張蕾蕾，余永濤*，何生虎，趙清梅，葛 松

(1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，銀川 750021；2.北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，銀川 750021；3.國(guó)家民委發(fā)酵釀造工程生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750021)

不同因素對(duì)瘋草內(nèi)生真菌合成苦馬豆素的影響

張蕾蕾1，余永濤1*，何生虎1，趙清梅2,3，葛 松1

(1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，銀川 750021；2.北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，銀川 750021；3.國(guó)家民委發(fā)酵釀造工程生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750021)

研究不同因素對(duì)瘋草內(nèi)生真菌——Undifilumoxytropis合成苦馬豆素的影響，篩選出顯著影響U.oxytropis苦馬豆素合成的因素。將U.oxytropis分別接種到不同pH或不同濃度聚乙二醇(PEG)、L-哌可酸、L-賴氨酸、α-酮戊二酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，測(cè)定菌絲及其發(fā)酵液中苦馬豆素，分析各條件下真菌苦馬豆素產(chǎn)率的變化。結(jié)果表明：當(dāng)pH在4.5～6.5時(shí)，隨pH增加，真菌SW產(chǎn)率顯著增加(P<0.05)；當(dāng)PEG質(zhì)量濃度在0～32 g·L-1時(shí)，隨PEG增加，真菌苦馬豆素產(chǎn)率顯著降低(P<0.01)；當(dāng)在培養(yǎng)基中添加相同量(10-3mol·L-1)的L-哌可酸、L-賴氨酸、ɑ-酮戊二酸時(shí)，L-哌可酸添加組的苦馬豆素產(chǎn)率顯著降低(P<0.05)，L-賴氨酸添加組苦馬豆素產(chǎn)率顯著增加(P<0.05)；當(dāng)L-哌可酸的初始濃度為10-3和10-2mol·L-1時(shí)，真菌的苦馬豆素產(chǎn)率顯著下降(P<0.05)，當(dāng)其濃度為10-4mol·L-1時(shí)，苦馬豆素產(chǎn)率顯著增加(P<0.01)；當(dāng)L-賴氨酸的初始濃度為10-1、10-2或10-4mol·L-1時(shí)，真菌苦馬豆素產(chǎn)率顯著降低(P<0.05)。當(dāng)ɑ-酮戊二酸的初始濃度分別為10-1、10-2、10-3mol·L-1時(shí)，真菌的苦馬豆素產(chǎn)率顯著降低(P<0.05)。由試驗(yàn)可知，低pH或添加PEG可抑制U.oxytropis中苦馬豆素的合成，L-哌可酸、L-賴氨酸、α-酮戊二酸均對(duì)U.oxytropis的苦馬豆素合成產(chǎn)生顯著影響，但對(duì)苦馬豆素合成的影響與各物質(zhì)在培養(yǎng)基中的濃度密切相關(guān)。

瘋草；內(nèi)生真菌；棘豆波狀芽管蠕孢菌；苦馬豆素；生物合成

瘋草是豆科棘豆屬和黃芪屬有毒植物的統(tǒng)稱，廣泛分布于中國(guó)西部省區(qū)和北美地區(qū)[1-2]。瘋草的主要毒性成分是吲哚里西啶生物堿——苦馬豆素(swainsonine，SW)，它可抑制動(dòng)物細(xì)胞溶酶體α-甘露糖苷酶和高爾基體甘露糖苷酶II的活性，導(dǎo)致低聚糖代謝和糖蛋白合成障礙[3]。動(dòng)物長(zhǎng)期采食瘋草會(huì)發(fā)生以神經(jīng)系統(tǒng)機(jī)能紊亂為特征的慢性中毒病，每年給草原畜牧業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2-10]。目前SW在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)的代謝機(jī)制和毒理作用機(jī)制尚未被完全闡明，動(dòng)物瘋草中毒問(wèn)題仍未能從根本上得到解決。近年研究表明，瘋草內(nèi)普遍存在能夠產(chǎn)生SW的內(nèi)生真菌——Undifilumoxytropis(棘豆波狀芽管蠕孢菌)，該類真菌是瘋草中SW產(chǎn)生的主要因素[11-20]。因此，闡明瘋草內(nèi)生真菌合成SW的機(jī)制，抑制或阻斷內(nèi)生真菌合成SW，將有望降低或消除瘋草的毒性，從根本上防除動(dòng)物瘋草中毒病，合理利用瘋草[21]。

寄生于其他植物的病原真菌豆類絲核菌和昆蟲病原真菌金龜子綠僵菌也能合成SW，其合成SW的部分途徑已被闡明。這兩種真菌均以L-賴氨酸為初始底物，在酵母氨酸氧化酶的催化下，賴氨酸與α-酮戊二酸縮合生成L-酵母氨酸，在該酶的作用下，酵母氨酸轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-2-氨基己二酸半醛，再經(jīng)過(guò)一系列酶促反應(yīng)依次生成△1,6-哌啶羧酸、哌可酸，并以哌可酸為前體合成SW[22-28]。在SW的合成中，酵母氨酸脫氫酶起負(fù)調(diào)控作用，它可促進(jìn)L-2-氨基己二酸半醛逆向生成L-酵母氨酸和賴氨酸，而阻止SW的合成[29]。在此基礎(chǔ)上，S.Mukherjee等研究了瘋草內(nèi)生真菌U.oxytropis中酵母氨酸脫氫酶對(duì)SW合成的影響，結(jié)果表明抑制酵母氨酸脫氫酶的表達(dá)可使賴氨酸和酵母氨酸的消耗量增加，而哌可酸及SW的產(chǎn)量顯著提升[30-31]，他們認(rèn)為瘋草內(nèi)生真菌中SW的合成路徑可能與豆類絲核菌等相似。楊國(guó)棟[32]研究表明，L-賴氨酸、哌可酸可增加U.oxytropis中SW的產(chǎn)量，同位素示蹤試驗(yàn)也表明，L-賴氨酸中被同位素N15標(biāo)記的部分氮原子在賴氨酸代謝過(guò)程中被摻入到了生成的SW分子中，認(rèn)為L(zhǎng)-賴氨酸和哌可酸是瘋草內(nèi)生真菌合成SW的前體物質(zhì)。此外，W.E.Oldrup[33]評(píng)估了pH、聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)、溫度等因素對(duì)瘋草內(nèi)生真菌SW合成的影響，結(jié)果表明低pH(pH 4.5)或高濃度PEG可使U.oxytropis的SW產(chǎn)量顯著提高。

以上研究為進(jìn)一步揭示瘋草內(nèi)生真菌中SW的合成機(jī)制奠定了重要基礎(chǔ)，但在評(píng)估不同因素對(duì)U.oxytropis合成SW的影響時(shí)，以上研究?jī)H是測(cè)定了真菌菌絲中SW產(chǎn)量的變化，并未對(duì)真菌培養(yǎng)基中的SW進(jìn)行分析，而在K.Braun等[17]的研究中已經(jīng)確定，瘋草內(nèi)生真菌可以將產(chǎn)生的SW從菌絲分泌到培養(yǎng)基中。此外，以上研究?jī)H分析了固定量的PEG、L-賴氨酸、哌可酸對(duì)真菌SW合成的影響，這些物質(zhì)量的變化是否會(huì)對(duì)SW的合成產(chǎn)生影響還不清楚。本研究擬對(duì)不同pH、不同PEG濃度、不同L-賴氨酸、哌可酸和α-酮戊二酸濃度的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)U.oxytropis真菌菌絲及其培養(yǎng)液中的SW進(jìn)行綜合分析，從而確定以上因素對(duì)U.oxytropis合成SW的影響，篩選出可導(dǎo)致瘋草內(nèi)生真菌SW合成發(fā)生顯著改變的因素，為進(jìn)一步開展瘋草內(nèi)生真菌合成SW的機(jī)制研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 真菌菌株 瘋草內(nèi)生真菌菌株NX-FEL001，由張蕾蕾等[34]從寧夏黃花棘豆中分離，根據(jù)真菌的形態(tài)特征、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，gpd)、內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed space，ITS)等基因序列，進(jìn)行同源性比較和遺傳進(jìn)化分析，確定為U.oxytropis。

1.1.2 試劑和儀器 SW標(biāo)準(zhǔn)品，由寧夏大學(xué)臨床獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室從黃花棘豆中分離和純化；L-賴氨酸、L-哌可酸、α-酮戊二酸、硝基苯基-ɑ-D-甘露糖苷(p-nitrophenyl-ɑ-D-mannopyranoside substrate)、ɑ-甘露糖苷酶(ɑ-mannosidase from jack bean)、氫氧化鈉、檸檬酸、硼酸、改良基礎(chǔ)鹽(Murashige and skoog major salts)、水解酪蛋白均購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；間苯三酚、谷氨酸、脯氨酸、鹽酸硫胺、鹽酸吡哆辛、肌醇等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；KG-SX-500型高壓鍋，三洋電機(jī)株式會(huì)社日本生產(chǎn)；MIP-250型霉菌培養(yǎng)箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；QYC-2102C型搖床，上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；MK3型酶標(biāo)儀，Thermo Fisher公司；E438酸度計(jì)，Mettler Toledo有限公司；超純水儀，Thermo Fisher公司。

1.1.3 培養(yǎng)基 培養(yǎng)基按以下方法配制。

蛋白胨無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基[32]：MgSO4·7H2O 0.6 g，KCl 0.6 g，F(xiàn)eSO40.02 g，蔗糖 15.58 g， K2HPO40.62 g，大豆蛋白胨 0.34 g，瓊脂20 g，蒸餾水 1 L，氯霉素 500 mg·L-1，121 ℃高壓滅菌30 min。

ULTO培養(yǎng)基：2.7 g Murashige and skoog major salts，4.4 g酸水解蛋白，12.6 mg間苯三酚，100 mg谷氨酸，0.575 g脯氨酸，100 mg VB1，25 mg VB6，肌醇，1 L去離子水，氯霉素 500 mg·L-1，121 ℃高壓滅菌30 min。

蛋白胨無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基[32]：MgSO4·7H2O 0.6 g，KCl 0.6 g，F(xiàn)eSO40.02 g，蔗糖 15.58 g，K2HPO40.62 g，大豆蛋白胨 0.34 g，蒸餾水 1 L，氯霉素 500 mg·L-1，121 ℃高壓滅菌30 min。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 真菌U.oxytropis的預(yù)培養(yǎng)

1.2.1.1 真菌U.oxytropis固體培養(yǎng)基的篩選：將保存的瘋草內(nèi)生真菌菌株U.oxytropisNX-FEL001接種于PDA平板上，22 ℃恒溫培養(yǎng)30 d后，用滅菌的鑷子收集菌絲于研磨器中，加入適量的滅菌水，研磨菌絲，制備菌絲懸浮液。定量取制備好的菌絲懸浮液分別均勻涂布于PDA固體培養(yǎng)基、馬鈴薯浸粉瓊脂培養(yǎng)基、蛋白胨無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基平板上，22 ℃恒溫15 d后，觀察真菌的生長(zhǎng)情況，篩選出適合真菌生長(zhǎng)的固體培養(yǎng)基。

1.2.1.2 真菌U.oxytropis的制備：取瘋草內(nèi)生真菌菌株U.oxytropisNX-FEL001接種于PDA平板上，22 ℃恒溫培養(yǎng)30 d后，用滅菌的鑷子收集菌絲于研磨器中，加入適量的滅菌水，研磨菌絲，制備菌絲懸浮液。定量取制備好的菌絲懸浮液均勻涂布于1.2.1.1篩選出的固體平板上，22 ℃恒溫30 d待用。

1.2.1.3 真菌U.oxytropis液體培養(yǎng)基的篩選：用滅菌的打孔器在1.2.1.2中制備的真菌平板上打孔，制成直徑為 6 mm 的菌餅，分別接種到裝有50 mL pH 6.5的蛋白胨無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基和ULTO液體培養(yǎng)基中，每瓶接種10 個(gè)菌餅，每個(gè)處理?xiàng)l件同時(shí)做10個(gè)重復(fù)，置恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，22 ℃，150 r·min-1振蕩培養(yǎng)30 d，篩選出適合真菌U.oxytropis快速生長(zhǎng)的液體培養(yǎng)基。

1.2.1.4 真菌U.oxytropis培養(yǎng)方式的篩選：用滅菌的打孔器在1.2.1.2中制備的真菌平板上打孔，制成直徑6 mm的菌餅，分別接種到裝有50 mL pH 6.5的ULTO培養(yǎng)基中，每瓶接種10 個(gè)菌餅，每個(gè)處理?xiàng)l件同時(shí)做10個(gè)重復(fù)，一組置霉菌恒溫培養(yǎng)箱，22 ℃，靜置培養(yǎng)30 d；另一組置恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，22 ℃，150 r·min-1振蕩培養(yǎng)30 d，篩選出適合真菌U.oxytropis快速生長(zhǎng)的培養(yǎng)方式。

1.2.2 不同因素下U.oxytropis的培養(yǎng)

1.2.2.1 不同pH下U.oxytropis的培養(yǎng)：用滅菌的打孔器在1.2.1.2中培養(yǎng)的真菌上打孔，制成直徑為 6 mm 的菌餅，分別接種到裝有50 mL pH分別為4.5、5.5、6.5 的ULTO液體培養(yǎng)基中，每瓶接種10 個(gè)菌餅，每個(gè)處理?xiàng)l件同時(shí)做10個(gè)重復(fù)，置恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，22 ℃，150 r·min-1振蕩培養(yǎng)30 d。

1.2.2.2 不同濃度PEG下U.oxytropis的培養(yǎng)：用滅菌的打孔器在1.2.1.2中培養(yǎng)的真菌上打孔，制成直徑為 6 mm 的菌餅，分別接種到裝有50 mL PEG 濃度分別為32、16、8、0 g·L-1的ULTO液體培養(yǎng)基(pH 6.5)中，每瓶接種10 個(gè)菌餅，每個(gè)處理?xiàng)l件同時(shí)做10 個(gè)重復(fù)，置恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，22 ℃，150 r·min-1振蕩培養(yǎng)30 d。

1.2.2.3 不同前體物質(zhì)中U.oxytropis的培養(yǎng)：用滅菌的打孔器在1.2.1.2中培養(yǎng)的真菌上打孔，制成直徑為 6 mm 的菌餅，分別接種到裝有50 mL 1×10-3mol·L-1L-賴氨酸、1×10-3mol·L-1ɑ-酮戊二酸、1×10-3mol·L-1L-哌可酸的ULTO液體培養(yǎng)基(pH 6.5)中，每瓶接種10 個(gè)菌餅，每個(gè)處理?xiàng)l件同時(shí)做10 個(gè)重復(fù)，置恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，22 ℃，150 r·min-1振蕩培養(yǎng)30 d。

1.2.2.4 不同濃度L-哌可酸中U.oxytropis的培養(yǎng)：用滅菌的打孔器在1.2.1.2中培養(yǎng)的真菌上打孔，制成直徑為 6 mm 的菌餅，分別接種到裝有50 mL 1×10-2、1×10-3、1×10-4mol·L-1L-哌可酸的ULTO液體培養(yǎng)基(pH 6.5)中，每瓶接種10 個(gè)菌餅，每個(gè)處理?xiàng)l件同時(shí)做10個(gè)重復(fù)，置恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，22 ℃，150 r·min-1振蕩培養(yǎng)30 d。

1.2.2.5 不同濃度L-賴氨酸中U.oxytropis的培養(yǎng)：用滅菌的打孔器在1.2.1.2中培養(yǎng)的真菌上打孔，制成直徑為 6 mm 的菌餅，分別接種到裝有50 mL 1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4mol·L-1L-賴氨酸的ULTO液體培養(yǎng)基(pH 6.5)中，每瓶接種10 個(gè)菌餅，每個(gè)處理?xiàng)l件同時(shí)做10 個(gè)重復(fù)，置恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，22 ℃，150 r·min-1振蕩培養(yǎng)30 d。1.2.2.6 不同濃度α-酮戊二酸中U.oxytropis的培養(yǎng)：用滅菌的打孔器在1.2.1.2中培養(yǎng)的真菌上打孔，制成直徑為 6 mm 的菌餅，分別接種到裝有50 mL 1×10-1、1×10-2、1×10-3mol·L-1α-酮戊二酸的ULTO液體培養(yǎng)基(pH 6.5)中，每瓶接種10 個(gè)菌餅，每個(gè)處理?xiàng)l件同時(shí)做10個(gè)重復(fù)，置恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，22 ℃，150 r·min-1振蕩培養(yǎng)30 d。1.2.3 苦馬豆素的測(cè)定

1.2.3.1 菌絲及其發(fā)酵液中SW的提?。赫袷幣囵B(yǎng)結(jié)束后，將培養(yǎng)物 5 000 r·min-1離心15 min，使菌絲與發(fā)酵液分離。將菌絲置于烘至恒重的稱量瓶中，60 ℃烘至恒重，稱重。將烘干的菌絲置于研缽中充分研磨成粉末，然后加入10 mL離心管中，加入7 mL 3%乙酸溶液，超聲提取30 min，5 000 r·min-1離心15 min，收集上清液，重復(fù)提取4次，合并提取液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮揮干，殘?jiān)眠m量100 mmol·L-1pH 4.5的檸檬酸鹽緩沖液溶解，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾后，用上述緩沖液定容至10 mL，置4 ℃冰箱中保存待檢。將發(fā)酵液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮揮干，殘?jiān)眠m量100 mmol·L-1pH 4.5的檸檬酸鹽緩沖液溶解，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾后，用上述緩沖液定容至10 mL，置4 ℃冰箱中保存待檢。

1.2.3.2 α-甘露糖苷酶法測(cè)定菌絲及其發(fā)酵液中SW的含量：精密稱量苦馬豆素標(biāo)準(zhǔn)品，將其分別配制成4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25、0.015 625 μg·mL-1等9個(gè)質(zhì)量濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。取40 μL不同質(zhì)量濃度的苦馬豆素標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別加入96孔板的各孔中，每個(gè)質(zhì)量濃度的溶液同時(shí)做3個(gè)重復(fù)，另將60 μL 100 mmol·L-1pH 4.5的檸檬酸鹽緩沖液加入空白孔中作為空白對(duì)照，將40 μL 100 mmol·L-1pH 4.5的檸檬酸鹽緩沖液加入到陰性對(duì)照孔中作為陰性對(duì)照。然后分別在每孔中加入95 μL 1.0 mmol·L-14-Nitrophenyl α-D-mannopyranoside底物溶液，輕微振蕩混勻，置37 ℃孵育1 h；孵育結(jié)束后在每孔加入20 μL 0.375 U·mL-1的α-甘露糖苷酶溶液的酶溶液，但空白對(duì)照中不加酶溶液，輕微振蕩混勻，置37 ℃再孵育1 h。孵育結(jié)束后，每孔加入100 μL的pH 9.8的200 mmol·L-1硼酸鹽緩沖溶液，輕微振蕩混勻，置405 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度值。以SW質(zhì)量濃度y對(duì)ɑ-甘露糖苷酶抑制率x進(jìn)行回歸分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。將1.2.3.1中制備的待檢液適當(dāng)稀釋后，按照上述方法測(cè)定樣品孔的吸光度值，將ɑ-甘露糖苷酶的抑制率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出樣品溶液中SW的含量。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 使用SAS8.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和作圖，對(duì)每個(gè)處理組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，并用不同的字母表示不同因素差異顯著(P<0.05)。其中SW產(chǎn)率依據(jù)菌絲和發(fā)酵液中SW的質(zhì)量之和(mg)與菌絲干重(g)的比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并結(jié)合Excel做t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 產(chǎn)SW內(nèi)生真菌的預(yù)培養(yǎng)

2.1.1 固體培養(yǎng)基對(duì)菌絲生長(zhǎng)繁殖的影響 將菌懸液分別接種到PDA固體培養(yǎng)基、馬鈴薯浸粉培養(yǎng)基、蛋白胨無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基上，15 d后，蛋白胨無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基的菌絲生長(zhǎng)繁殖的能力最強(qiáng)，鋪滿整個(gè)平板，整個(gè)平板厚度均一，而其他培養(yǎng)基上的菌絲生長(zhǎng)緩慢，其中菌絲在馬鈴薯浸粉培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最慢。

2.1.2 液體培養(yǎng)基對(duì)菌絲生長(zhǎng)繁殖的影響 真菌U.oxytropis在ULTO培養(yǎng)基、蛋白胨無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d后，ULTO培養(yǎng)基中菌絲生長(zhǎng)較快，培養(yǎng)基中出現(xiàn)大量的菌絲，而蛋白胨無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中菌絲生長(zhǎng)較慢。培養(yǎng)一個(gè)月后，ULTO培養(yǎng)基中菌絲生長(zhǎng)旺盛，棕色，呈絮狀，瓶壁上有大量的菌絲，呈粗條狀，菌絲的平均干重為0.369 g，蛋白胨無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)緩慢，呈白色棒狀菌絲，平均干重為0.158 g。

2.1.3 不同培養(yǎng)方式對(duì)菌絲生長(zhǎng)繁殖的影響 真菌U.oxytropis在ULTO培養(yǎng)基上，培養(yǎng)30 d后，靜置培養(yǎng)的菌絲生長(zhǎng)緩慢，僅有少量的菌絲，菌絲的平均干重為0.126 g；振蕩培養(yǎng)的菌絲生長(zhǎng)迅速，產(chǎn)生大量的菌絲，菌絲的干重明顯增加，平均為0.369 g，是靜置培養(yǎng)真菌菌絲干重的2.9倍。

2.2 α-甘露糖苷酶抑制法標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

以α-甘露糖苷酶抑制率y對(duì)SW質(zhì)量濃度x進(jìn)行回歸分析，得回歸方程：y=3.177 9x+1.246 6(R2=0.999 2)，表明SW質(zhì)量濃度在0.013 25～4 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3 不同因素對(duì)瘋草內(nèi)生真菌菌絲產(chǎn)量和SW合成的影響

2.3.1 不同pH對(duì)真菌菌絲產(chǎn)量及SW合成的影響 隨著培養(yǎng)基pH的不斷增加，內(nèi)生真菌菌絲的平均干重?zé)o顯著變化(P>0.05，結(jié)果未展示)，SW產(chǎn)率呈增加的趨勢(shì)，各組之間差異顯著(P<0.05)，SW的產(chǎn)率分別為0.56、0.74、0.78 mg·g-1。pH 5.5與pH 6.5、pH 4.5與pH 6.5相比，隨著菌絲平均干重的增加，SW的產(chǎn)率呈上升的趨勢(shì)；pH 4.5與pH 5.5相比，隨著菌絲平均干重的降低，SW的產(chǎn)率反而增加(圖1)。

2.3.2 不同濃度聚乙二醇(PEG)對(duì)真菌菌絲產(chǎn)量及SW合成的影響 隨著PEG質(zhì)量濃度的增加，U.oxytropis的菌絲產(chǎn)量顯著增加(P<0.01)，而苦馬豆素的產(chǎn)量顯著降低(P<0.01)，產(chǎn)率分別為1.16、0.95、0.77、0.18 mg·g-1。當(dāng)PEG質(zhì)量濃度達(dá)到32 g·L-1時(shí)，菌絲的平均干重為對(duì)照組的3倍，而苦馬豆素的產(chǎn)量顯著降低，為0.126 mg(圖

相同字母表示不同pH下，在0.05水平上差異不顯著The same letters show no significant difference of lines at 0.05 level圖1 不同pH下SW產(chǎn)率Fig 1 The yield of swainsonine under different pH

2)。表明隨著PEG質(zhì)量濃度的增加，菌絲的生長(zhǎng)速度加快，但會(huì)抑制SW合成。

2.3.3 不同前體物質(zhì)對(duì)真菌菌絲產(chǎn)量及SW合成的影響 當(dāng)3種前體物質(zhì)在培養(yǎng)基中的濃度分別為10-3mol·L-1時(shí)，L-賴氨酸、α-酮戊二酸對(duì)U.oxytropis的菌絲的產(chǎn)量無(wú)顯著影響(P>0.05)，α-酮戊二酸對(duì)真菌SW產(chǎn)量沒(méi)有顯著影響，但有促進(jìn)SW合成的趨勢(shì)，L-賴氨酸可顯著提高SW的產(chǎn)量，高達(dá)0.214 mg，為對(duì)照組的3.8倍，SW的產(chǎn)率為0.54 mg·g-1(P<0.05)；L-哌可酸可顯著增加U.oxytropis的菌絲的產(chǎn)量，但SW產(chǎn)量反而顯著降低，其SW產(chǎn)率僅為0.33 mg·g-1(P<0.01)(圖3)。2.3.4 不同濃度L-哌可酸對(duì)真菌菌絲產(chǎn)量及SW合成的影響 不同濃度L-哌可酸下，菌絲的平均干重存在明顯的差異(P<0.05)，隨著L-哌可酸濃度的增加，SW的產(chǎn)量反而顯著降低，SW產(chǎn)率分別為0.5、0.34、0.23 mg·g-1(P<0.05)。與對(duì)照組相比，當(dāng)L-哌可酸的濃度為1×10-4mol·L-1時(shí)，SW產(chǎn)量顯著增加，為對(duì)照組的1.25倍(P<0.01)；當(dāng)L-哌可酸的濃度為1×10-2、1×10-3mol·L-1時(shí)，SW的產(chǎn)量顯著降低，分別為對(duì)照組的57.5%、85%。當(dāng)L-哌可酸的濃度為1×10-2、1×10-3mol·L-1時(shí)，隨著菌絲干重的增加，SW產(chǎn)量增加；當(dāng)L-哌可酸的濃度為1×10-3、1×10-4mol·L-1時(shí)，隨著菌絲干重的降低，SW產(chǎn)量反而上升(圖4)。推測(cè)L-哌可酸濃度在一定的范圍可促進(jìn)菌絲的生長(zhǎng)，從而加速SW的合成；在某一濃度范圍內(nèi)可抑制菌絲的生長(zhǎng)，促進(jìn)SW的合成速度，總體來(lái)說(shuō)L-哌可酸有促進(jìn)SW合成的趨勢(shì)。

A.菌絲平均干重；B.SW產(chǎn)率。不同字母表示，不同質(zhì)量濃度PEG下在0.01水平上差異顯著A.Mean mycelial dry weight under different PEG；B.The yield of swainsonine under different PEG.The different letters show significant difference of lines at 0.01 level圖2 不同質(zhì)量濃度PEG下菌絲的平均干重及苦馬豆素產(chǎn)率Fig.2 The mean production of mycelium and yield of swainsonine under different PEG

A.菌絲平均干重；B.苦馬豆素產(chǎn)率。相同字母表示，不同前體物質(zhì)在0.05水平上差異不顯著；不同字母表示，不同前體物質(zhì)在0.05水平上差異顯著A.Mean mycelial dry weight under different precursor；B.The yield of swainsonine under different precursor.The same letters show no significant difference of lines at 0.05 level;The different letters show significant difference of lines at 0.05 level圖3 不同前體物質(zhì)下，菌絲平均干重及苦馬豆素產(chǎn)率Fig.3 The mean production of mycelium and yield of swainsonine under different precursor

A.菌絲平均干重；B.苦馬豆素產(chǎn)率。相同字母表示，不同濃度L-哌可酸在0.05水平上差異不顯著；不同字母表示，不同濃度L-哌可酸在0.05水平上差異顯著A.Mean mycelial dry weight under different L-pipecolic acids；B.The yield of swainsonine under different L-pipecolic acids.The same letters show no significant difference of lines at 0.05 level;The different letters show significant difference of lines at 0.05 level圖4 不同濃度L-哌可酸下菌絲平均干重及苦馬豆素產(chǎn)率Fig.4 The mean production of mycelium and yield of swainsonine under different L-pipecolic acids

2.3.5 不同濃度L-賴氨酸對(duì)真菌菌絲產(chǎn)量及SW合成的影響 L-賴氨酸濃度為1×10-1、1×10-2、1×10-3mol·L-1時(shí)，菌絲的平均干重?zé)o顯著的變化(P>0.05)，僅當(dāng)L-賴氨酸濃度為1×10-4mol·L-1時(shí)，菌絲的平均干重顯著增加(P<0.01)；L-賴氨酸濃度為1×10-1、1×10-2、1×10-4mol·L-1時(shí)，SW產(chǎn)量顯著降低，SW產(chǎn)率分別為0.028、0.29、0.18 mg·g-1(P<0.01)；L-賴氨酸濃度為1×10-3mol·L-1時(shí)，SW產(chǎn)量顯著增加，SW產(chǎn)率為0.54 mg·g-1(P<0.01)(圖5)。推測(cè)L-賴氨酸濃度與產(chǎn)SW內(nèi)生真菌生長(zhǎng)及SW合成密切相關(guān)，濃度為1×10-1、1×10-2、1×10-4mol·L-1時(shí)，L-賴氨酸可抑制菌絲合成SW，L-賴氨酸濃度為1×10-3mol·L-1時(shí)，可促進(jìn)菌絲合成SW。

A.菌絲平均干重；B.苦馬豆素產(chǎn)率。相同字母表示，不同濃度L-賴氨酸在0.05水平上差異不顯著；不同字母表示，不同濃度L-賴氨酸在0.05水平上差異顯著A.Mean mycelial dry weight under different L-lysine；B.The yield of swainsonine under different L-lysine.The same letters show no significant difference of lines at 0.05 level；The different letters show significant difference of lines at 0.05 level圖5 不同濃度L-賴氨酸下菌絲平均干重及苦馬豆素產(chǎn)率Fig.5 The mean production of mycelium and yield of swainsonine under different L-lysine

2.3.6 不同濃度ɑ-酮戊二酸對(duì)真菌菌絲產(chǎn)量及SW合成的影響 隨著ɑ-酮戊二酸濃度的遞增，SW的產(chǎn)量顯著降低(P<0.05)。當(dāng)ɑ-酮戊二酸濃度為1×10-1mol·L-1時(shí)菌絲的干重顯著降低，而SW產(chǎn)量顯著降低，SW產(chǎn)率為對(duì)照組的44%，為0.20 mg·g-1；1×10-2mol·L-1時(shí)，菌絲的平均干重?zé)o顯著的變化，而SW產(chǎn)量顯著降低，SW產(chǎn)率為對(duì)照組的84%，達(dá)0.38 mg·g-1(圖6)。推測(cè)ɑ-酮戊二酸濃度在1×10-1～1×10-2mol·L-1，可抑制SW的合成，小于1×10-1mol·L-1時(shí)，可抑制真菌的生長(zhǎng)及SW的合成。

A.菌絲平均干重；B.苦馬豆素產(chǎn)率。相同字母表示，不同濃度ɑ-酮戊二酸下，在0.05水平上差異不顯著；不同字母表示，不同濃度ɑ-酮戊二酸條件下，在0.05水平上差異顯著A.Mean mycelial dry weight under different ɑ-ketone glutaric acid；B.The yield of swainsonine under different ɑ-ketone glutaric acid.The same letters show no significant difference of lines at 0.05 level；The different letters show significant difference of lines at 0.05 level圖6 不同濃度ɑ-酮戊二酸下菌絲平均干重及苦馬豆素產(chǎn)率Fig.6 The mean production of mycelium and yield of swainsonine under different ɑ-ketone glutaric acid

3 討 論

目前，國(guó)內(nèi)外一致認(rèn)為U.oxytropis是瘋草中唯一能夠產(chǎn)生SW的內(nèi)生真菌，該類真菌與瘋草的毒性緊密相關(guān)。近幾年來(lái)，對(duì)于該類菌株的研究主要集中在分離與鑒定[11-20]、瘋草毒性與瘋草內(nèi)生真菌的關(guān)系[37-39]、傳播機(jī)制[40]、環(huán)境因素對(duì)SW合成影響[33，37]、瘋草與內(nèi)生真菌的共生關(guān)系[41]、基因及蛋白組學(xué)[29]上SW合成的機(jī)制等方面。

本研究對(duì)真菌U.oxytropis的固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基及培養(yǎng)方式進(jìn)行篩選，并對(duì)不同pH、不同質(zhì)量濃度PEG、不同濃度L-賴氨酸、L-哌可酸和α-酮戊二酸的培養(yǎng)條件下真菌U.oxytropis的菌絲及其培養(yǎng)液中的SW進(jìn)行綜合分析，結(jié)果顯示蛋白胨無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基及ULTO液體培養(yǎng)基有利于真菌U.oxytropis的生長(zhǎng)繁殖。研究表明，碳源、氮源、金屬離子的濃度及無(wú)機(jī)鹽種類，都會(huì)對(duì)絲狀真菌生長(zhǎng)繁殖產(chǎn)生影響[11,42]，蛋白胨無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基含有真菌U.oxytropis生長(zhǎng)所必需的碳源、氮源、金屬離子，促進(jìn)菌絲生長(zhǎng)；微量元素及氨基酸是生命體必需的物質(zhì)，ULTO培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)豐富，含有菌絲生長(zhǎng)所需的微量元素及氨基酸，從而促進(jìn)菌絲的生長(zhǎng)；蛋白胨無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)的主要成分為鹽類，與ULTO液體培養(yǎng)基相比，相對(duì)缺少促進(jìn)菌絲生長(zhǎng)的維生素和氨基酸，U.oxytropis生長(zhǎng)相對(duì)緩慢。

靜置培養(yǎng)與振蕩培養(yǎng)相比，振蕩培養(yǎng)更適合菌絲的生長(zhǎng)。據(jù)報(bào)道，振蕩培養(yǎng)可改善菌絲與培養(yǎng)基成分的接觸和氧的供應(yīng)[43]，菌絲的生長(zhǎng)繁殖比較均一，繁殖能力強(qiáng)，特別是在霉菌的培養(yǎng)中，菌餅不易形成附有菌膜的小球。pH對(duì)U.oxytropis的生長(zhǎng)無(wú)顯著的影響，可能是真菌自身通過(guò)某種方式調(diào)節(jié)其生長(zhǎng)環(huán)境pH，使環(huán)境pH更利于其生長(zhǎng)繁殖，這一研究與C.Tamerler等[42]報(bào)道一致；隨著pH的遞增，SW的產(chǎn)率逐漸的增加，這與W.E.Oldrup[33]的結(jié)果相反。本研究不僅檢測(cè)了菌絲提取物中的苦馬豆素，還檢測(cè)了發(fā)酵液中的苦馬豆素，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液中的SW高于菌絲提取物中的SW。在植物研究中，PEG溶液經(jīng)常被用作滲透脅迫劑，研究顯示任何PEG質(zhì)量濃度對(duì)植物種子的萌發(fā)抗旱指數(shù)、活力指數(shù)、發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、胚根和胚芽長(zhǎng)都有極顯著的影響；另一方面PEG具有親水性，可以改變細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)，在細(xì)胞融合中起決定性的作用；然而高質(zhì)量濃度、高相對(duì)分子質(zhì)量的PEG會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性[35-36]。研究發(fā)現(xiàn)高質(zhì)量濃度的PEG脅迫下，隨著PEG質(zhì)量濃度的增高，菌絲的生長(zhǎng)能力增強(qiáng)，SW合成受到阻礙，與W.E.Oldrup[33]、M.H.Ralphs等[37]的研究結(jié)果不一致，但在W.E.Oldrup的研究中僅對(duì)真菌菌絲中的SW做了檢測(cè)。另?yè)?jù)K.Braun等[17]報(bào)道，真菌在生長(zhǎng)的過(guò)程中不僅進(jìn)行SW胞內(nèi)分泌，還可將SW分泌到細(xì)胞的外部，并且在菌絲發(fā)酵液中檢測(cè)到SW的存在。余永濤[11]在發(fā)酵培養(yǎng)試驗(yàn)中，檢測(cè)到發(fā)酵液中的苦馬豆素產(chǎn)量為2～85 mg·L-1?？赡茉谡婢L(zhǎng)的過(guò)程中，高質(zhì)量濃度的PEG會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性，從而抑制真菌吸收豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致SW產(chǎn)量下降；低質(zhì)量濃度的PEG條件下，細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)改變，細(xì)胞易于融合，促進(jìn)真菌吸收豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，菌絲生長(zhǎng)加快，促進(jìn)SW合成。

目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者推測(cè)瘋草中U.oxytropis內(nèi)生真菌合成SW的機(jī)制類似于豆類絲核菌及金龜子綠僵菌，并認(rèn)為賴氨酸、ɑ-酮戊二酸、酵母氨酸、哌可酸、酵母氨酸氧化酶等為U.oxytropis內(nèi)生真菌合成SW關(guān)鍵物質(zhì)[24，29-32]。

本試驗(yàn)研究了L-賴氨酸、ɑ-酮戊二酸、L-哌可酸三種前體底物及不同濃度前體物質(zhì)對(duì)U.oxytropis真菌生長(zhǎng)及SW合成的影響，研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)L-哌可酸濃度為1×10-3mol·L-1時(shí)可顯著促進(jìn)U.oxytropis的生長(zhǎng)，但會(huì)抑制SW的合成，L-賴氨酸可顯著促進(jìn)SW的合成，ɑ-酮戊二酸具有促進(jìn)U.oxytropis的生長(zhǎng)及SW合成的趨勢(shì)；與楊國(guó)棟[32]的試驗(yàn)結(jié)果存在差異，其試驗(yàn)中添加的化合物按質(zhì)量計(jì)算，而本試驗(yàn)改進(jìn)方法，用化合物物質(zhì)的量濃度來(lái)確定添加量，每個(gè)化合物相對(duì)分子質(zhì)量存在差異，該法更合理化。此外，在楊國(guó)棟[32]的研究中，也未對(duì)發(fā)酵液中的SW量進(jìn)行測(cè)定。不同濃度前體物質(zhì)在一定的范圍可促進(jìn)U.oxytropis的生長(zhǎng)，從而加速SW的合成；在某一濃度范圍內(nèi)可抑制U.oxytropis的生長(zhǎng)，從而阻礙SW的合成速度。L-哌可酸、L-賴氨酸、ɑ-酮戊二酸為內(nèi)生真菌U.oxytropis合成SW的前體底物，猜測(cè)U.oxytropis的生長(zhǎng)與SW合成之間存在復(fù)雜的關(guān)系，SW合成不僅與真菌U.oxytropis菌絲的干重有關(guān)，而且與其自身合成SW的能力相關(guān)。

4 結(jié) 論

U.oxytropis內(nèi)生真菌與瘋草中SW含量密切關(guān)聯(lián)，不同pH、不同PEG質(zhì)量濃度、不同L-賴氨酸、L-哌可酸和α-酮戊二酸濃度的培養(yǎng)條件下對(duì)瘋草內(nèi)生真菌的生長(zhǎng)及SW的合成具有一定的影響。U.oxytropis自身具有調(diào)節(jié)其生長(zhǎng)環(huán)境pH的能力，適應(yīng)其生長(zhǎng)；低pH抑制SW的合成，高pH下促進(jìn)SW的合成；高質(zhì)量濃度的PEG可促進(jìn)真菌U.oxytropis的生長(zhǎng)，但抑制U.oxytropis合成SW，L-賴氨酸、L-哌可酸和α-酮戊二酸是真菌U.oxytropis合成SW的前體底物，均對(duì)U.oxytropis的苦馬豆素合成產(chǎn)生顯著影響，但對(duì)苦馬豆素合成的影響與各物質(zhì)在培養(yǎng)基中的濃度密切相關(guān)。

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(編輯 白永平)

Influence of Different Factors on Swainsonine Production in Fungal Endophyte from Locoweed

ZHANG Lei-lei1，YU Yong-tao1*，HE Sheng-hu1，ZHAO Qing-mei2,3，GE Song1

(1.CollegeofAgronomyNingxiaUniversity，Yinchuan750021，China； 2.CollegeofBiologicalScienceandEngineering，BeifangUniversityofNationalities，Yinchuan750021，China； 3.KeyLaboratoryofFermentationBrewingEngineeringandBiotechnologyofStateNationalitiesAffairsCommission，Yinchuan750021，China)

The research was conducted to screen the influence factors on swainsonine production in fungal endophyte，Undifilumoxytropis，from locoweed.U.oxytropiswere inoculated in liquid medium of different pH or containing different concentration of PEG，L-pipecolic acid，L-lysine and ɑ-ketoglutaric acid，respectively.To estimate the influence of different factors on swainsonine production inU.oxytropis，the swainsonine of cultured fungal mycelia and zymotic fluid were extracted and detected after shaking culture.The results showed that low pH (pH4.5) inhibit significantly (P<0.05) the synthesis of swainsonine in fungi.With the increase of PEG in culture medium，the production of swainsonine in fungi was also inhibited significantly (P<0.01).When the fungi were inoculated respectively in liquid medium that contained equivalent concentration (10-3mol·L-1) of L-pipecolic acid，L-lysine or ɑ-ketoglutaric acid，the production of swainsonine was inhibited significantly (P<0.05) in the group added L-pipecolic acid.However，the yield of swainsonine were increased significantly(P<0.05) in the group added L-lysine.When the initial concentration of L-pipecolic acid was 10-3and 10-2mol·L-1，the production of swainsonine inU.oxytropiswas inhibited significantly (P<0.05).However，when the initial concentration of L-pipecolic acid was 10-4mol·L-1，the yield of swainsonine inU.oxytropiswas increased significantly (P<0.01).When the initial concentration of L-lysine was 10-1，10-2and 10-4mol·L-1，the production of swainsonine inU.oxytropiswas inhibited significantly (P<0.05).When the initial concentration of ɑ-ketoglutaric acid was 10-1，10-2and 10-3mol·L-1，the production of swainsonine inU.oxytropiswas inhibited significantly(P<0.05).Low pH or PEG added to medium could significantly inhibit the production of swainsonine inU.oxytropis.It was significant that the influence of L-pipecolic acid，L-lysine and ɑ-ketoglutaric acid on the swainsonine producing of fungal endophyte.However，the extent of influence on fungal swainsonine producing was highly correlated with the concentration of L-pipecolic acid，L-lysine and ɑ-ketoglutaric in liquid media.

locoweed；fungal endophyte；Undifilumoxytropis；swainsonine；biosynthesis

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.01.021

2014-05-05

國(guó)家自然科學(xué)基金(31201962)；寧夏自然科學(xué)基金(NZ1118)

張蕾蕾(1989- )，女，陜西渭南人，碩士生，主要從事獸醫(yī)臨床診斷技術(shù)研究，E-mail：andybeilei@163.com

*通信作者：余永濤(1980- )，男，寧夏平羅人，副教授，博士，碩導(dǎo)，主要從事動(dòng)物中毒病與營(yíng)養(yǎng)代謝病研究，E-mail：yyt1211@163.com

S852.66

A

0366-6964(2015)01-0163-11