陜西省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)三科(西安710068)

劉 鵬 王 瑾△ 劉 玥 唐 鵬 李 銳▲

睡眠剝奪對大鼠腦內(nèi)Aβ表達(dá)的影響*

陜西省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)三科(西安710068)

劉 鵬 王 瑾△劉 玥 唐 鵬 李 銳▲

目的：觀察睡眠剝奪(SD)后大鼠學(xué)習(xí)記憶功能及腦內(nèi)Aβ含量的變化，探討睡眠剝奪導(dǎo)致認(rèn)知功能減退的機(jī)制。方法： 健康Sprague-Dawley大鼠32只隨機(jī)平均分為4組，對照3d組(Control-3)，睡眠剝奪3d組(SD-3)，對照9d組(Control -9)，睡眠剝奪9d組(SD-9)。對照組自由食水，良好睡眠；睡眠剝奪組建立睡眠剝奪模型。各組在觀察時間點(diǎn)進(jìn)行Morris水迷宮評價(jià)學(xué)習(xí)記憶功能之后，斷頭取腦，用免疫組織化學(xué)染色方法觀察海馬區(qū)Aβ的表達(dá)情況。結(jié)果：①與對照3d組相比，對照9d組逃逸潛伏期及目標(biāo)象限時間變化均不大(P>0.05)，但SD 3d組逃逸潛伏期延長，目標(biāo)象限時間縮短(P<0.05)。與對照9d組相比，SD 9d組逃逸潛伏期明顯延長，目標(biāo)象限時間明顯縮短(P<0.01)。與SD 3d組相比，SD 9d組逃逸潛伏期延長，目標(biāo)象限時間縮短(P<0.05)。②與對照3d組相比，對照9d組海馬區(qū)Aβ表達(dá)變化不大(P>0.05)，但SD 3d組海馬區(qū)Aβ表達(dá)增多(P<0.05)。與對照9d組相比，SD 9d組海馬區(qū)Aβ表達(dá)明顯增多(P<0.01)。與SD 3d組相比，SD 9d組海馬區(qū)Aβ表達(dá)增多(P<0.05)。結(jié)論： 睡眠剝奪可導(dǎo)致大鼠學(xué)習(xí)及空間記憶功能減退，且具有時間依賴性，其機(jī)制可能與睡眠剝奪可增加腦內(nèi)海馬區(qū)Aβ含量有關(guān)。

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一種神經(jīng)系統(tǒng)慢性退行性疾病，為癡呆最常見的原因，約占全部癡呆的50%～60%左右[1]，其病理特征之一為腦內(nèi)出現(xiàn)大量老年斑，核心成份是β-淀粉樣蛋白(β-amyloid protein, Aβ)。現(xiàn)已證實(shí)，Aβ沉積是AD最早的病理改變和發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[2]。研究表明，睡眠剝奪(Sleep deprivation,SD)可導(dǎo)致記憶力下降，影響認(rèn)知功能，與AD的發(fā)病有一定關(guān)系[3]。本文通過復(fù)制SD大鼠模型，觀察不同時間長短的SD對大鼠的學(xué)習(xí)和記憶功能的影響，同時觀察其腦內(nèi)海馬區(qū)Aβ的表達(dá)，進(jìn)一步明確SD與AD的關(guān)系。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)動物與分組 健康SD大鼠32只，5～7月齡，體重180±20g，雌雄不拘，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。隨機(jī)平均分為4組，對照3d組(Control-3)，睡眠剝奪3d組(SD-3)，對照9d組(Control -9)，睡眠剝奪9d組(SD-9)。自由進(jìn)食，食標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料，飲自來水。

2 動物模型制作及實(shí)驗(yàn)流程 使用改良多平臺睡眠剝奪法(MMPM)[4]對大鼠進(jìn)行睡眠剝奪，每日僅允許睡眠2h，睡眠剝奪期間室內(nèi)40W白熾燈照明，睡眠期間保持室內(nèi)黑暗，整個過程避免噪音。

實(shí)驗(yàn)前，每亞組8只大鼠同籠飼養(yǎng)，每天于多平臺上適應(yīng)2h，共2周，之后再開始正式實(shí)驗(yàn)。根據(jù)觀察時間不同，睡眠剝奪分別進(jìn)行3d、9d，對照組置于大平臺，自由食水，良好睡眠。

每只大鼠在觀察時間點(diǎn)處死前行Morris水迷宮認(rèn)知功能測評，然后斷頭取腦，做腦組織切片免疫組織化學(xué)染色，觀察大腦海馬區(qū)的Aβ表達(dá)情況。

3 材料與試劑 兔抗大鼠Aβ、即用型SABC試劑盒、DAB顯色試劑盒、正常山羊血清均由武漢博士德公司提供；通用Morris水迷宮，上海吉量科技公司。

4 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 大鼠熟悉環(huán)境l周，然后嚴(yán)格按文獻(xiàn)記載進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)。由視頻監(jiān)視探頭記錄實(shí)驗(yàn)過程，每只大鼠在同一平臺上游泳，記錄動物找到平臺逃逸的潛伏期，游泳總路程及游泳速度，共測試3次記錄其平均值。允許其在120s內(nèi)找到平臺，找到后在平臺上保持20s。若在120s內(nèi)找不到平臺，則將大鼠引導(dǎo)至平臺上保持20s，并將潛伏時記錄為120s。

5 腦組織切片的制作 麻醉后用0.9%氯化鈉溶液和多聚甲醛進(jìn)行心臟灌注固定，斷頭取腦。在大腦半球距嗅球尖端7～11mm之間冠狀切取約5mm厚腦組織塊，固定、脫水、包埋成臘塊，連續(xù)切片，片厚5μm。每只動物連續(xù)取3張切片,用于免疫組化染色。

6 腦組織Aβ免疫組化染色觀察 取各組大鼠腦切片行Aβ免疫組化染色。應(yīng)用圖像信號采集與分析系統(tǒng)，光鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)大腦海馬區(qū)各5個不重疊視野(×40)下Aβ陽性斑塊個數(shù)求均數(shù)。

結(jié) 果

1 睡眠剝奪對大鼠學(xué)習(xí)及空間記憶能力的影響 見表1。

表1 各組大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)潛伏期和目標(biāo)象限時間的比較(±s)

注：與Control-3比較*P<0.05;與Control-3比較#P>0.05;與Control-9比較△P<0.01;與SD-3比較△P<0.05

與對照3d組相比，對照9d組逃逸潛伏期及目標(biāo)象限時間變化均不大(P>0.05)，但SD 3d組逃逸潛伏期延長，目標(biāo)象限時間縮短(P<0.05)。與對照9d組相比，SD 9d組逃逸潛伏期明顯延長，目標(biāo)象限時間明顯縮短(P<0.01)。與SD 3d組相比，SD 9d組逃逸潛伏期延長，目標(biāo)象限時間縮短(P<0.05)

2 睡眠剝奪對大鼠腦海馬區(qū)Aβ表達(dá)的影響 見表2。

表2 各組大鼠腦海馬區(qū)Aβ斑塊數(shù)的比較(±s)

注：與Control-3比較*P<0.05;與Control-3比較#P>0.05;與Control-9比較△P<0.01;與SD-3比較△P<0.05

與對照3d組相比，對照9d組海馬區(qū)Aβ斑塊數(shù)變化不大(P>0.05)，但SD 3d組海馬區(qū)Aβ斑塊數(shù)增多(P<0.05)。與對照9d組相比，SD 9d組海馬區(qū)Aβ斑塊數(shù)明顯增多(P<0.01)。與SD 3d組相比，SD 9d組海馬區(qū)Aβ斑塊數(shù)增多(P<0.05)。

討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，睡眠剝奪(SD)可影響大鼠學(xué)習(xí)能力及空間記憶功能，且隨睡眠剝奪時間延長而影響加大。同時，睡眠剝奪能增加大鼠腦內(nèi)海馬區(qū)淀粉樣蛋白β(Aβ)的表達(dá)，同樣存在時間依賴性。因此，我們認(rèn)為睡眠剝奪與阿爾茨海默病的發(fā)生有密切關(guān)系。

AD為最常見的癡呆病因，嚴(yán)重危害人類健康，但其病因和發(fā)病機(jī)制還不完全清楚。在病理學(xué)上，AD以腦內(nèi)出現(xiàn)大量老年斑和神經(jīng)原纖維纏結(jié)為特征。其中老年斑的核心成份是Aβ?，F(xiàn)已證實(shí)，Aβ沉積是AD最早的病理改變和發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[2]，Aβ是淀粉樣蛋白前體(APP)經(jīng)過β分泌酶及γ分泌酶切割后的產(chǎn)物，由40(Aβ-40)或42～43(Aβ-42，43)個氨基酸組成的蛋白質(zhì)。

有研究表明，睡眠障礙與AD發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系[5，6]。Brendan等發(fā)現(xiàn)，腦內(nèi)Aβ濃度存在明確的晝夜波動，正常睡醒周期下，覺醒時腦內(nèi)Aβ濃度增多，睡眠時Aβ濃度減少?？赡芘c覺醒時神經(jīng)元活動增多，產(chǎn)生Aβ增多超過了大腦對其的清除，睡眠時神經(jīng)元活動減少，Aβ產(chǎn)生較少而清除增多所致。本研究發(fā)現(xiàn)，睡眠剝奪不但影響大鼠的學(xué)習(xí)能力和空間記憶能力，而且可增加大鼠腦內(nèi)海馬區(qū)Aβ的表達(dá)，且均有時間依賴性，有良好的一致性。說明睡眠剝奪可以增加腦內(nèi)Aβ的表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)AD的發(fā)生發(fā)展。但目前對睡眠障礙導(dǎo)致AD的具體機(jī)制尚不清楚，可能與下列學(xué)說有關(guān)：①神經(jīng)元活性學(xué)說：研究表明，覺醒時間過長時神經(jīng)元活性增強(qiáng)，活性增強(qiáng)的神經(jīng)元可導(dǎo)致更多的Aβ沉積，睡眠時則相反；②應(yīng)激反應(yīng)學(xué)說：睡眠障礙是一種典型的應(yīng)激源，可產(chǎn)生三種應(yīng)激反應(yīng)，即神經(jīng)體液反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。研究表明，睡眠剝奪作為一種應(yīng)激源，同其他應(yīng)激形式如孤養(yǎng)，噪音干擾，氣味干擾，強(qiáng)迫游泳等一樣均可增加腦內(nèi)Aβ沉積。③褪黑素學(xué)說：睡眠剝奪可使腦內(nèi)褪黑素減少，而褪黑素有減少Aβ的生成，聚集及沉積，并可保護(hù)神經(jīng)元免受Aβ的損害等作用，故睡眠剝奪可通過減少褪黑素影響AD的發(fā)生。

綜上所述，本研究證實(shí)了睡眠剝奪可影響大鼠學(xué)習(xí)記憶功能，且具有時間依賴性，其機(jī)制可能是增加大鼠腦內(nèi)海馬區(qū)Aβ的沉積所致。

[1] Blennow K,De LM,Zetterberg H.Alzheimer'sdisease[J].Lancet,2006,368(9522):387-403.

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[6] Jae-Eun K,Miranda ML,Randall J.Bateman.Amyloid-βare regulated by orexin and the sleep-wake cycle[J].Science,2009,326(5955):1005-1007.

(收稿：2014-10-30)

*陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目(2013JM4020)

睡眠剝奪 學(xué)習(xí)障礙 記憶障礙 淀粉樣β蛋白 動物，實(shí)驗(yàn) 大鼠

R742

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.08.003

△西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

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