陳洪波

(武漢輕工大學(xué)動物科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院 動物營養(yǎng)與飼料安全湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，武漢 430023)

副豬嗜血桿菌感染:宿主免疫應(yīng)答模型與巨噬細(xì)胞活化

陳洪波*

(武漢輕工大學(xué)動物科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院 動物營養(yǎng)與飼料安全湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，武漢 430023)

副豬嗜血桿菌是當(dāng)前世界養(yǎng)豬業(yè)中最主要的細(xì)菌性病原體之一，感染后臨床表現(xiàn)以格拉澤病為典型特征，嚴(yán)重威脅著豬群健康，應(yīng)用層面的防治工作仍存在很多問題。近年來，該細(xì)菌毒力因子與宿主免疫應(yīng)答等相關(guān)研究取得了很大進(jìn)步，但基礎(chǔ)層面宿主-病原互作的分子機(jī)制仍不清楚?；诓煌i對該細(xì)菌存在遺傳抗性差異，隨著豬基因組科學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，越來越多的國內(nèi)外學(xué)者正寄希望于分子抗病育種途徑以從根本上解決細(xì)菌感染。為此，本文結(jié)合作者所在課題組的以往工作通過綜述現(xiàn)有高通量數(shù)據(jù)初步提出了宿主免疫應(yīng)答的分子模型，重點探討巨噬細(xì)胞活化對細(xì)菌感染或宿主保護(hù)性免疫應(yīng)答可能造成的影響，圍繞其中關(guān)鍵的分子調(diào)控進(jìn)行了較為深入的分析，旨在為將來發(fā)掘具有應(yīng)用價值的候選基因素材/分子標(biāo)記提供借鑒。最后，本綜述就下一步相關(guān)工作的開展提出了幾點思考。

豬；育種；副豬嗜血桿菌；免疫應(yīng)答；巨噬細(xì)胞

1 副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis，HPS)感染

1.1 細(xì)菌感染與防治工作中存在的突出問題

副豬嗜血桿菌是一種定居在豬上呼吸道部位的革蘭陰性短小桿菌。毒力菌株侵入機(jī)體后可導(dǎo)致嚴(yán)重系統(tǒng)性炎癥疾病，臨床表現(xiàn)以格拉澤病(Gl?sser’s disease)——血纖維蛋白性心包炎、多發(fā)性關(guān)節(jié)炎、腦膜炎為典型特征[1]，有些感染豬還表現(xiàn)出急性肺炎、急性敗血癥等[2]。據(jù)作者不完全統(tǒng)計，該傳染病目前在中國20余省份有報道，幾乎呈全國分布的態(tài)勢；另外，HPS感染也是歐美等許多國家養(yǎng)豬業(yè)中主要的細(xì)菌性疾病之一。值得關(guān)注的是，流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示：HPS和豬其他重大病原體存在共同感染，如豬呼吸與繁殖綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)、豬流感病毒(swine influenza viruses，SIV)、豬圓環(huán)病毒II型(porcine circovirus type-2，PCV-2)、豬鏈球菌(S.suis)、豬胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae，APP)、致病性埃希大腸桿菌(E.coli)等[3-5]。國內(nèi)外已經(jīng)將HPS感染視為世界養(yǎng)豬業(yè)的嚴(yán)重威脅[6]。某些抗生素治療[如泰拉霉素(tulathromycin)]對于包括該細(xì)菌在內(nèi)的豬呼吸系統(tǒng)病原體具有一定的作用[7]，而最近一些研究表明：有些抗生素對HPS的作用有限，如馬波沙星(marbofloxacin)[8]、恩氟沙星(enrofloxacin)[9]等。需要指出，由于不同國家和地區(qū)豬場中HPS毒力株的流行特點、養(yǎng)殖模式和抗生素抗性等方面存在差異，導(dǎo)致同一種抗生素在這些國家和地區(qū)間的治療效果可能存在很大差異，這個問題需要引起我們的充分重視。國內(nèi)外對于抗生素的使用規(guī)定十分嚴(yán)格，抗生素濫用嚴(yán)重威脅食品安全，已經(jīng)不符合未來養(yǎng)豬業(yè)的綠色發(fā)展理念。疫苗是目前國內(nèi)外預(yù)防HPS感染的主要途徑之一，但是問題在于：由于HPS毒力菌株存在多種血清型，所以它們對于HPS感染后宿主的交叉保護(hù)非常有限[10-11]。最新研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)和昆蟲體內(nèi)存在一些抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)成分對HPS具有較好的殺傷作用[12-13]，盡管極具應(yīng)用前景，但相關(guān)研究仍停留在實驗室層面。

1.2 抗病育種途徑解決HPS感染的可行性思考

優(yōu)良品種對畜牧業(yè)的貢獻(xiàn)率達(dá)到40%，而育種目標(biāo)并非一成不變，它是隨著社會需求以及現(xiàn)實生產(chǎn)中遇到的問題不斷調(diào)整的。過去30多年間，肉質(zhì)、繁殖、瘦肉率、飼料利用率構(gòu)成了豬遺傳育種的主要內(nèi)容，然而最近幾年已經(jīng)擴(kuò)展到存活率和疾病抗性等性狀[14]。未來一段時期，豬的遺傳育種將朝著“高產(chǎn)高效、優(yōu)質(zhì)、抗性”的目標(biāo)繼續(xù)努力，也就是說在保持(或者繼續(xù)改良)傳統(tǒng)經(jīng)濟(jì)性狀的同時需要額外關(guān)注疾病抗性性狀。由于抗病育種能夠從根本上改善豬群健康狀態(tài)、提高生產(chǎn)效率、解決抗生素等治療性藥物濫用引發(fā)的一系列不利問題，因此在國內(nèi)外正日益引起大家的高度關(guān)注。為此，“動物基因組與健康(animal genomics for animal health，AGAH)”國際研討會于2007年首次召開，旨在召集全球相關(guān)方向的優(yōu)秀學(xué)者共同探討未來動物健康和抗病育種中的關(guān)鍵問題[15]。

豬中，無論是一般抗病力還是特殊抗病力都有其一定的遺傳基礎(chǔ)。格拉澤病連同PRRSV、SIV、PCV-2感染一起，相關(guān)抗病育種工作是未來亟待解決的問題[14]。西班牙學(xué)者I.Blanco等最近的一項標(biāo)志性研究發(fā)現(xiàn)：不同豬對HPS感染存在抗性/易感差異，這為下一步深入開展遺傳抗性研究提供了依據(jù)[16]。但遺憾的是，截至目前HPS感染過程中宿主保護(hù)性免疫應(yīng)答的分子遺傳基礎(chǔ)研究仍十分有限，這與目前高速發(fā)展的基因組科學(xué)技術(shù)極不相稱。緊隨I.Blanco等的報道[16]，筆者利用基因芯片技術(shù)于2009年首次對HPS感染后豬脾組織差異轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了分析[17]，開啟了HPS-宿主互作分子機(jī)制的系統(tǒng)研究。但這僅僅是一個開始。結(jié)合多年來筆者對這一領(lǐng)域的持續(xù)關(guān)注，簡單介紹目前相關(guān)研究進(jìn)展的基礎(chǔ)上重點探討HPS感染過程中宿主的免疫應(yīng)答模型及其早期關(guān)鍵的細(xì)胞應(yīng)答與分子事件，并就下一步需要著力解決的問題展開討論，希望能夠為國內(nèi)學(xué)者開展相關(guān)研究提供借鑒。

2 HPS感染的宿主早期免疫應(yīng)答模型

系統(tǒng)揭示HPS感染過程中豬關(guān)鍵器官尤其是免疫相關(guān)器官或組織中的基因差異表達(dá)情況是深入理解宿主保護(hù)性免疫應(yīng)答的第一步。在筆者對脾組織的差異轉(zhuǎn)錄組研究之后，又有實驗室對肺組織和豬肺泡巨噬細(xì)胞(porcine alveolar macrophage，PAM)中的轉(zhuǎn)錄組差異進(jìn)行了分析[18-19]。與現(xiàn)有技術(shù)相比盡管存在一定的局限，但這三項研究很具有代表性，它們涵蓋了豬中最大的二級免疫器官、最大的呼吸器官，以及對于HPS感染非常重要的細(xì)胞免疫應(yīng)答。經(jīng)過系統(tǒng)總結(jié)(主要數(shù)據(jù)來源[17-19])，筆者首次構(gòu)建出豬對于HPS感染的基本免疫應(yīng)答模型(圖1)，為下一步深入開展研究提供了重要線索。

寄生在豬呼吸道部位的HPS毒力菌株如果不能通過物理作用(如黏液流動、咳嗽等)被及時清除，則發(fā)生細(xì)菌定植和侵襲。在肺泡腔會遇到宿主免疫系統(tǒng)的第一道防線——肺泡巨噬細(xì)胞(PAM)，此外，細(xì)菌也可能依賴其毒力蛋白P2和CDT[20-21]經(jīng)上皮類型細(xì)胞侵襲；我們之前的初步分析結(jié)果顯示：TLR2-MyD88信號可能在HPS-宿主互作中發(fā)揮關(guān)鍵作用[22]。PK-15細(xì)胞(豬腎上皮細(xì)胞)的體外研究模型揭示HPS感染的促炎效應(yīng)依賴NF-κB[23]；促炎因子釋放可導(dǎo)致附近毛細(xì)血管中中性粒細(xì)胞的募集，但活化中性粒細(xì)胞會使豬鈣粒蛋白S100A8、S100A9、S100A12大量釋放形成強(qiáng)烈的促炎正反饋，這些分子有可能作為損傷相關(guān)分子模式(damage-associated molecular pattern，DAMP)加劇宿主組織損傷[22]；已經(jīng)證明：S100A8、S100A9、S100A12是人和小鼠關(guān)節(jié)炎的生物標(biāo)志物[24]，HPS感染后的關(guān)節(jié)炎病征可能與此有關(guān)。但HPS感染同時還上調(diào)表達(dá)補(bǔ)體基因(C1R、C4BPA)、病原菌識別蛋白基因(PGLYRP1)和抗菌肽基因(SLC11A1、LTF、CAMP)；而且宿主同時表現(xiàn)出促炎(IL-1β↑、IL-8↑)和抗炎(IL-10↑、TGF-β↑)兩種效應(yīng)(圖1)。從這些數(shù)據(jù)可以看出：HPS感染過程中細(xì)菌免疫逃避與宿主保護(hù)性應(yīng)答之間產(chǎn)生對抗。只不過實際情況是：對抗過程中宿主保護(hù)性免疫逐漸處于弱勢，最終使HPS感染加重。那么問題關(guān)鍵在于：是什么原因?qū)е滤拗鞅Ｗo(hù)性免疫不能發(fā)揮積極作用？

圖中所示基因均在HPS感染后差異表達(dá)極顯著All of the genes displayed in the figure are differentially expressed genes following HPS infection 圖1 副豬嗜血桿菌感染過程中豬的免疫應(yīng)答模型Fig.1 The proposed model for the host immune response during HPS infection

如圖1所示，無論是在肺泡腔還是通過組織上皮侵染，HPS都會遇到巨噬細(xì)胞。筆者推測：HPS感染可能導(dǎo)致巨噬細(xì)胞免疫發(fā)生了不利于細(xì)菌有效清除的應(yīng)答方式。照此，巨噬細(xì)胞保護(hù)性免疫廢除不僅導(dǎo)致吞噬作用無法殺滅細(xì)菌，相反會導(dǎo)致大量細(xì)菌擴(kuò)散，最終結(jié)果是細(xì)菌廣泛侵襲、組織器官出現(xiàn)炎性損傷(圖1模型)。最具代表性的是RETN(Resistin)，該基因在脾[17]、PAM[19]和易感豬[18]中均表現(xiàn)出非常高的上調(diào)表達(dá)，暗示靶向該基因/蛋白質(zhì)的藥物可能具有臨床治療意義。細(xì)菌擴(kuò)散和持續(xù)感染還可能導(dǎo)致周圍組織中的巨噬細(xì)胞對細(xì)菌脂多糖(LPS)產(chǎn)生耐受而上調(diào)表達(dá)IL-10[25]，巨噬細(xì)胞耐受是一種重要的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，但代價較高，因為IL-10可以強(qiáng)烈抑制Ⅰ類和Ⅱ類抗原遞呈[26-27]。HPS感染導(dǎo)致脾和肺組織中豬MHCⅠ類和MHCⅡ類基因(豬中稱為SLA)顯著下調(diào)表達(dá)(圖1)，有意思的是：它們在抗性豬肺組織中并未被下調(diào)[18]；與MHC基因下調(diào)相呼應(yīng)，發(fā)病豬中參與T細(xì)胞活化的基因(如TCRA、DUSP14、VSIG4、GATA3)也被下調(diào)(圖1)；提示：動物因其細(xì)胞免疫和體液免疫被HPS嚴(yán)重削弱而最終發(fā)病死亡。與之相反，抗性豬由于在感染早期可以有效清除HPS(表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)ECMs及其調(diào)節(jié)信號TGF-β被上調(diào))而呈現(xiàn)出較強(qiáng)的組織修復(fù)能力[18]，這種修復(fù)還有助于屏蔽HPS經(jīng)上皮細(xì)胞的侵襲途徑。綜上所述，HPS感染后的一系列差異表達(dá)基因初步印證了筆者的推測，二者可互相解釋，所以在目前知識背景下巨噬細(xì)胞免疫應(yīng)答可能是理解HPS感染調(diào)控的關(guān)鍵。

3 宿主巨噬細(xì)胞活化與HPS感染

3.1 巨噬細(xì)胞替代激活信號及其與細(xì)菌易感性

組織微環(huán)境中巨噬細(xì)胞在先天免疫和獲得性免疫中十分重要，但功能發(fā)揮依賴其自身的活化方式。近年發(fā)現(xiàn)：巨噬細(xì)胞的不同激活方式與人類疾病(包括感染性疾病)密切相關(guān)，是機(jī)體免疫調(diào)節(jié)的重要組成[28]。巨噬細(xì)胞根據(jù)其激活方式分2種：一種是經(jīng)典激活的巨噬細(xì)胞(classically activated macrophages，CAM)，即M1型，主要參與保護(hù)性促炎反應(yīng)和抵抗細(xì)菌等病原體感染等；另一種是替代激活的巨噬細(xì)胞(alternatively activated macrophages，AAM)，即M2型，主要參與抑制炎癥和引發(fā)纖維性病變等。巨噬細(xì)胞替代激活主要依賴IL-4、IL-13和IL-10信號(圖2)；它們通過與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合分別激活細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的分子級聯(lián)：Jak1-STAT3/STAT6；Jak2-STAT3、Tyk2-STAT1/STAT6；Jak1-STAT3、Tyk2-STAT1。簡言之，胞質(zhì)內(nèi)Jak/Tyk-STAT級聯(lián)是發(fā)生替代激活的關(guān)鍵信號：Jak或Tyk激酶誘導(dǎo)STAT(信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子)磷酸化并形成二聚物，之后二聚物入核啟動基因轉(zhuǎn)錄(包括M2型標(biāo)志基因)、致使巨噬細(xì)胞發(fā)生表型和功能轉(zhuǎn)變。此外，IL-4信號下游PI3K(磷酸肌醇-3-激酶)通路還有利于M2型巨噬細(xì)胞的增殖和存活。研究發(fā)現(xiàn)，人和小鼠中M2型巨噬細(xì)胞表達(dá)的標(biāo)志基因存在差異[29]，而且同一物種中(人)IL-4信號和IL-13信號啟動的基因轉(zhuǎn)錄也不完全相同[30]，暗示物種間巨噬細(xì)胞替代激活的分子信號及其調(diào)節(jié)可能具有選擇性。小鼠上研究表明，土拉熱桿菌(Francisellatularensis，F(xiàn)t)感染后小鼠巨噬細(xì)胞發(fā)生替代激活導(dǎo)致細(xì)胞抗菌效應(yīng)消失和細(xì)菌擴(kuò)散[31]；K.Kyrova等利用腸沙門菌(Salmonellaenterica)鼠傷寒血清型(Typhimurium)感染豬肺泡巨噬細(xì)胞后也發(fā)現(xiàn)了相同的現(xiàn)象(M2↑，M1↓)[32]。

3.2 HPS感染過程中巨噬細(xì)胞免疫應(yīng)答研究進(jìn)展

HPS感染與豬巨噬細(xì)胞的關(guān)系早在1998年曾經(jīng)被初步報道，M.H.Pampusch等發(fā)現(xiàn)，PAM體外吞噬HPS后其NO合成酶(iNOS)和亞硝酸鹽水平并未發(fā)生變化，并據(jù)此得出結(jié)論：PAM中活性氮相關(guān)信號通路并非清除HPS的關(guān)鍵先天免疫應(yīng)答[34]。幾乎在同一時間，J.Segalés等的研究結(jié)果表明：PAM對HPS的吞噬效率很低，并且PRRSV和HPS共同感染PAM時僅僅伴隨其中吞噬溶酶體數(shù)量增加，但PAM活化后的殺傷作用有限[35]。與前項研究相比，J.Segalés等似乎將PAM與HPS的互作研究往前推進(jìn)了一點點，但是他們認(rèn)為共同感染時PAM活化主要由PRRSV誘導(dǎo)，并未進(jìn)一步揭示HPS的作用。一項與之類似的研究還表明，HPS感染后導(dǎo)致血液中單核細(xì)胞的吞噬能力下降[36]。西班牙A.J.de la Fuente等對HPS感染與單核細(xì)胞的關(guān)系做了進(jìn)一步研究，盡管感染導(dǎo)致外周血單核細(xì)胞(PBMC)中SWC3+單核細(xì)胞和粒細(xì)胞數(shù)量增加，但這似乎對宿主的免疫保護(hù)貢獻(xiàn)甚微[37]；隨后該實驗室改進(jìn)了流式細(xì)胞分析策略，與之前結(jié)果相似，他們發(fā)現(xiàn)：PBMC中CD172a+CD163+單核細(xì)胞于感染后顯著增加，但有意思的是，單核細(xì)胞組織相容性分子SLAIIDR卻與此同時發(fā)生下調(diào)表達(dá)[38]；這似乎仍不能解釋為什么單核/巨噬細(xì)胞對HPS的殺傷作用有限，但是至少為深入理解“數(shù)量增加但免疫保護(hù)力低”提供了很有價值的線索。免疫應(yīng)答過程中，單核/巨噬細(xì)胞除了我們熟知的病原體吞噬作用外還具有“專業(yè)化”抗原遞呈能力，尤其是在對外源性抗原的加工遞呈方面。所以，R.Frandoloso等對于HPS感染后細(xì)胞免疫應(yīng)答的最新研究結(jié)果[38]與我們之前以及其他實驗室的基因芯片結(jié)果[17-19]所揭示的現(xiàn)象一致：細(xì)菌感染抑制了宿主免疫細(xì)胞的抗原遞呈能力(圖1)。2012年，筆者在系統(tǒng)總結(jié)多個實驗室的基因芯片結(jié)果時就有了初步構(gòu)建細(xì)菌感染的宿主免疫應(yīng)答模型的想法，隨后依據(jù)模型(圖1)推測：HPS感染可能導(dǎo)致巨噬細(xì)胞免疫發(fā)生了不利于細(xì)菌有效清除的應(yīng)答方式。值得關(guān)注的是，該推測很快被最近的一項研究所初步證實：M.Costa-Hurtado等比較了HPS強(qiáng)毒力株與無毒力株感染后對PAM細(xì)胞表型的影響，發(fā)現(xiàn)毒力菌株感染后導(dǎo)致巨噬細(xì)胞的早期有效免疫應(yīng)答(活化)被延遲[39]。綜合以上分析，巨噬細(xì)胞活化作為一個具體的免疫應(yīng)答現(xiàn)象與HPS免疫逃避密切相關(guān)，可能并不像M.H.Pampusch等[34]認(rèn)為的那樣：巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的先天免疫對于清除HPS“不重要”，相反，對于理解格拉澤病分子致病機(jī)制“十分重要”。但截至目前相關(guān)分子機(jī)制仍不清楚。

M.細(xì)胞膜；C.細(xì)胞質(zhì)；N.細(xì)胞核M.Membrane；C.Cytoplasm；N.Nucleus圖2 巨噬細(xì)胞替代激活的主要信號通路(人、小鼠)[30,33]Fig.2 Signalings mediating the alternative activation of macrophages

4 HPS感染過程中宿主巨噬細(xì)胞活化相關(guān)分子表達(dá)模式最新進(jìn)展

為了進(jìn)一步證明筆者的推測并闡述巨噬細(xì)胞活化的重要性，對HPS感染過程中宿主巨噬細(xì)胞活化相關(guān)分子表達(dá)模式做了深入分析。發(fā)現(xiàn)：細(xì)菌感染后M1型和M2型巨噬細(xì)胞的一系列標(biāo)志基因差異表達(dá)，但以M2型為主導(dǎo)(圖3)。脾和PAM中盡管也有M1型標(biāo)志基因被上調(diào)(如FCGR2B、CCL2)，但數(shù)量較少，而且相關(guān)標(biāo)志基因還被下調(diào)(IL1B、IFN-γ)。巨噬細(xì)胞激活標(biāo)志基因在抗性豬(FR)和易感豬(S)之間的差異更有意思：易感豬感染后24和72 h肺中呈現(xiàn)與脾、PAM中類似的情況(M2型占優(yōu))，而HPS抗性豬與易感豬相比，M2型巨噬細(xì)胞明顯減少，尤其在感染早期(24 h)。與脾和PAM相比，肺中差異表達(dá)標(biāo)志存在一定不同，這可能與感染試驗所用組織以及芯片類型有關(guān)(詳見圖3中參考文獻(xiàn))。此外，HPS感染還導(dǎo)致易感豬中STAT3上調(diào)表達(dá)(+1.8，72 hpi)，而抗性豬中PDK4下調(diào)表達(dá)(-2.5，24 hpi；-2.3，72 hpi)；它們均參與巨噬細(xì)胞替代激活信號(圖2)，其中，STAT3為IL-10誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞替代激活所必須[40]，PDK4則是銜接PI3K和Akt(位于IL4誘導(dǎo)的替代激活信號下游)的重要分子[33]；PDK4在感染發(fā)病豬的脾(+7.0)和PAM(+2.2)中均上調(diào)表達(dá)，這在邏輯上與抗性豬中的情況一致。

A.脾[17]和PAM[19]，6 dpi，“*”表示基因表達(dá)較對照組差異極顯著(P<0.01)；B.肺[18]，24 hpi與72 hpi；S代表HPS易感豬，C代表對照豬，F(xiàn)R代表HPS抗性豬；所示基因均達(dá)到顯著差異水平(P<0.01)A.Spleen[17] and PAM[19]，6 dpi，“*”：Differentially expressed at the significance level of P<0.01；B.Lung[18]，24 hpi and 72 hpi；S：HPS susceptive pigs，C：control，F(xiàn)R：fully resistant pigs；All genes in this figure are differentially expressed at the significance level of P<0.01圖3 HPS感染后巨噬細(xì)胞經(jīng)典激活(M1)與替代激活(M2)標(biāo)志基因的表達(dá)模式Fig.3 Gene expression patterns for classically activated macrophages(M1) and alternatively activated macrophages(M2) after HPS infection

5 ABCA1：巨噬細(xì)胞替代激活的重要調(diào)控分子

5.1 ABCA1簡介

ABCA1(ATP-binding cassette transporter A1)即ATP結(jié)合盒式蛋白1，屬于ATP驅(qū)動泵家族成員；該基因于HPS感染后呈顯著上調(diào)表達(dá)(圖3A)；最近研究發(fā)現(xiàn)，它不僅是巨噬細(xì)胞替代激活的典型標(biāo)志，還發(fā)揮著極其重要的調(diào)節(jié)作用。L.C.Pradel等研究發(fā)現(xiàn)，鼠ABCA1特異性地在Ly6Clow單核細(xì)胞和M2型巨噬細(xì)胞中表達(dá)；而且ABCA1-/-小鼠腹膜巨噬細(xì)胞經(jīng)IL-4(M2型誘導(dǎo))和INF-γ(M1型誘導(dǎo))刺激后分別影響到STAT6(↓)和STAT1(↑)的磷酸化水平[41]；在人的研究表明，ABCA1通過介導(dǎo)Jak2活化(酪氨酸磷酸化)從而激活STAT3、抑制巨噬細(xì)胞促炎反應(yīng)(IL-1B、IL-6、TNF-α)[42]；不僅如此(正調(diào)控STAT1、3、6的磷酸化)，ABCA1還可以增強(qiáng)小鼠巨噬細(xì)胞中TLR4信號依賴的IL-10表達(dá)而進(jìn)一步促使巨噬細(xì)胞替代激活[43]?？傊?，ABCA1是截至目前發(fā)現(xiàn)的唯一參與正調(diào)巨噬細(xì)胞3個替代激活信號(圖2)的關(guān)鍵分子。值得指出：與正常小鼠相比，ABCA1-/-小鼠對單核細(xì)胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes，Lm)的感染抗性明顯增強(qiáng)[44]，暗示ABCA1是細(xì)菌(或者某些細(xì)菌)的易感/抗性基因。

5.2 HPS感染過程中豬ABCA1介導(dǎo)宿主免疫應(yīng)答的分子調(diào)控

關(guān)于該基因在人和小鼠中的研究可能不能真實反映豬中的實際情況，但是鑒于前期發(fā)現(xiàn)的一系列重要線索，對于豬ABCA1的研究可能非常有意思。筆者發(fā)現(xiàn)，豬ABCA1基因在很多器官/組織中廣泛表達(dá)，但在不同的組織類型中存在一定差異；其中，在單核/巨噬細(xì)胞含量豐富的器官中如脾、肺、肝、胸腺、淋巴結(jié)表達(dá)量很高，而在胃、皮膚、背肌等組織中表達(dá)量很低(圖4)，暗示豬ABCA1基因在免疫應(yīng)答中具有重要作用。HPS感染后(脾)ABCA1參與一系列免疫應(yīng)答，尤其是吞噬細(xì)胞遷移、發(fā)育及其相關(guān)功能，介導(dǎo)凋亡、炎癥反應(yīng)和(免疫細(xì)胞的)活性氧族產(chǎn)生，此外，ABCA1還參與脂類與糖類等重要細(xì)胞代謝(圖5A)；豬ABCA1被多種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)，與IL6、CFS2等細(xì)胞因子關(guān)系密切(圖5B)，有意思的是：HPS感染后ABCA1與其他差異表達(dá)基因一起調(diào)節(jié)呼吸系統(tǒng)發(fā)育與功能(respiratory system development and function)，暗示其對于豬免疫調(diào)節(jié)的重要作用(圖5C)。至今，豬ABCA1介導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化的分子機(jī)制仍不清楚，深入研究將有助于揭示細(xì)菌致病機(jī)制和/或宿主保護(hù)性免疫的關(guān)鍵方面，目前筆者正在開展這部分工作。

圖4 豬ABCA1基因在免疫相關(guān)組織中存在較高水平的表達(dá)(內(nèi)參：ACTB)Fig.4 Higher abundance of porcine ABCA1 gene transcriptions in immune related tissues (Internal control：ACTB)

A.ABCA1介導(dǎo)的重要免疫應(yīng)答與代謝功能；B.ABCA1的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)(不含microRNA)；C.HPS感染過程中豬ABCA1調(diào)節(jié)呼吸系統(tǒng)發(fā)育及相關(guān)功能，灰色加亮表示HPS感染后脾中的差異表達(dá)基因，其中ABCA1基因及其直接分子關(guān)系加粗表示。基因芯片原始數(shù)據(jù)引自GSE11787[17]，分子功能與網(wǎng)絡(luò)利用IPA?在線分析、繪制A.Key IRs and metabolism mediated by ABCA1；B.Transcriptional regulations of ABCA1(not include microRNA)；C.Porcine ABCA1 regulates “Respiratory System Development and Function” during HPS infection，molecules that highlighted in gray are differentially expressed in porcine spleen following HPS infection，ABCA1 and its direct relationships with other molecules are presented in bold.Raw data involved in the analysis，which is performed by using IPA? software online，is cited from GSE11787[17]圖5 ABCA1的功能、調(diào)控與分子網(wǎng)絡(luò)分析Fig.5 Functions，regulations，and molecular networks of ABCA1

6 展 望

HPS感染后組織中相關(guān)差異表達(dá)基因數(shù)以千計，它們(上調(diào)/下調(diào))必然有其特定的生物學(xué)意義并遵循一定的規(guī)律(假如排除假陽性因素)，其中宿主免疫應(yīng)答規(guī)律處于核心地位，其余諸如代謝、發(fā)育、細(xì)胞凋亡、組織修復(fù)等均隨著宿主的易感或抗性程度而作出對應(yīng)調(diào)整。所以，在基礎(chǔ)研究層面應(yīng)首先深入理解免疫應(yīng)答，重點明辨宿主的保護(hù)性免疫與細(xì)菌免疫逃避對宿主免疫系統(tǒng)造成的破壞。HPS感染后宿主免疫應(yīng)答涉及到不同層面(先天免疫、抗原遞呈、獲得性免疫)的諸多內(nèi)容[17-19]，它們都是非常重要的，因為免疫系統(tǒng)的各條“戰(zhàn)線”只有“通力合作”才能有效對抗感染。最聰明、最經(jīng)濟(jì)、最有效的宿主總是能夠把病原體控制在感染早期，從而保證機(jī)體正常生長發(fā)育盡可能地不受牽連，然而自然情況下面對大多數(shù)強(qiáng)毒力病原體感染這可能非常困難。但新技術(shù)的發(fā)展可以把這變成現(xiàn)實。豬分子育種科研工作者在關(guān)注“分子”之前如果首先能理解宏觀意義上的“生物現(xiàn)象”可能是一個不錯的策略。來自多個實驗室的數(shù)據(jù)表明：HPS感染削弱了巨噬細(xì)胞的免疫力從而造成豬對細(xì)菌易感。鑒于HPS的致病特點以及PAM在呼吸系統(tǒng)感染疾病中的特殊地位，有理由相信巨噬細(xì)胞免疫在其中的關(guān)鍵作用。盡管可能還不夠全面，但巨噬細(xì)胞某些重要調(diào)控分子/基因可能是解決問題的突破口。

正如前述，關(guān)注巨噬細(xì)胞活化并非是唯一內(nèi)容，如果把它在免疫應(yīng)答系統(tǒng)中的各種功能“串”起來可能會使我們的認(rèn)識更深入、全面；此外，近年HPS毒力因子研究方面進(jìn)展很大[45-47]，發(fā)現(xiàn)不同血清型間保守的毒力因子對于新型交叉保護(hù)疫苗的開發(fā)很有價值，反過來，探討這一類毒力因子對宿主巨噬細(xì)胞免疫應(yīng)答乃至其他免疫應(yīng)答的影響對于抗病育種工作也很有意義；功能基因組、蛋白質(zhì)組和免疫學(xué)諸多新技術(shù)可以幫助我們做到這些。與豬其他方面的分子育種相比，抗病育種可能會遇到更多困難和挑戰(zhàn)(例如高投入)，不僅僅是分子層面的問題，其落腳點還在于表型；HPS感染的宿主免疫應(yīng)答與臨床癥狀評分方面目前已經(jīng)有了一定積累(圖6)，這些極具價值的研究為表型評價體系的建立提供了參考。國內(nèi)存在很多優(yōu)良抗逆性品種(盡管抗逆性與抗病不能完全等同)，有廣闊的挖掘空間。因此，最佳途徑是：從“比較”出發(fā)利用科學(xué)、易行的感染方案[48-49]做“big work”[15]有望獲得令人振奮和信服的結(jié)果。長遠(yuǎn)來看，HPS與其他病原體混合感染的現(xiàn)實局面也將不得不面對。

文獻(xiàn)來源：www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmedFrom：www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed圖6 HPS感染相關(guān)宿主免疫應(yīng)答與臨床癥狀評分的代表性文獻(xiàn)發(fā)表情況Fig.6 Typical publications on host IRs and scoring of HPS infection

致謝：農(nóng)業(yè)動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室(華中農(nóng)業(yè)大學(xué))趙書紅教授提供的基因芯片原始數(shù)據(jù)，美國農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)研究院動物寄生蟲病研究室(USDA/ARS/APDL)Joan K.Lunney研究員提供IPA基因網(wǎng)絡(luò)分析上的便利，武漢輕工大學(xué)劉玉蘭教授、張晶博士、郭玲博士等在組織樣本采集上提供的幫助。

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(編輯 白永平)

HaemophilusparasuisInfection：Model for the Host Immune Response and the Macrophage Activation

CHEN Hong-bo*

(HubeiCollaborativeInnovationCenterforAnimalNutritionandFeedSafty,SchoolofAnimalScienceandNutritionalEngineering，WuhanPolytechnicUniversity，Wuhan430023，China)

Haemophilusparasuis(HPS) is one of the main virulent bacteria that threating the pig industry worldwide.HPS infection typically causes serious inflammations，namely Gl?sser’s disease.But there are still many troubles in disease prevention and control.Though much progress has been made in the basic research fields of bacterial virulent factors and host immune responses(IR) recently，the mechanisms of host-bacillus interaction are largely unknown.As the different susceptibilities in pigs exist，genomic selection based on molecular breeding strategy will receiving increasing attention from scientists and commercial breeders.Here，some high through-out data from our and other labs are reviewed in brief and the model for the host IR is proposed.We hypothesize that the activation of macrophage during the early stage of IR may play pivotal roles in determining bacillus escape and/or host protective IRs.In addition，key molecules and pathways involved in the IR of macrophage are discussed，which we hope will be helpful for the marker identifications in objectives of molecular breeding.Still，there is much work to be done and some suggestions are proposed in the article.

pig；breeding；Haemophilusparasuis；immune response；macrophage

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.01.001

2014-06-09

武漢市科技局應(yīng)用基礎(chǔ)研究計劃項目(2013020501010178)；湖北省自然科學(xué)基金(2013CFB324)；國家自然科學(xué)基金(31301939)

陳洪波(1981-)，男，山東定陶人，講師，博士，主要從事分子生物學(xué)與動物育種研究

*通信作者：陳洪波，E-mail：chen_hong_bo@126.com，Tel：027-83956175

S852.61

A

0366-6964(2015)01-0001-11