趙 赫，李 爽，谷長勤，張萬坡，程國富，劉曉麗，胡薛英*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，武漢 430070；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京 100193；3.北京偉嘉集團(tuán)，北京 102206)

鴨呼腸孤病毒自然感染肉鴨的病毒分布與病理學(xué)觀察

趙 赫1，李 爽2,3，谷長勤1，張萬坡1，程國富1，劉曉麗1，胡薛英1*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，武漢 430070；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京 100193；3.北京偉嘉集團(tuán)，北京 102206)

為了解2006-2010年湖北省地區(qū)暴發(fā)的鴨呼腸孤病毒感染的病理特征，地域性特點(diǎn)，運(yùn)用病理剖檢、常規(guī)石蠟切片及HE染色、免疫組織化學(xué)等技術(shù)對鴨呼腸孤病毒自然感染病鴨進(jìn)行研究。剖檢眼觀病變表現(xiàn)為肝、脾表面出現(xiàn)大量黃白色病灶，組織學(xué)病變?yōu)楦?、脾出血、壞死與肉芽腫形成，免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示所感染病鴨脾均出現(xiàn)特異性陽性信號，而肝和法氏囊僅部分出現(xiàn)陽性信號。由以上結(jié)果推測可知湖北省鴨呼腸孤病毒感染特征表現(xiàn)為肝脾壞死。

鴨源呼腸孤病毒；自然感染；病理變化

近年來，在中國不同地區(qū)都有發(fā)生以病鴨脾壞死為特征的傳染性疾病，經(jīng)病毒分離鑒定表明其病原為鴨呼腸孤病毒(duck reovirus，DRV)[1-4]。鴨呼腸孤病毒屬于呼腸孤病毒科正呼腸孤病毒屬的成員，病原呈二十面體無囊膜病毒，雙股分節(jié)段的dsRNA核酸組成。病毒顆粒直徑為60～80 nm[5]。根據(jù)流行病學(xué)、病理變化、病毒分離鑒定及試驗(yàn)感染結(jié)果，中國養(yǎng)鴨生產(chǎn)中與鴨呼腸孤病毒感染相關(guān)的疫病主要有以下4種：鴨多臟器壞死癥、鴨多臟器出血癥、鴨肝壞死癥、鴨脾壞死癥，其病原均為鴨呼腸孤病毒[6]。這表明中國不同地區(qū)養(yǎng)鴨生產(chǎn)中流行的鴨呼腸孤病毒感染相關(guān)的臨床疫病呈現(xiàn)多樣性、宿主差異性和地域差異性。

2006年至2010年湖北省內(nèi)一些肉鴨養(yǎng)殖場也發(fā)生了以病鴨脾壞死為特征的傳染性疾病，自發(fā)病鴨脾分離到病毒，經(jīng)鑒定為鴨呼腸孤病毒[1，7]。本研究對自然感染病鴨的臨床癥狀、剖檢變化、組織病理學(xué)變化及病毒抗原定位進(jìn)行觀察研究，旨在進(jìn)一步了解湖北省地區(qū)發(fā)生的鴨呼腸孤病毒感染的病理特征，發(fā)現(xiàn)其發(fā)病的地域性特點(diǎn)，為臨床診斷及致病機(jī)制的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 試驗(yàn)動物

2006年至2010年湖北省內(nèi)一些肉鴨養(yǎng)殖場感染病鴨，經(jīng)病毒分離鑒定診斷為鴨呼腸孤病毒感染。

1．2 主要試劑

鼠抗ARV單克隆抗體，工作濃度為1∶200(由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室惠贈)；SABC免疫組化試劑盒、多聚賴氨酸、DAB顯色劑均購自武漢意得生物有限公司。

1．3 動物處理及組織取樣

觀察感染病鴨的臨床癥狀了解發(fā)病日齡，對病鴨剖檢，觀察大體病變，取病鴨的心、肝、腦、脾、腎、肺、法氏囊等組織器官，10%福爾馬林(3.7%～4%甲醛)溶液固定。

1．4 HE染色及免疫組織化學(xué)染色

參照文獻(xiàn)[8]的方法進(jìn)行石蠟切片以及H.E.染色。光學(xué)顯微鏡觀察組織病理學(xué)變化。免疫組織化學(xué)方法，按SABC試劑盒所附說明書進(jìn)行操作。在Nikon 80i生物光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察，用NIS-Elements高清晰度彩色圖文分析系統(tǒng)記錄觀察結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 自然感染病鴨的臨床癥狀

感染病鴨發(fā)病日齡多在7～15日齡，有些病鴨表現(xiàn)不能站立，匍匐。病鴨眼周濕潤，淚斑明顯，羽毛松亂不齊(圖1)。

2.2 自然感染病鴨的眼觀病變

脾是發(fā)病肉鴨的主要病變器官，發(fā)病早期，病鴨脾表面有或突起或凹陷的黑紅色出血病灶(圖2A)，發(fā)病高峰期，有些脾呈黑紅色，皺縮，表面和切面分布有大小不同的黃白色壞死病灶，有的病灶中央或壞死灶周圍有紅色出血(圖2B、C)，有的整個脾呈黃白色壞死病灶(圖2D)，壞死灶切開呈豆渣樣(圖2F)。有的脾呈表面散在分布有黃白色病灶(圖2E)。

肝均有不同程度的腫大，邊緣鈍圓，顏色暗紅，有的肝表面彌散分布大量紅色出血斑點(diǎn)和條紋，有的肝表面彌散分布芝麻粒大小的黃白色病灶(圖3A、B)。

2.3 自然感染病鴨組織病理學(xué)觀察

脾紅白髓界限不清，組織間出現(xiàn)大量的紅細(xì)胞(圖4A)，有的脾中分布有大小不等的壞死灶，壞死灶中央為壞死的淋巴細(xì)胞以及網(wǎng)狀細(xì)胞，周圍出現(xiàn)較多巨噬細(xì)胞(圖4B)；部分壞死灶形成肉芽腫結(jié)構(gòu)，有多核巨細(xì)胞(圖4C)。肝主要病變肝組織間有聚集成團(tuán)的紅細(xì)胞(圖4D)，有的出現(xiàn)局灶性壞死，呈均質(zhì)紅染無結(jié)構(gòu)樣(圖4E)，壞死灶周圍有炎性細(xì)胞浸潤，或伴有出血，有些病變肝中出現(xiàn)肝細(xì)胞變性(圖4F)。法氏囊內(nèi)淋巴濾泡數(shù)目明顯減少(圖4G)，并且淋巴濾泡內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)目減少，有的甚至形成空洞樣(圖4H)，有的淋巴濾泡呈紅色均質(zhì)無結(jié)構(gòu)的壞死灶，壞死灶內(nèi)伴有出血(圖4I)。肺、腦、心肌及腎主要病變?yōu)檠軘U(kuò)張、淤血。

2.4 病毒定位免疫組化結(jié)果

對病鴨的肝、脾和法氏囊等組織進(jìn)行鴨呼腸孤病毒的免疫組織化學(xué)檢測，鴨呼腸孤病毒的陽性信號出現(xiàn)在脾巨噬細(xì)胞、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞及變性壞死的肝細(xì)胞、法氏囊巨噬細(xì)胞及部分淋巴細(xì)胞中(圖5A、B、C)，其他組織未檢測出陽性信號。

3 討 論

本研究結(jié)果表明湖北省自然感染鴨呼腸孤病毒的肉鴨主要損傷器官為脾、法氏囊和肝。脾病變?yōu)槌鲅?、壞死及肉芽腫形成，肝發(fā)生出血壞死，法氏囊發(fā)生淋巴濾泡的減少和壞死，其中脾和法氏囊病變最為明顯廣泛。

程安春等報道的四川云南省等地的鴨呼腸孤病毒感染主要以廣泛性出血為特征[9]；胡奇林等分離到的番鴨呼腸孤病毒對櫻桃谷鴨的致病性不明顯[10]。黃瑜等報道的福州雛半番鴨感染在肝、脾、法氏囊病變?yōu)橹?，其他器官未見明顯病變[11]。而番鴨呼腸孤病毒感染所引起的“肝白點(diǎn)”、“花肝病”等病理特征，主要以肝和脾出血、壞死為主。A.Moradian等報道禽呼腸孤病毒感染可引起雞法氏囊發(fā)育不良、法氏囊萎縮[12]等病理現(xiàn)象。本研究結(jié)果顯示湖北地區(qū)鴨呼腸孤病毒感染主要以脾和法氏囊壞死為主要特征，與上述報道均有相似之處。

A.不能站立；B.眼周濕潤A.Unable standing；B.Moist around the eyes圖1 自然感染病鴨的臨床癥狀Fig.1 The clinical manifestations of ducks naturally infected with duck reovirus

A.脾表面分布有較大出血斑；B.脾表面分布有灰白色病灶，病灶周圍有出血斑；C.脾表面分布有大小不一的黃白色病灶，病灶中央有出血；D.脾表面有較大黃白色病灶；E.脾表面散在分布有黃白色病灶；F.脾切面壞死灶呈豆渣樣A.Surface of spleen with lesions as larger red spot，and gray；B.Surface of spleen with several gray lesions and lots of red spot around it；C.Surface of spleen with several gray lesions and in the middle of it have some red spot；D.Surface of spleen with a larger yellow-white lesion；E.Surface of spleen with several yellow-white lesions；F.The section of spleen is jerry-built圖2 自然感染病鴨脾的病理學(xué)變化Fig.2 Gross appearance of spleen from the ducks naturally infected with duck reovirus

A.肝表面分布有大量紅色出血斑；B.肝表面散在分布有大量黃白色斑點(diǎn)A.Surface of liver with lots of red spots； B.Surface of liver with lots of white spots圖3 自然感染病鴨肝的病理學(xué)變化Fig.3 Gross appearance of liver from the ducks naturally infected with duck reovirus

A.脾局部出血；B.脾內(nèi)形成壞死灶；C.脾形成肉芽腫；D.肝局部出血；E.肝局灶性壞死；F.肝壞死灶有炎性細(xì)胞浸潤；G.法氏囊淋巴濾泡減少；H.法氏囊淋巴細(xì)胞減少；I.法氏囊壞死及出血A.Spleen local bleeding；B.Lesion in spleen forming focal necrosis；C.Lesion in spleen forming cysts；D.Liver local bleeding；E.Part of the liver cells cytoplasm red dye and necrosis；F.Inflammatory cells infiltration in the hepatic sinus；G.The lymphoid follicles is decrease in bursa；H.The lymphocyte was decrease in the lymphoid follicles；I.Lesion in bursa forming focal necrosis圖4 自然感染病鴨組織器官的病理學(xué)變化Fig.4 Pathological changes of tissue and organ from the ducks naturally infected with duck reovirus

A.脾巨噬細(xì)胞陽性；B.肝組織肝竇內(nèi)皮細(xì)胞陽性；C.法氏囊巨噬細(xì)胞及部分淋巴細(xì)胞陽性；D.脾陰性對照；E.肝陰性對照；F.法氏囊陰性對照A.In the spleen，the positive signal found in the macrophages；B.In the liver，the positive signal found in sinus endothelial cells；C.In the bursa，the positive signal found in the macrophages and part of the lymphocyte；D.The spleen negative control；E.The liver negative control；F.The bursa negative control圖5 自然感染病鴨組織器官鴨呼腸孤病毒定位結(jié)果Fig.5 The results of immunohistochemical about tissue and organ from the ducks naturally infected with duck reovirus

楊旭建立了熒光定量RT-PCR方法檢測鴨源呼腸孤病毒，對人工感染鴨呼腸孤病毒的體內(nèi)病毒進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示脾、法氏囊、肺、腎、胸腺、腦等器官均檢測到病毒分布，而脾病毒量最高，其次為法氏囊[13]。李爽等用SABC免疫組化方法檢測了鴨源呼腸孤病毒在人工感染雛鴨體內(nèi)的動態(tài)分布，發(fā)現(xiàn)病毒在脾、肝、法氏囊一直存在，直至7 d后才逐漸消失[14]。本試驗(yàn)在自然感染的病鴨脾、法氏囊和肝中發(fā)現(xiàn)有病毒分布，與文獻(xiàn)報道一致，綜上所述，鴨呼腸孤病毒主要分布在脾、法氏囊和肝，而脾、法氏囊和肝均是病變特征最明顯的組織器官，因此推測，鴨呼腸孤病毒有可能對脾、法氏囊和肝組織呈現(xiàn)為一種直接性的損傷，病毒進(jìn)入組織器官導(dǎo)致產(chǎn)生病理變化，且主要侵害機(jī)體的免疫器官脾和法氏囊。對鴨呼腸孤病毒感染導(dǎo)致的免疫損傷及免疫抑制有必要進(jìn)一步深入研究。

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(編輯 白永平)

Study on Pathology and Distribution of Duck Reovirus in Naturally Infected Ducks

ZHAO He1，LI Shuang2,3，GU Chang-qin1，ZHANG Wan-po1， CHENG Guo-fu1,LIU Xiao-li1，HU Xue-ying1*

(1.CollegeofVeterinaryMedicine，HuazhongAgriculturalUniversity，Wuhan430070，China； 2.CollegeofVeterinaryMedicine，ChinaAgriculturalUniversity，Beijing100193，China； 3.BeijingVicaGroup，Beijing102206，China)

The aim of this study was to understand the pathological characteristics of duck reovirus naturally infection in Hubei province.Pathologic autopsy，HE staining，and the immunohistochemical analysis were used to study the ducks naturally infected with duck reovirus.Results were as follows：At necropsy，large yellowish-white necrotic foci were observed in the spleens and livers.By histopathology，hemorrhagic，necrotic lesions and granulomas were seen in both organs.Immunohistochemical detection showed that all spleen samples had positive signals，but in liver and bursa only part of the samples were positive.Taken together，our results reveal that the liver and spleen necrosis is the characteristics of duck reovirus infection in Hubei province.

duck-origined reovirus；natural infection；pathological change

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.01.015

2014-05-22

趙 赫(1987-)，男，河北滄州人，碩士，主要從事動物病理學(xué)研究，E-mail：zhaohe4065@qq.com,Tel:027-87286986

*通信作者：胡薛英，副教授，E-mail:hxying@mail.hzau.edu.cn

S852.659.4

A

0366-6964(2015)01-0119-05