor MTA filling, 5 alveolar bone absorption of II or III degree and 3 root fracture. The concentration of the bFGF and PDGF in experimental group was increased and was significant different with the control group in 3 and 6 month. There was no significant difference in the experimental group on the concentration of bFGF according to the time comparison, while the concentration of PDGF had significant different. Conclusion:Pulp revascularization is a new treatment for delayed tooth replantation. It’s a long term effect mechanism, biology, human tissue, the mechanism of molecular biology and possible adverse effects still need to study for clinical application in the future.

Tooth/Immature @Pulp revascularization Tooth delayed replantation

*陜西省科學(xué)技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2014K11-03-08-04)

牙/解剖學(xué) @牙髓血運(yùn)重建術(shù) 牙再植術(shù)

R781.2

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.12.004

?通訊作者：第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院口腔急診與綜合臨床科