彭統(tǒng)全，邵建偉，張潤祥，曹 翀，馬 波，高明春，王君偉

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030)

牛α0干擾素在畢赤酵母中的分泌表達(dá)及抗病毒活性鑒定

彭統(tǒng)全，邵建偉，張潤祥，曹 翀，馬 波，高明春*，王君偉*

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030)

克隆牛α0干擾素(BoIFN-α0)成熟肽基因，使其在真核細(xì)胞中表達(dá)，并研究其表達(dá)蛋白質(zhì)的活性。通過PCR方法擴(kuò)增得到BoIFN-α0成熟肽基因，然后將其連接到含分泌信號肽序列的Pichiapastoris表達(dá)載體 pPICZαA 上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pPICZαA-BoIFN-α0，重組質(zhì)粒經(jīng)PmeⅠ酶切線性化后電轉(zhuǎn)化宿主菌GS115。轉(zhuǎn)化子經(jīng)100 μg·mL-1zeocinTM篩選和PCR鑒定，陽性重組菌經(jīng)甲醇誘導(dǎo)后實(shí)現(xiàn)了BoIFN-α0在畢赤酵母系統(tǒng)中的分泌表達(dá)。結(jié)果表明：SDS-PAGE和Western blot結(jié)果顯示表達(dá)產(chǎn)物相對分子質(zhì)量約為18 和21 ku，推測表達(dá)產(chǎn)物發(fā)生了一定程度的糖基化。細(xì)胞病變抑制試驗(yàn)結(jié)果表明，重組BoIFN-α0具有較高的抗病毒活性，達(dá)到5.72×106U·mg-1。這些研究結(jié)果為牛IFN-α的更深層次應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

牛BoIFN-α0亞型;巴斯德畢赤酵母;分泌表達(dá)；抗病毒活性

α干擾素(interferon-α，IFN-α) 屬于Ⅰ型干擾素，是迄今發(fā)現(xiàn)的最大的一個干擾素基因家族，具有抑制病毒增殖、抗腫瘤以及加強(qiáng)NK細(xì)胞殺傷病原感染細(xì)胞的能力[1- 2]。1996年P(guān).J.Chaplin等從病毒感染的牛腸上皮細(xì)胞中克隆出BoIFN-α[3]，牛IFN-α(BoIFN-α)多基因家族至少由10～12個亞型基因組成，亞型之間同源性很高。已報(bào)道的牛IFN-α A、B、C、D、E、F、G、H八個亞型核苷酸相似性在93.6%～97.2%，氨基酸相似性在91.0%～95.2%，核苷酸和氨基酸相似性均超過了90%以上。牛IFN-α和人IFN-α、鼠IFN-α氨基酸序列相似性分別為65%和57%。不同亞型可能是由不同細(xì)胞或同一細(xì)胞在不同時期分泌的，但由于缺乏系統(tǒng)的對比研究，其生物學(xué)活性是否有差異目前還不清楚[4]。作者根據(jù)牛IFN-α基因在牛8號染色體上的序列位置，命名本研究的干擾素α亞型為IFN-α0(GenBank：NM_174085)。牛α干擾素蛋白是由567個核苷酸編碼一個開放閱讀框(ORF)，其中23個氨基酸編碼其信號肽，166個氨基酸組成其成熟多肽。BoIFN-α0核苷酸與已知的牛α干擾素亞型相似性均在94%以上，最高為96.14%，最低為94.56%。BoIFN-α0成熟肽由166個氨基酸組成，YinOYang 1.2Server預(yù)測含有4個O-糖基化位點(diǎn)，無N-糖基化位點(diǎn)；Arg-33、Tyr-123為保守殘基，29—35、123—140為保守區(qū)域，Cys1-Cys99和Cys29-Cys139組成兩個二硫鍵；二級結(jié)構(gòu)主要由A～E 5個α-螺旋組成。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是最近二十年發(fā)展起來的一種成熟的真核表達(dá)系統(tǒng)，是高效表達(dá)外源蛋白質(zhì)的理想系統(tǒng)[5]。研究表明，重組BoIFN-α在體外具有抗多種病毒的作用和多種免疫調(diào)節(jié)功能[6-10]。本研究實(shí)現(xiàn)了重組牛IFN-α0亞基因在畢赤酵母中的高效表達(dá)，并對其表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了抗病毒活性研究，本研究為新型抗病毒制劑的研制與臨床應(yīng)用準(zhǔn)備了基礎(chǔ)材料。

1 材料與方法

1.1 菌株 、載體和試劑

酵母表達(dá)所用質(zhì)粒pPICZα-A 載體和菌株GS115購自美國Invitrogen公司。大腸桿菌DH5α、水泡性口炎病毒(VSV)為本實(shí)驗(yàn)室保存。蛋白質(zhì)Marker購自Fermentas公司；限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶購自TaKaRa公司；zeocinTM為Invitrongen公司產(chǎn)品，生物素購自華美生物工程公司，其他試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。牛腎細(xì)胞(MDBK)由本實(shí)驗(yàn)室保存；DMEM培養(yǎng)基為Invitrogen公司產(chǎn)品；胎牛血清購自天津?yàn)柟尽．叧嘟湍笇Ｓ门囵B(yǎng)基BMMY、BMGY、YPD等參考Invitrogen公司畢赤酵母培養(yǎng)基說明書配制。

1.2 重組質(zhì)粒pPICZαA-BoIFN-α0的構(gòu)建

PCR擴(kuò)增的牛α0干擾素基因膠回收產(chǎn)物和表達(dá)載體pPICZα-A用XhoⅠ和EcoRⅠ進(jìn)行雙酶切按3∶1的摩爾比混勻，16 ℃ 連接過夜，轉(zhuǎn)化氯化鈣法制備的 DH5α感受態(tài)大腸桿菌。挑取低鹽 LB 平板上的 zeocin抗性菌落，提質(zhì)粒，用XhoⅠ和EcoRⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定和測序驗(yàn)證，將獲得的陽性重組質(zhì)粒命名為pPICZαA-BoIFN-α0。

1.3 電轉(zhuǎn)及篩選

將重組質(zhì)粒pPICZαA-BoIFN-α0以PmeⅠ酶切線性化。按照畢赤酵母表達(dá)說明書制備GS115感受態(tài)，取85 μL，與7 μLPmeⅠ單酶切線性化的重組質(zhì)粒混勻，然后轉(zhuǎn)移到冰預(yù)冷的0.2 cm的電轉(zhuǎn)化杯中，把電轉(zhuǎn)化杯在冰上放置5 min后再在電穿孔儀上用脈沖電流電擊一次，電擊條件：電壓1 500 V，電容 25 μF，電阻 200 Ψ ，溫度 0 ℃。電擊結(jié)束，立即加入 1 mL冰預(yù)冷的 1 mol·L-1山梨醇，輕輕混勻，把電轉(zhuǎn)化杯放入 30 ℃ 溫育1 h左右， 加入1 mL YPD培養(yǎng)基至1.5 mL EP管中，30 ℃ 180 r·min-11 h，取400 μL菌液涂在含有 100 μg· mL-1zeocin抗生素的 YPDS固體培養(yǎng)基平板上，置 30 ℃ 恒溫培養(yǎng) 2～4 d，挑取典型菌落，接種于YPD培養(yǎng)基中，30 ℃，220 r·min-1振蕩培養(yǎng)36 h。

1.4 轉(zhuǎn)化子的PCR檢測

按照文獻(xiàn)[11]介紹的煮沸法提取酵母基因組，用醇氧化酶(AOX1) 基因特異引物和目的片段的特異性引物鑒定牛α干擾素基因是否插入AOX1 啟動子部位。擴(kuò)增程序 ：94 ℃ 5 min；94 ℃ 50 s、60 ℃ 50 s、72 ℃ 2 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。 擴(kuò)增結(jié)束，取 3 μL反應(yīng)液做瓊脂糖電泳觀察。如果是陽性重組酵母菌株，通過上述引物對擴(kuò)增的片段為1 080 bp左右 。用目的片段的特異性引物鑒定，擴(kuò)增的片段長度應(yīng)為500 bp 左右。

1.5 酵母重組子的誘導(dǎo)表達(dá)

挑取陽性轉(zhuǎn)化子于BMGY培養(yǎng)基中培養(yǎng)至 OD600 nm為 2～6，4 ℃，3 500 r·min-1離心5 min，加BMMY培養(yǎng)基懸浮至OD600 nm為1，轉(zhuǎn)至擋板三角搖瓶，30 ℃，220 r·min-1培養(yǎng)96 h，每隔24 h添加甲醇至終體積分?jǐn)?shù)為1%，以保持誘導(dǎo)的持續(xù)表達(dá)。

1.6 表達(dá)產(chǎn)物的處理和Western blot檢測

將發(fā)酵液 5 000 r·min-1，4 ℃離心 15 min，取上清經(jīng)60%硫酸銨濃縮，沉淀用PBS重懸，PBS透析后經(jīng)BCA蛋白檢測試劑盒檢測分泌蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度。用0.22 μm濾膜過濾上清，用于蛋白質(zhì)抗病毒活性鑒定。參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)方法指南》(第3版)進(jìn)行Western blot檢測。對表達(dá)的蛋白質(zhì)按常規(guī)方法進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)印至醋酸纖維素膜上，0.05 g·mL-1脫脂乳4 ℃封閉過夜，PBST洗膜3次，一抗為本實(shí)驗(yàn)室制備的兔源抗BoIFN-α多抗血清(免疫原為本實(shí)驗(yàn)室表達(dá)純化后的BoIFN-α A亞型蛋白)，37 °C恒溫?fù)u床80 r·min-1作用1 h；二抗為HRP標(biāo)記羊抗兔IgG，37 ℃恒溫?fù)u床80 r·min-1作用1 h，PBST洗膜3次，經(jīng)4-CN顯色出現(xiàn)反應(yīng)條帶后，去離子水沖洗終止反應(yīng)，觀察結(jié)果。

1.7 表達(dá)產(chǎn)物的抗病毒活性測定

用96孔細(xì)胞培養(yǎng)板常規(guī)培養(yǎng)MDBK細(xì)胞至單層后每孔加入100 μL 4倍倍比稀釋的BoIFN-α0，37 ℃孵育24 h后用100 TCID50VSV攻毒48 h后觀察細(xì)胞病變的抑制結(jié)果，同時設(shè)細(xì)胞對照和病毒對照。以抑制50%細(xì)胞病變(CPE50)的最高干擾素稀釋度為1個活性單位(U)。

2 結(jié) 果

2.1 目的基因的擴(kuò)增和重組質(zhì)粒的構(gòu)建

擴(kuò)增BoIFN-α0，獲得大小約為500 bp的目的片段(圖1) 將BoIFN-α0基因克隆至載體pPICZαA中，獲得重組質(zhì)粒pPICZαA-BoIFN-α0，并進(jìn)行酶切和測序驗(yàn)證，酶切結(jié)果如圖1B，EcoRⅠ單酶切片段大小為4 100 bp左右，EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切一條帶大小3 600 bp，另一條帶大小500 bp左右。測序結(jié)果表明目的序列與Bos taurus IFN-alpha C(IFNAC，GenBank：NM_174085)相似性達(dá)到99%，pPICZαA- BoIFN-α0構(gòu)建正確。

2.2 含BoIFN-α0基因的重組酵母菌株的鑒定

通過AOX1基因特異性引物對和目的片段特異性引物做PCR鑒定，以重組BoIFN-α0基因的酵母菌株染色體為模板，分別擴(kuò)增出現(xiàn)1 080 bp(圖2A)的條帶和500 bp(圖2B)左右的條帶 。

M1.Trans2K DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.BoIFN-α0的PCR產(chǎn)物；M2.Trans2K PlusΠ DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；2.pPICZαA- BoIFN-α0的EcoRⅠ酶切產(chǎn)物；3.pPICZαA- BoIFN-α0的EcoRⅠ和XhoⅠ酶切產(chǎn)物M1.Trans2K DNA marker；1.PCR product of BoIFN-α0；M2.Trans2K PlusΠ DNA marker；2.pPICZαA-BoIFN-α0 digested by EcoRⅠ；3.pPICZαA-BoIFN-α0 digested by EcoRⅠ and XhoⅠ圖1 PCR擴(kuò)增(A)及重組載體pPICZαA- BoIFN-α0的酶切鑒定(B)Fig.1 Electrophoresis of PCR product(A) and restriction enzyme assay of recombinant vector pPICZαA- BoIFN-α0(B)

2.3 陽性重組酵母的誘導(dǎo)表達(dá)和Western blot鑒定

通過不同時段取樣的電泳分析，發(fā)現(xiàn)重組酵母在誘導(dǎo)96 h時的表達(dá)量最高，表達(dá)產(chǎn)物相對分子質(zhì)量約為18和21 ku(圖3A)，而根據(jù)BoIFN-α0成熟肽和C 端融合蛋白的編碼基因推導(dǎo)的蛋白質(zhì)大小為18 ku。其中一條表達(dá)蛋白質(zhì)大小比其推導(dǎo)相對分子質(zhì)量大3 ku，推測可能是因?yàn)楸磉_(dá)產(chǎn)物發(fā)生了一定程度的糖基化。Western blot結(jié)果顯示在18和21 ku處可見特異性條帶(圖3B)，證實(shí)均為BoIFN-α0基因表達(dá)產(chǎn)物，并且BoIFN-α0為可溶性分泌表達(dá)。

2.3 表達(dá)產(chǎn)物的抗病毒活性檢測

經(jīng)60%飽和硫酸粗純后的重組BoIFN-α0用于抗病毒活性鑒定。重組BoIFN-α0 孵育MDBK(100 μL·孔-1)，24 h后接毒VSV，100 TCID50·孔-1，48 h后用顯微鏡觀察細(xì)胞病變情況，顯示高濃度的重組BoIFN-α0對病毒的抑制作用明顯，對細(xì)胞的保護(hù)率達(dá)到100%，但隨著稀釋度的增加，重組BoIFN-α0對細(xì)胞的保護(hù)率下降，稀釋度達(dá)到100×47時對細(xì)胞沒有保護(hù)作用(圖4)。結(jié)果表明：分泌型BoIFN-α0 具有良好的抗病毒活性，經(jīng)Reed-Muench法計(jì)算，重組BoIFN-α0在MDBK/VSV系統(tǒng)中抗病毒活性為5.72×106U·mg-1。

3 討 論

IFN-α基因是一類無內(nèi)含子的多基因家族，主要在病毒感染的外周血白細(xì)胞、淋巴瘤細(xì)胞或骨髓瘤細(xì)胞中表達(dá)，從動物體內(nèi)純化的IFN-α中發(fā)現(xiàn)，有多種序列和性質(zhì)上存在差異的亞型。在人的基因組中克隆出了12種基因?qū)儆贗FN-α家族，鼠體內(nèi)IFN-α編碼基因存在14種亞型，其中IFN-α4，IFN-α11，IFN-α12亞型比其他亞型有更高的活性，IFN-α7/10與其他亞型比較活性較低[12]。X.Tan等克隆了大熊貓IFN-α的12個亞型，研究發(fā)現(xiàn)IFN-α3/4/8三個亞型比其他亞型有更高的抗病毒活性，比IFN-α6高出四倍。然而IFN-α2/5/7/11的活性比IFN-α6更低[13]。BoIFN-α由567個核苷酸編碼1個開放閱讀框(ORF)，其中包括 23個氨基酸的信號肽和166個氨基酸的成熟多肽[14]。并且它們之間存在著不同的活性，但各個亞型之間差異性卻鮮有報(bào)道。畢赤酵母是一種新型的外源基因表達(dá)系統(tǒng)，已有多種蛋白質(zhì)在此系統(tǒng)中高效表達(dá)。它是一種甲基營養(yǎng)型酵母 ，在缺乏葡萄糖、甘油等碳源時，可利用甲醇作為唯一碳源而生長。其醇氧化酶(AOX1) 啟動子受甲醇的嚴(yán)格控制，可調(diào)控外源蛋白質(zhì)的高效表達(dá)。其既具有原核表達(dá)系統(tǒng)的高表達(dá)量、可大規(guī)模培養(yǎng)和成品低廉的優(yōu)點(diǎn)，又具有真核表達(dá)系統(tǒng)可進(jìn)行蛋白翻譯后修飾、加工和折疊等優(yōu)點(diǎn)[15]。本研究獲得的穩(wěn)定分泌表達(dá)重組牛α0干擾素的酵母菌株在 BMMY 培養(yǎng)基中經(jīng)甲醇誘導(dǎo)發(fā)酵96 h后，發(fā)酵上清經(jīng)60%飽和硫酸銨沉淀，PBS透析后用BCA蛋白檢測試劑盒測得其質(zhì)量濃度為1.917 mg·mL-1，比活為5.72×106U·mg-1。而崔子寅、李學(xué)仁利用畢赤酵母表達(dá)BoIFN-αA、奶牛α干擾素在MDBK/VSV系統(tǒng)抗病毒活性為8.93×106U·mg-1和5.1×106U·mg-1。比較后發(fā)現(xiàn)BoIFN-α0抗病毒活性較BoIFN-αA低，略高于奶牛α干擾素，差異不明顯，但高于原核表達(dá)的牛α干擾素10倍以上[16]。分析其原因，與原核表達(dá)系統(tǒng)相比，巴斯德畢赤酵母對分泌的目的蛋白可以進(jìn)行類似高等真核生物的信號肽的剪切、二硫鍵形成、糖基化、磷酸化修飾等蛋白質(zhì)加工過程。而且酵母表達(dá)的重組牛α干擾素不需要變性、復(fù)性等生產(chǎn)工藝 ，因此更易進(jìn)行大規(guī)模的生產(chǎn)。本研究對發(fā)酵上清采用飽和硫酸銨沉淀蛋白質(zhì)，離心濃縮，PBS透析，盡可能排除培養(yǎng)基長時間發(fā)酵對蛋白質(zhì)活性的影響，也利于蛋白質(zhì)的保存。目前IFN的研究多以人IFN-α為主，人用重組IFN-α 主要用于抗腫瘤和抗病毒研究，已用于臨床[17-18]。市場上已有商品化的重組豬IFN-α和重組犬IFN-α，BoIFN-α研究相對較少[19]，而對BoIFN-α各個亞型抗病毒活性差異的系統(tǒng)研究更少。本研究為以后研究BoIFN-α各個亞型的生物活性差異奠定基礎(chǔ)，并對未來研究高效BoIFN-α抗病毒制劑提供物質(zhì)和理論基礎(chǔ)。

A.AOX1擴(kuò)增；B.BoIFN-α0擴(kuò)增；M.Trans2K DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～5.選擇的5株重組酵母的PCR產(chǎn)物A.AOX1 amplification；B.BoIFN-α0 amplification；M.Trans2K DNA marker；1-5.Products of PCR from 5 selected clones圖2 PCR鑒定酵母中BoIFN-α0基因Fig.2 Identification of the gene of BoIFN-α0

M.蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～5：選擇的5株重組酵母的表達(dá)產(chǎn)物；6.陽性重組菌的培養(yǎng)上清；7.陰性對照M.Standard protein marker；1-5.Expressed products from 5 selected clones；6.Cultural supernatants of positive strain；7.Negative control圖3 表達(dá)產(chǎn)物的 SDS-PAGE分析(A)和Western blot檢測(B)Fig.3 SDS-PAGE analysis (A) and Western blot (B) Identification of expressed products

橫坐標(biāo)0～11系n分別為0～11時的稀釋度0-11 of x axis is the dilutions when n=0-11圖4 重組 BoIFN-α0的活性檢測Fig.4 Activity assay of recombinant BoIFN-α0

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(編輯 白永平)

Expression of the Bovine Interferon Alpha0 with Antiviral Activity inPichiaPastoris

PENG Tong-quan，SHAO Jian-wei，ZHANG Run-xiang，CAO Chong， MA Bo，GAO Ming-chun*，WANG Jun-wei*

(CollegeofVeterinaryMedicine，NortheastAgriculturalUniversity，Harbin150030，China)

In this study，we cloned BoIFN-α0 mature peptide gene and expressed it in the eukaryocyte， and also studied the activity of this protein.To achieve secretary expression of bovine interferon-α0 (BoIFN-α0 ) inPichiapastoris，the BoIFN-α0 mature peptide gene was synthesized by PCR and inserted into the secreted expression vector pPICZαA.ThePmeⅠ linearized resultant recombinant plasmid was transformed intoP.pastorisGS115 by electroporation and the positive recombinant strainsP.pastoriswere selected by 100 μg·mL-1of zeocinTMand identified by PCR with the AOX1 primers and the specific primers.The positive recombinant strains were induced with methanol and achieved secretory expression inP.pastorisYeast expression system.The products in culture medium were detected by SDS-PAGE and Western blot.The SDS-PAGE results showed that the recombinant protein was expressed in the supernatant with molecular of 18 and 21 kDa (with the difference of glycosylation).Furthermore，the BoIFN-α0 was able to efficiently inhibiting virus replication in vesicular stomatitis virus (VSV)/MDBK cells detection system and its antiviral activity was about 5.72×106U·mg-1.These results provided a basis for further application of BoIFN-α.

BoIFN-α0；Pichiapastoris；secretory expression；antiviral activity

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.01.016

2014-05-26

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(奶牛)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-37)；國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2012BAD12B05)；國家科技支撐計(jì)劃子課題(2012BAD12B03-3)；黑龍江省科技攻關(guān)項(xiàng)目(GA09B302)

彭統(tǒng)全(1987-)，男，河南商丘人，碩士生，主要從事獸醫(yī)微生物與免疫學(xué)研究，E-mail:ptqneau@126.com

*通信作者：王君偉，教授，E-mail：jwwang@neau.edu.cn；高明春，E-mail：gaomingchun@163.com

S852.4

A

0366-6964(2015)01-0124-06