陜西省人民醫(yī)院心血管內(nèi)二科(西安710068)

程 功 陳春燕△ 壽錫凌 韓新源▲

·論著·基礎(chǔ)研究·

卡托普利對自發(fā)性高血壓大鼠胸主動脈縫隙連接蛋白43表達(dá)的影響*

陜西省人民醫(yī)院心血管內(nèi)二科(西安710068)

程 功 陳春燕△壽錫凌 韓新源▲

目的：通過比較Cx43在正常大鼠和自發(fā)性高血壓大鼠胸主動脈表達(dá)的差異, 以及經(jīng)卡托普利干預(yù)后的變化, 來闡明卡托普利抗高血壓血管重構(gòu)的分子機(jī)制。方法：12周齡自發(fā)性高血壓大鼠(SHRs)16只隨機(jī)分為對照組和卡托普利干預(yù)組,以年齡和體重匹配的Wistar-Kyoto大鼠(WKYs)為正?？瞻讓φ战M。干預(yù)組，灌胃法給予卡托普利[12.5mg·d)]，8周后，采用無創(chuàng)血壓測定儀測量3組大鼠尾動脈收縮壓；用酶聯(lián)免疫吸附法測量血漿和胸主動脈組織血管緊張素Ⅱ(AngII)濃度。采用實(shí)時定量RT-PCR和Western blot分析，檢測3組大鼠胸主動脈組織內(nèi)Cx43的mRNA及蛋白表達(dá)。結(jié)果：SHR組的血漿、動脈組織AngII濃度較WKY大鼠組明顯升高，而卡托普利干預(yù)組的血漿、組織AngII濃度則較SHR組明顯降低。SHR組胸主動脈的Cx43的mRNA表達(dá)高于WKY組(P<0.01), 卡托普利降低Cx43mRNA的表達(dá)(P<0.01)。蛋白印跡法顯示，SHR組大鼠胸主動脈中,Cx43蛋白表達(dá)高于WKY大鼠組(P<0.01)?？ㄍ衅绽档徒M織主動脈內(nèi)Cx43的蛋白表達(dá)(P<0.01)。結(jié)論：自發(fā)性高血壓大鼠主動脈Cx43表達(dá)增強(qiáng), 卡托普利能夠降低胸主動脈Cx43的表達(dá)。

縫隙連接(Gap junction，GJ)作為細(xì)胞間的直接通訊方式是由縫隙連接蛋白(Connexin，Cx)家族組成[1]。已有研究表明，GJ在調(diào)節(jié)血管舒縮以及血管平滑肌細(xì)胞增殖、表型轉(zhuǎn)變中發(fā)揮重要作用，并與高血壓的形成和發(fā)展密切相關(guān)[2]。腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(Renin angiotensin system, RAS)作為一類重要的生物活性物質(zhì)，廣泛存在于心臟、血管、腎臟等多種組織中，RAS系統(tǒng)的過度激活則是高血壓發(fā)病機(jī)制之一[3]。血管緊張素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ, AngⅡ)作為RAS系統(tǒng)循環(huán)和局部主要的效應(yīng)分子，在高血壓的發(fā)展和維持上起著重要作用。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(Angiotensin converting enzyme inhibitor, ACEI)是目前臨床上最常用的降壓藥物之一。本研究以自發(fā)性高血壓大鼠(Spontaneously hypertensive rats，SHRs)為模型，觀察經(jīng)卡托普利干預(yù)后SHR胸主動脈Cx43表達(dá)的變化, 旨在探討卡托普利抗高血壓的分子機(jī)制。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)動物分組與處理 12周齡雄性SHR大鼠16只(購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物中心)隨機(jī)分為2組：空白對照組(SHR組)和卡托普利組(SHR+Capt)，每組8只。再選取周齡、體重匹配的雄性Wistar大鼠(均購于購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物中心)8只(WKY組)作為正常對照組。將卡托普利(商品名:開博通, 百時美施貴寶公司生產(chǎn))研碎后溶于蒸餾水中制成懸液，按照12.5mg/(kg·d)的劑量灌胃給藥，給藥其間根據(jù)體重增長情況調(diào)整給藥量劑量。空白對照組和正常對照組則給予生理鹽水灌胃，均喂養(yǎng)8周。

2 血壓測量 分別于給藥前及給藥后第8周采用用無創(chuàng)尾動脈血壓測量分析系統(tǒng)測量大鼠安靜清醒狀態(tài)下尾動脈收縮壓( Systolic blood pressure, SBP)。連續(xù)測量3次,取其平均值。

3 血管緊張素Ⅱ的測定 分別測取胸主動脈和血漿中的AngⅡ含量，方法如下：①血液血管緊張素Ⅱ(AngII)測定：血壓測量結(jié)束后，穿刺右室，采血2.5 ml放入預(yù)先準(zhǔn)備的EDTA抗凝管中，搖勻，4℃ 3000 rpm離心10 min，分離血漿，放入-80℃冰箱保存待測。②心房組織AngII測定：血液標(biāo)本采集完畢后，頸椎脫臼法處死大鼠，迅速開胸游離胸主動脈，留取部分組織液氮冷凍，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。剩余部分用分析天平稱重，冰生理鹽水洗凈，加1 ml預(yù)冷的0．9%NaCl溶液中冰浴勻漿，加入蛋白酶抑制劑，95℃水浴中加熱10 min，4℃ 10000r/min離心2次，取上清液﹣80℃保存待測。AngⅡ濃度采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測，測定方法按照試劑盒說明的操作步驟進(jìn)行。

4 Real-time PCR法檢測各組大鼠胸主動脈Cx43的基因表達(dá) 按照Fast200試劑盒說明書，提取胸主動脈總RNA，核算定量儀測定所抽提RNA的濃度以及OD260/280值，OD260/280值在1.8～2.0則視為純度很高，可以進(jìn)行下一步操作。按照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)條件為37℃ 15 min( 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng))，85℃ 5 S(反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng))合成cDNA。以 NCBI Gen Bank提供的GAPDH、Cx43的cDNA序列為模板，由北京奧科生物科技公司合成引物。引物序列如下： Cx43：上游：5’- TTGTTTCTGTCACCAGTAAC -3’；下游：5’- GATGAGGAAGGAAGAGAAGC -3’； GAPDH：上游：5’-GCGCCTGGTCACCAGGGCTGCTT-3’；下游：5’-TGCCGAAGTGGTCGTGGATGACCT-3’。按照TaKaRa Real-time PCR 試劑盒操作說明進(jìn)行反應(yīng)， 采用三步法PCR擴(kuò)增程序，第一步95℃3min，第二步PCR反應(yīng)95℃10s，59℃30s，72℃30s，40個循環(huán)，第三步55℃10s，81個循環(huán)。擴(kuò)增曲線完成后自動生成融解曲線，反應(yīng)完成后確認(rèn)擴(kuò)增曲線和融解曲線。根據(jù)Bio-Rad iQ5 Real-time PCR儀軟件得出的各個樣本的CT值，按照2-△△Ct法計算各個基因的相對表達(dá)量；用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)PCR產(chǎn)物，只有單一的擴(kuò)增條帶，未見引物二聚體等非特異性條帶,說明擴(kuò)增反應(yīng)是特異的。

5 Western blot測定各組大鼠胸主動脈Cx43的蛋白表達(dá) 提取動脈組織總蛋白并用BCA法測定蛋白濃度，按每泳道加總蛋白20μg 用10%SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳分離，電泳后用半干轉(zhuǎn)印法110V，2h轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%TBST奶室溫封閉1小時后加入1∶1000稀釋的Cx43一抗(Abcam，英國)、GAPDH(1∶1000稀釋)，4℃孵育過夜。用TBST洗膜3次后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗室溫孵育1h，與增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)(A：B=1∶1)于暗處反應(yīng)5min，后利用Chemidoc化學(xué)發(fā)光儀顯影成像，以BIO-RAD公司的Quantity One成像分析系統(tǒng)進(jìn)行WB條帶的灰度值分析。以目的蛋白與內(nèi)參蛋白GAPDH比值作為目的蛋白的相對表達(dá)量。

結(jié) 果

1 各組大鼠血壓比較 3組大鼠尾動脈血壓顯示，給藥前, SHR對照組和卡托普利組收縮壓均顯著高于WKY組(均P<0.01) 。給藥結(jié)束后, SHR組平均動脈壓較Wistar組仍顯著升高；而卡托普利干預(yù)組平均動脈壓較高血壓組顯著降低(P<0.01)，但和Wistar組無顯著差異(P>0.05)，見表1。

2 各組大鼠血漿及組織Ang II濃度比較 SHR組大鼠血漿、組織Ang II濃度較WKY組明顯升高(P<0.01,P<0.001)，卡托普利干預(yù)組血漿及組織勻漿Ang II濃度較SHR組明顯降低(P<0.01,P<0.001)，見表2。

表1 各組大鼠干預(yù)前后血壓的比較

注：與WKY組比較*P<0.01；與SHR比較#P<0.01

表2 各組大鼠血漿及組織Ang II濃度比較

注：與WKY組比較*P<0.01，**P<0.001；與SHR比較#P<0.01，##P<0.001

3 卡托普利對大鼠胸主動脈Cx43mRNA表達(dá)的影響 SHR對照組胸主動脈Cx43 mRNA的表達(dá)為WKY組的1.57倍(P<0.01)，而卡托普利干預(yù)組Cx43 mRNA的表達(dá)則較SHR對照組明顯降低(P<0.01)，且卡托普利干預(yù)組與WKY組間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.01)。

4 卡托普利對大鼠胸主動脈Cx43蛋白表達(dá)的影響 SHR對照組胸主動脈Cx43蛋白表達(dá)高于WKY組79%(P<0.0.1)，而卡托普利干預(yù)組的Cx43蛋白表達(dá)量則低于SHR對照組的74%(P<0.01)。

討 論

縫隙連接通道的基本組成單位是連接蛋白，由6個Cx圍成，小體中央形成直徑1. 5 nm 的親水管道，即為Cx 半通道。相鄰細(xì)胞間的Cx 半通道對接而組成完整GJ 通道[4]。在心血管系統(tǒng)，縫隙連接通道是心肌細(xì)胞、血管的內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞間通訊的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。在血管組織，縫隙連接通道間傳導(dǎo)的信號能夠協(xié)調(diào)血管的收縮和舒張。血管是一個三層的組織結(jié)構(gòu)主要由內(nèi)膜的內(nèi)皮細(xì)胞、中膜的平滑肌細(xì)胞和外模的成纖維細(xì)胞構(gòu)成，內(nèi)皮細(xì)胞主要表達(dá)Cx37、Cx40和少量Cx43，而平滑肌細(xì)胞則主要表達(dá)Cx43、Cx45及少量的Cx37和Cx40[5]。血管壁重構(gòu)導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞機(jī)械應(yīng)力的變化能夠影響Cx的表達(dá)。

國內(nèi)外的研究已證實(shí)，無論是自發(fā)性高血壓大鼠還是腎性高血壓大鼠主動脈的Cx43表達(dá)均發(fā)生了改變，但這些研究結(jié)果并非完全一致。對于SHR大鼠，有研究認(rèn)為主動脈Cx43的表達(dá)升高，但也有研究認(rèn)為Cx43的表達(dá)則是下降的；而在腸系膜動脈，Cx43的mRNA水平則在自發(fā)性高血壓大鼠與正常血壓大鼠間無明顯差異[6，7]。但是對于腎性高血壓，大多數(shù)研究認(rèn)為Cx43的表達(dá)升高。本研究選取自發(fā)性高血壓大鼠，通過觀察其胸主動脈Cx43的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)自發(fā)性高血壓大鼠胸主動脈Cx43的表達(dá)相對正常血壓大鼠明顯上升，這與既往的研究結(jié)果相符。

RAS的激活在高血壓的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，尤其是組織局部存在的RAS更是在神經(jīng)-體液調(diào)節(jié)機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用。本實(shí)驗(yàn)觀察到自發(fā)性高血壓大鼠血漿AngⅡ含量較WKY大鼠組明顯升高，而在血管組織中AngⅡ的含量也較WKY組高?？ㄍ衅绽麨榕R床上常用的ACEI制劑，本研究中卡托普利的使用，同時降低了血漿和血管組織AngⅡ含量，但對血管組織的效應(yīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于對血漿AngⅡ含量的影響。這一結(jié)果進(jìn)一步說明了組織局部RAS系統(tǒng)的激活，在高血壓發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。

Alonso等研究發(fā)現(xiàn)AngⅡ能濃度依賴性增加動脈平滑肌細(xì)胞Cx43蛋白的表達(dá), 而該效應(yīng)與ERK和NF-kB通路的激活有關(guān)。本研究報道大鼠胸主動脈Cx43較正常高血壓大鼠表達(dá)增高, 而卡托普利能降低大鼠動脈Cx43的表達(dá)?？ㄍ衅绽倪@一作用可能是通過降低血管組織AngⅡ的濃度，從而影響了動脈平滑肌細(xì)胞Cx43的表達(dá)。此研究為ACEI類藥物在高血壓的治療提供了新的理論依據(jù)。

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(收稿：2015-07-15)

Effects of captopril on the expression of connexin 43 in thoracic aorta from spontaneous hypertensive rats Second Department of Cardiology, Shaanxi Provincial People’s Hospital

( Xi’an 710068)

Cheng Gong Chen Chunyan Shou XiLing et al

Objective:To investigate the differential expression of connexin 43 in thoracic aorta between spontaneously hypertensive rats(SHRs)and Wistar-Kyoto rats(WKYs),and effects of captopril on the expression of Cx43 in thoracic aorta of SHR and possible underlying mechanism.Methods:Sixteen 12-weeks old male SHRs were randomly divided into two groups：SHR control group receiving placebo and captopril group receiving captopril 12.5mg/(kg·d).Another eight WKY rats served as blank control group.Before and after eight weeks treatment, rats arterial pressure of tail were measured.When the treatment finished, plasma angiotensin II level and thoracic aortic tissue angiotensin II level were measured with enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) method.Moreover,Cx43 mRNA and protein levels in thoracic aortic tissue were determined by RT-PCR and Western blot.Results: The plasma and thoracic aortic tissue angiotensin II levels were significantly increased in SHR as compared with the WKY group and captopril reduced the plasma and thoracic aortic tissue angiotensin II as compared with the SHR group(P<0.01).The expression of Cx43 mRNA in thoracic aorta of SHR group was obviously higher than that in the WKY rats(P<0.01)and was markedly decreased by captopril treatment(P<0.01).Cx43 protein level was higher as compared with that in WKY rats(P<0.01).Treatment with captopril significantly down-regulated Cx43 protein expression(P<0.01).Conclusion: The expression of Cx43 up-regulated in thoracic aorta of SHR and captopril treatment can ameliorate Cx43 increasing in thoracic aorta of SHR.

Angiotensin Ⅱ Captopril Connexins Animals,laboratory Rat

*陜西省自然科學(xué)基金(2013JC2-16)

血管緊張素II 卡托普利 連接蛋白類 動物，實(shí)驗(yàn) 大鼠

R544.1

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.12.001

△西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科

▲通訊作者