趙魯寧 李貴陽 李 杰 李 晨 張樂萃 莫照蘭①

(1. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院 青島 266109; 2. 農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點實驗室 青島 266071;3. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島 266071)

鰻弧菌(Vibrio anguillarum)為革蘭氏陰性菌, 廣泛存在于沿岸海水、沉積物和海洋動物體體表和腸道中, 在世界范圍內(nèi)已引起多種淡水和海水魚類出血性敗血癥(Austinet al, 1995), 還可感染對蝦和貝類引起死亡(Aguirre-Guzmanet al, 2004; Christineet al,2004)。對病原進行血清型鑒定對流行病學(xué)研究和疾病控制具有重要意義, 美國、日本、丹麥、中國臺灣的學(xué)者建立了鰻弧菌的各種血清型分型系統(tǒng)(Gouldet al, 1979; Ezuraet al, 1980; Kitaoet al, 1983, 1984;Chartet al, 1984; S?rensenet al, 1986; Tajimaet al,1986a, 1986b; Songet al, 1988; Austinet al, 1995), 其中, 日本學(xué)者Kitao等(1983)將267株魚源鰻弧菌分為A—F血清型, 而Tajima和Ezura則將鰻弧菌分為JO1—JO8 (Tajimaet al, 1986a, 1986b); 丹麥學(xué)者S?rensen等(1986)綜合了上述學(xué)者的血清型分析系統(tǒng), 在吸收日本的JO1—JO3和A、B、C血清分型系統(tǒng)基礎(chǔ)上, 建立了一種簡單實用的血清分型系統(tǒng), 將來自魚類、環(huán)境和其它脊椎動物的鰻弧菌分為 O1—O10血清型,后來Grisez等(1995)和Pedersen等(1999)進一步補充,將鰻弧菌的血清型擴展至23種血清型。在23種血清型中, O1、O2以及部分的O3血清型為主要的致病性血清型(Pedersenet al, 1999), 后來發(fā)現(xiàn)O2a、O2b以及另外一種新的O2血清型亞型是引起大西洋鱈魚弧菌病的主要病原(Knappskoget al, 1993; Larsenet al,1994; Mikkelsenet al, 2007)。鰻弧菌的致病機理也得到深入研究, 一些與趨化性、運動力、粘附、侵襲、繁殖和生長相關(guān)的致病因子已經(jīng)被鑒定(Nakaet al,2011)。例如, 多數(shù)的O1血清型菌株都攜帶一個65kb的毒性質(zhì)粒 pJM1, 該質(zhì)粒編碼鐵攝取系統(tǒng), 而一些不攜帶質(zhì)粒的O1、O2、O3血清型菌株則在染色體上編碼鐵攝取系統(tǒng)(Soengaset al, 2006; Baladoet al,2008)。

近 20年來, 我國海水養(yǎng)殖對蝦(鄭國興等,1990)、鱸魚(肖慧等, 1999)、大黃魚(李清祿等, 2001)、牙鲆(莫照蘭等, 2002)、大菱鲆(陳吉祥等, 2005)等受到鰻弧菌的侵染, 帶來了嚴重的經(jīng)濟損失。國內(nèi)尚未系統(tǒng)開展鰻弧菌流行病學(xué)研究, 也不清楚當前流行于我國海水養(yǎng)殖的鰻弧菌主要有哪些血清型, 給疾病監(jiān)測和疫苗防治帶來了困難。本研究針對自 1999年以來分離和收集的臨床鰻弧菌菌株進行生理生化、16S rRNA基因序列、血清分型、抗生素敏感性的分析, 旨在系統(tǒng)了解存在于我國海水養(yǎng)殖環(huán)境的鰻弧菌血清學(xué)特征及耐藥特征, 為深入闡明鰻弧菌的分子流行病學(xué)和疾病控制提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 菌株和實驗動物

本研究所用菌株見表1, 其中M0、M1由黃海所王印庚研究員贈送, 0401、1703、2301、112601、MN由黃海水產(chǎn)研究所王秀華研究員贈送, 279、285由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心梁利國博士贈送, 其余為本實驗室保藏菌株。體重2.0—2.5 kg的健康新西蘭大白兔(Oryctolagus cuniculus)購自青島康大兔業(yè)發(fā)展有限公司, 實驗前暫養(yǎng)一周。

表1 本研究所用鰻弧菌菌株Tab.1 V. anguillarum strains used in this study

1.2 兔抗鰻弧菌血清制備

將表1所示的5株鰻弧菌ATCC標準菌株(O1—O5血清型)分別在胰大豆蛋白胨瓊脂(TSA)平板劃線,于 28°C培養(yǎng) 24h, 挑取單菌落轉(zhuǎn)接胰大豆蛋白胨肉湯(TSB)培養(yǎng)過夜, 取適量菌液涂布 TSA 平板, 于28°C培養(yǎng)24h后用無菌的PBS緩沖液(0.01mol/L, pH 7.3)沖洗菌苔, 收集菌液于 100°C水浴滅活 2.5h后,再4000g離心10min, 收集菌體并用PBS重懸, 所得菌懸液用麥氏比濁管調(diào)整濃度至 109CFU/mL, 所得菌液即為鰻弧菌O抗原, 置于4°C冰箱保存。

按照文獻方法免疫新西蘭大白兔制備兔抗血清,制備的血清效價>1: 1600, 將得到的兔抗血清采用血清非特異抗原吸附法對兔抗血清進行純化(竇勇等,2007)。

1.3 鰻弧菌株的生理生化及抗生素敏感性檢測

用API ID 32E生化反應(yīng)試劑條和ATB藥敏檢測系統(tǒng)(均購自法國梅里埃, BioMrieux)檢測鰻弧菌的生化反應(yīng)和抗生素藥物敏感性, 使用 ATBTMNew軟件判讀結(jié)果。用 NYSYpc2.1軟件的非加權(quán)組平均法(UPGMA)對生化反應(yīng)性狀進行聚類分析。

1.4 鰻弧菌株16S rRNA基因序列分析

按文獻方法擴增鰻弧菌 16S rRNA基因序列(莫照蘭等, 2002), 所用引物為 27F (5’-AGAGTTTGAT CMTGGCTCAG-3’和 1492R (5’-TACGGYTACCTTG TTACGACTT-3’), 所得 PCR產(chǎn)物經(jīng)上海桑尼生物科技有限公司測序, 所得序列在 NCBI上使用 BLAST程序進行比對。從 GenBank數(shù)據(jù)庫中獲取其它細菌16S rRNA基因序列, 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹, 用MEGA5.2軟件采用鄰位相連法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹, 用 Kimura模式計算遺傳距離, 用 Boostrap法重復(fù)1000次進行評估(Saitouet al, 1987)。

1.5 鰻弧菌血清型的鑒定

采用玻片凝集法進行鰻弧菌血清型鑒定。具體步驟為: 將鰻弧菌在TSA劃線, 挑取培養(yǎng)24h的菌落與20μL兔抗血清在玻璃片上混勻; 設(shè)置兩組陰性對照:一組為細菌與20μL PBS混合, 另一組為20μL血清。所有混合物在10min內(nèi)觀察凝集情況, 并記錄結(jié)果。

2 實驗結(jié)果

2.1 生理生化檢測結(jié)果

表2 鰻弧菌的API ID 32E生理生化分析結(jié)果Tab.2 Biochemical characteristics of V. anguillarum analyzed with API ID 32E

對31株臨床分離菌株和5株標準菌株進行生理生化分析。所有菌株均為革蘭氏陰性菌, 在2216E海水培養(yǎng)基和TSA培養(yǎng)基上生長良好。API ID 32E鑒定結(jié)果顯示, 所有 36株菌在吲哚的反應(yīng)為陽性, 在賴氨酸脫羧酶、脲酶、L-阿拉伯糖醇、5-酮基葡萄糖酸鈉、側(cè)金盞花醇、β-葡萄糖酸酶、N-乙酰-β葡萄糖苷酶、D-阿拉伯糖醇、肌醇的反應(yīng)為陰性; 有 35株菌分別在β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶和精氨酸雙水解酶反應(yīng)為陽性(表 2)。特別指出的是有2株菌的生理生化反應(yīng)呈現(xiàn)特殊性: 菌株 34在酚紅、L-天門冬素芳胺酶和古老糖的反應(yīng)為陽性, 而其它菌株反應(yīng)均為陰性; 菌株L62的α-葡萄糖反應(yīng)顯示陽性, 而其它菌株反應(yīng)均為陰性。上述結(jié)果表明, 待檢菌株既有穩(wěn)定的生理生化性狀, 也有生理生化性狀的多樣性。根據(jù)API ID 32E鑒定系統(tǒng)軟件的鑒定結(jié)果, 未能將待檢菌株鑒定到種的水平。應(yīng)用UPGMA方法對生理生化形狀的相似性進行聚類分析, 按照相似性>80%分為8個亞型, 其中Ⅱ型菌株數(shù)量最多(圖1)。

圖1 基于鰻弧菌生理生化性狀的UPGMA聚類分析Fig.1 Dendrogram of V. anguillarum strains analyzed with UPGMA cluster algorithm based on biochemical characteristics

2.2 16S rRNA基因序列分析

對31株臨床分離菌株和5株鰻弧菌標準菌株進行16S rRNA基因擴增, 得到的序列在GenBank上進行BLAST, 結(jié)果顯示, 所有菌株的序列均與GenBank中鰻弧菌(V. anguillarum)的16S rRNA基因序列具有最高相似性(99%—100%)。系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果顯示,所檢測的菌株與5株鰻弧菌ATCC菌株聚為一大簇,其它弧菌菌株聚為不同的幾簇(圖 2)。這個結(jié)果表明臨床菌株與鰻弧菌具有最近的親緣關(guān)系, 可鑒定為鰻弧菌。

2.3 鰻弧菌血清型鑒定

利用鰻弧菌標準菌株(O1-O5血清型)制備的兔抗血清對31株鰻弧菌臨床菌株進行血清型分型。結(jié)果如表3顯示, 檢測到16株O1血清型菌株, O2、O3、O5血清型分別為5、3、1株, 沒有檢測到有O4血清型菌株, 有6株菌株不屬于O1—O5血清型。

圖2 鰻弧菌和其它弧菌的16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(括號指菌株的血清型)Fig.2 Phylogenetic tree of V. anguillarum and other Vibrio sp. strains based on 16S rRNA gene sequences(the bracket presents serotype assigned for the strain)

表3 鰻弧菌血清型分型Tab.3 Serotyping of V. anguillarum strains

2.4 鰻弧菌抗生素敏感性檢測

對所有鰻弧菌菌株進行 ATB藥敏檢測, 統(tǒng)計結(jié)果顯示, 97.2%(35株)的鰻弧菌菌株對氟甲喹、奧索利酸、大觀霉素、慶大霉素等4種抗生素敏感, 94.4%(34株)菌株對依氟沙星和安普霉素敏感, 90.9%菌株(33株)對呋喃妥因和卡那霉素敏感。所有菌株對林可霉素、夫西地酸、甲硝唑、阿莫西林、阿莫西林/克拉維酸、苯唑西林、青霉素等 7種抗生素產(chǎn)生耐藥,94.4%(34株)的菌株對紅霉素、原始霉素、泰洛星等3種抗生素耐藥, 86.1%(31株)菌株對磺胺甲惡唑耐藥。圖3給出了鰻弧菌對不同抗生素產(chǎn)生耐藥率。

從耐藥數(shù)量來看, 所有的 36株鰻弧菌菌株對 9種以上的抗生素產(chǎn)生耐藥性, 有11株菌(30.6%)對12種抗生素產(chǎn)生耐藥性。83.3%的菌株(30株)對12種以上的抗生素產(chǎn)生耐藥, 其中有 24株 O1—O3血清型臨床分離株。2002年分離到的 3株 O3血清型菌株(SMP1, SMP3, SMP4)對 18—19種抗生素產(chǎn)生耐藥,2003年分離到的一株菌 MHK3(非 O1—O3血清型)對26種抗生素產(chǎn)生耐藥(表4)。耐藥種類涵蓋大環(huán)內(nèi)酯類(紅霉素, 林克霉素, 原始霉素, 泰洛星)、多肽類抗生素(粘菌素)、β-內(nèi)酰胺類(青霉素, 阿莫西林, 苯唑西林, 頭孢噻吩)。

使用 UPGMA方法對抗生素敏感性進行聚類分析, 按照相似形>80%分為7個亞型, 其中Ⅰ型菌株數(shù)量最多(圖4)。

2.5 血清型與表型和基因型之間的關(guān)系

圖3 鰻弧菌對不同抗生素的耐藥率Fig.3 Percentage of V. anguillarum strains against different antibiotics

比較鰻弧菌血清型與生理生化聚類分析的結(jié)果,發(fā)現(xiàn)O1、O3血清型的大部分臨床菌株分別聚為Ⅱ型和Ⅴ型, 但未與相應(yīng)的標準血清型菌株聚在一起, 其它的菌株也與相應(yīng)的標準血清型菌株分屬不同的亞型。比較血清型與抗生素聚類分析的結(jié)果, 發(fā)現(xiàn)O1血清型的大部分臨床菌株與 O1血清型標準菌株ATCC43305聚為Ⅰ型, 其它的菌株與相應(yīng)的標準血清型菌株分屬不同的亞型。比較血清型與16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果, 發(fā)現(xiàn)所有O1血清型臨床菌株與鰻弧菌標準菌株 ATCC43305(O1)聚為一支, 有 2株O2臨床株與標準菌株ATCC43306(O2)聚為一支, 3株O3臨床菌株與標準菌株ATCC43307(O3)聚為一支。

表4 鰻弧菌耐藥分析Tab.4 Analysis of the antibiotics resistance of V. anguillarum strains

圖4 基于鰻弧菌抗生素敏感性狀的UPGMA聚類分析(括號指菌株的血清型)Fig.4 Dendrogram of V. anguillarum strains analyzed with UPGMA cluster algorithm based on antibiotics sensitivity(the bracket presents serotype assigned for the strain)

上述結(jié)果表明, 鰻弧菌的血清型與其生理生化性狀、抗生素敏感性狀、16S rRNA基因序列存在一定的相關(guān)性, 其中血清型與16S rRNA基因序列的相關(guān)性更明顯。相同血清型的菌株數(shù)量越多, 相關(guān)性越顯著。

3 討論

本研究對1999—2013年從海水養(yǎng)殖環(huán)境分離得到的臨床鰻弧菌菌株進行了表型和基因型的分類鑒定, 旨在確證這些細菌的分類地位。傳統(tǒng)的表型鑒定方法是通過對細菌形態(tài)和生理生化反應(yīng)的特征進行分類地位的分析。本研究在確定分離菌株為革蘭氏陰性菌后, 利用API ID 32E細菌快速鑒定系統(tǒng)對分離菌株開展 32項生理生化反應(yīng)指標的分析, 由于該快速檢測系統(tǒng)主要用于陸地腸桿菌科和其它革蘭氏陰性桿菌的鑒定, 海洋細菌模式種信息較少, 利用該系統(tǒng)未能將鑒定到種的地位。細菌的16S rRNA基因具有特征性的進化序列, 已被廣泛用于細菌的分類和鑒定的分子標記, 本研究對分離菌株的16S rRNA基因序列進行分析, 結(jié)果顯示所有臨床株的 16S rRNA基因序列與標準鰻弧菌的相似性為 99%—100%, 在發(fā)育進化樹中緊密地聚為一簇, 說明它們在進化中具有最近的親緣關(guān)系。綜合生理生化和16S rRNA基因的分析結(jié)果, 我們將這些待測菌鑒定為鰻弧菌。

細菌的血清學(xué)分型是根據(jù)細菌表面抗原(外膜蛋白和脂多糖)的不同, 將細菌分成不同血清型。O1、O2、O3血清型鰻弧菌可引起魚類疾病(Pedersenet al,1999), O1和O2血清型分布在世界各地, O3血清型在丹麥、意大利和日本等國家偶有發(fā)現(xiàn)(Larsenet al,1994; Tiainenet al, 1997)。本研究結(jié)果顯示, 在31株臨床分離菌株中, O1型菌株數(shù)量最多, 其次為 O2、O3血清型菌株。本研究結(jié)果說明了流行于我國海水養(yǎng)殖魚類的鰻弧菌存在3種潛在的致病性血清型, O1血清型菌株為主要的流行株。值得注意的是本次研究發(fā)現(xiàn)三株 O3血清型菌株(SPM1, SPM3, SMP4), 于2002年分離自苗種來源魚歐洲的發(fā)病大菱鲆, 說明引種可導(dǎo)致外來病原入侵的危險。通過比較血清型分型結(jié)果與表型和基因型的聚類分析結(jié)果, 我們嘗試建立血清型與生理生化表型和基因型的對應(yīng)關(guān)系,結(jié)果顯示鰻弧菌的血清型與其生理生化性狀、抗生素敏感性狀、16S rRNA基因序列存在一定的相關(guān)性, 其中血清型與16S rRNA基因序列的相關(guān)性更明顯。

病原菌的耐藥性, 特別是對多種抗生素的多耐藥性給水產(chǎn)養(yǎng)殖和人類健康帶來嚴重的安全問題。細菌的耐藥性有天然性耐藥和獲得性耐藥, 前者是由細菌染色體存在的耐藥基因決定, 后者是在抗生素選擇壓力下, 某種細菌通過基因水平轉(zhuǎn)移從別的細菌獲得了抗性基因。本研究利用 ATB藥敏系統(tǒng)檢測了鰻弧菌株的耐藥性, 結(jié)果顯示鰻弧菌對 β-內(nèi)酰胺類(阿莫西林、阿莫西林/克拉維酸、苯唑西林、青霉素)、林可酰胺類(林克霉素)、硝咪唑類(甲硝唑)和夫西地酸的耐藥率為 100%, 其原因可能是鰻弧菌對這些抗生素具有天然性耐藥的結(jié)果。另外, 結(jié)果還顯示鰻弧菌對紅霉素(大環(huán)內(nèi)酯類)、原始霉素、泰洛星等3種抗生素的耐藥率為94%(34株), 對磺胺甲惡唑的耐藥率為86%(31株)。紅霉素和原始霉素常用于醫(yī)院的臨床治療, 紅霉素還常用作水產(chǎn)飼料添加劑; 泰洛星為畜禽專用抗生素, 作為飼料添加劑用于預(yù)防畜禽疾病和促進畜禽生長發(fā)育; 磺胺類藥物具有廣譜性抗菌作用而廣泛用于水產(chǎn)養(yǎng)殖。根據(jù)這些分析, 我們認為鰻弧菌對上述四種藥物產(chǎn)生高耐藥率的原因是醫(yī)院、畜牧業(yè)、水產(chǎn)業(yè)大量使用和濫用這些抗生素引起的。進一步的分析結(jié)果還顯示, 鰻弧菌對多種抗生素產(chǎn)生了耐藥, 83%以上的菌株對12種以上的抗生素產(chǎn)生耐藥, 耐藥種類涵蓋3種以上, 說明了鰻弧菌普遍存在多重耐藥性。在具有潛在致病性的O1—O3血清型菌株中, 于 2001年分離自山東大菱鲆的三株菌(SMP1, SPM3, SPM4)對18—19種抗生素產(chǎn)生耐藥性, 耐藥種類含蓋6類抗生素(大環(huán)內(nèi)酯類, 多肽類抗生素, β-內(nèi)酰胺類, 酰胺醇類, 四環(huán)素類, 磺胺類),這些潛在病原菌的多重耐藥性增加了對病害防治的難度。

綜上所述, 本研究首次對存在我國海水養(yǎng)殖魚類的鰻弧菌進行了血清學(xué)鑒定, 同時還分析了它們對抗生素的耐藥性, 研究結(jié)果明確了流行于我國海水養(yǎng)魚類殖鰻弧菌血清學(xué)特征及其耐藥特征, 對鰻弧菌病的流行病學(xué)研究、疫苗研制具有明確的指導(dǎo)作用。

李清祿, 陳 強, 2001. 海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖大黃魚細菌性病原鑒定與感染治療研究. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報, 7(5): 489—493

肖 慧, 李 軍, 王祥紅等, 1999. 鱸魚苗爛鰓、爛尾病病原菌的研究. 青島海洋大學(xué)學(xué)報, 29(1): 87—93

陳吉祥, 李彩風(fēng), 顏顯輝等, 2005. 大菱鲆病原鰻弧菌生物學(xué)及分子特征研究. 高技術(shù)通訊, 15(6): 92—96

鄭國興, 沈亞林, 李 何, 1990. 中國對蝦病原菌(鰻弧菌)的研究. 水產(chǎn)學(xué)報, 14(1): 1—7

莫照蘭, 茅云翔, 陳師勇等, 2002. 一株牙鲆皮膚潰爛癥病原菌的鑒定. 微生物學(xué)報, 42(3): 263—269

竇 勇, 寧喜斌, 2007. 副溶血弧菌多克隆抗體的制備及其特性分析. 食品與生物技術(shù)學(xué)報, 26(3): 85—89

Aguirre-Guzmán G, Ruíz M H, Ascencio F, 2004. A review of extracellular virulence product ofVibrio speciesimportant in diseases of cultivated shrimp. Aquaculture Research,35(15): 1395—1404

Austin B, Alsina M, Austin D Aet al, 1995. Identification and typing ofVibrio anguillarum: a comparison of different methods. Systematic and Applied Microbiology, 18(2):285—302

Balado M, Osorio C R, Lemos M L, 2008. Biosynthetic and regulatory elements involved in the production of the siderophore vanchrobactin inVibrio anguillarum. Microbiology,154(5): 1400—1413

Chart H, Trust T J, 1984. Characterization of the surface antigens of the marine fish pathogenVibrio anguillarumandVibrio ordalii. Canadian Journal of Microbiology, 30(5): 703—710

Christine P, Frédérique L R, Borrego J J, 2004. Bacterial disease in marine bivalves: a review of recent studies: trends and evolution. Aquatic Living Resources, 17(4): 477—498

Ezura Y, Tajima K, Yoshimizu Met al, 1980. Studies on the taxonomy and serology of causative organisms of fish vibriosis. Fish Pathology, 14(4): 167—179

Gould R W, Antipa R, Amend D F, 1979. Immersion vaccination of sockeye salmon (Oncorhynchus nerka) with two pathogenic strains ofVibrio anguillarum. Journal of the Fisheries Board of Canada, 36(2): 222—225

Grisez L, Ollevier F, 1995. Comparative Serology of the Marine Fish PathogenVibrioanguillarum. Applied and environmental microbiology, 61(12): 4367—4373

Kitao T, Aoki T, Fukudome Met al, 1983. Serotyping ofVibrio anguillarumisolated from diseased freshwater fish in Japan.Journal of Fish Diseases, 6(2): 175—181

Kitao T, Aoki T, Muroga K, 1984. Three new O-serotypes ofVibrio anguillarum. Bulletin of the Japanese Society of Scientific Fisheries, 50(11): 1955

Knappskog D H, R?dseth O M, Slinde Eet al, 1993.Immunochemical analyses ofVibrio anguillarumstrains isolated from cod,Gadus morhuaL., suffering from vibriosis. Journal of Fish Diseases, 16(4): 327—338

Larsen J L, Pedersen K, Dalsgaard I, 1994.Vibrio anguillarumserovars associated with vibriosis in fish. Journal of Fish Diseases, 17(3): 259—267

Mikkelsen H, Lund V, Martinsen L - Cet al, 2007. Variability amongVibrio anguillarumO2 isolates from Atlantic cod(Gadus morhuaL.): Characterisation and vaccination studies.Aquaculture, 266(1—4): 16—25

Naka H, Crosa J H, 2011. Genetic determinants of virulence in the marine fish pathogenVibrio anguillarum. Fish Pathology,46(1): 1—10

Pedersen K, Grisez L, Van Houdt Ret al, 1999. Extended serotyping scheme forVibrio anguillarumwith the definition and characterization of seven provisional O-serogroups. Current Microbiology, 38(3): 183—189

Saitou N, Nei M, 1987. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Molecular Biology and Evolution, 4(4): 406—425

Soengas R G, Anta C, Espada Aet al, 2006. Structural characterization of vanchrobactin, a new catechol siderophore produced by the fish pathogenVibrio anguillarumserotype O2. Tetrahedron Letters, 47(39): 7113—7116

Song Y L, Chen S N, Kon G N, 1988. Serotyping ofVibrio anguillarumstrains isolated from fish in Taiwan. Fish Pathology, 23(3): 185—189

S?rensen U B S, Larsen J L, 1986. Serotyping ofVibrio anguillarum. Applied and Environmental Microbiology,51(3): 593—597

Tajima K, Ezura Y, Kimura T, 1986a. Serological typing of thermostabile antigens ofV. anguillarum-I.V. anguillarumO-serotypes (J-O-1—J-O-3). Bulletin of the Faculty of Fisheries Hokkaido University, 37(3): 230—239

Tajima K, Ezura Y, Kimura T, 1986b. Serological typing of thermostabile antigens ofV. anguillarum-II.V. anguillarumO-serotypes (J-O-4—J-O-8). Bulletin of the Faculty of Fisheries Hokkaido University, 37(3): 240—245

Tiainen T, Pedersen K, Larsen J L, 1997.Vibrio anguillarumserogroup O3 andV. anguillarum-like serogroup O3 cross-reactive species-comparison and characterization.Journal of Applied Microbiology, 82(2): 211—218