閆云峰，楊 華，楊永林，潘曉亮，鄒云龍

(1．新疆農(nóng)墾科學(xué)院 兵團(tuán)綿羊繁育生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子 832000；2.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，石河子 832001； 3.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州 730000)

日糧不同蛋白質(zhì)水平對(duì)綿羊IGF-1和GH分泌及基因表達(dá)的影響

閆云峰1,2，楊 華1*，楊永林1，潘曉亮2，鄒云龍3

(1．新疆農(nóng)墾科學(xué)院 兵團(tuán)綿羊繁育生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子 832000；2.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，石河子 832001； 3.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州 730000)

本研究旨在探討不同蛋白質(zhì)水平日糧對(duì)綿羊胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)和生長(zhǎng)激素(GH)分泌及基因mRNA表達(dá)量的影響，為科學(xué)配置肉羊飼料及研究肉羊生長(zhǎng)發(fā)育提供基礎(chǔ)。選擇6月齡體重相近的多胎薩?？斯?8只，隨機(jī)分為3組，分別飼喂不同蛋白質(zhì)水平的日糧(低蛋白日糧、中蛋白日糧和高蛋白日糧)。采用ELISA方法和SYBR Green Real-time PCR方法檢測(cè)日糧不同蛋白質(zhì)水平對(duì)不同生長(zhǎng)發(fā)育階段(30、60 、90 和120 d)羔羊外周血中IGF-1、GH濃度和皮膚組織中基因表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，日糧蛋白質(zhì)水平顯著影響綿羊平均日增重、外周血中IGF-1和GH的濃度以及皮膚組織IGF-1基因的表達(dá)豐度，而未顯著影響GH基因的表達(dá)豐度。結(jié)果提示，隨著日糧蛋白質(zhì)水平的升高，綿羊生長(zhǎng)發(fā)育快，外周血中IGF-1濃度增加，GH濃度降低，IGF-1基因表達(dá)量增加。

綿羊；蛋白水平；IGF-1；GH；分泌；基因表達(dá)

動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育受神經(jīng)內(nèi)分泌生長(zhǎng)軸的調(diào)控，即“下丘腦-垂體-靶器官”途徑，胰島素生長(zhǎng)因子(Insulin-like growth factor-1，IGF-1)和生長(zhǎng)激素(Growth hormone，GH)處于生長(zhǎng)軸的中心環(huán)節(jié)，對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育起著重要的調(diào)控作用[1-2]。IGF-1也稱生長(zhǎng)介素，是一種含有70個(gè)氨基酸的細(xì)胞增殖調(diào)控因子，由肝和骨髓基質(zhì)細(xì)胞分泌，動(dòng)物體內(nèi)約90% 的IGF-1來(lái)源于肝，其主要通過(guò)GH對(duì)GHR作用而使IGF-1進(jìn)入血液[3]，促進(jìn)骨骼增長(zhǎng)、加速蛋白質(zhì)合成和降解脂肪[4]。GH 也稱促生長(zhǎng)激素，由垂體嗜酸性細(xì)胞產(chǎn)生，是動(dòng)物垂體前葉合成和分泌的具有種屬特異性的一種單鏈多肽激素，普遍存在于各種脊椎動(dòng)物中[5]。GH有兩種作用方式：一是作用于靶器官上的相應(yīng)受體，產(chǎn)生的IGF-I以內(nèi)分泌的方式進(jìn)入循環(huán)血液，通過(guò)與結(jié)合蛋白(IGFBPs)結(jié)合最終對(duì)動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。二是GH直接作用于靶器官相應(yīng)受體，通過(guò)自分泌或者旁分泌IGFs，或直接影響細(xì)胞代謝而對(duì)動(dòng)物器官的生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)行調(diào)節(jié)。研究表明GH和IGF-1基因在綿羊多種組織中廣泛表達(dá)，其中在皮膚組織中呈中豐度表達(dá)[6-8]。

營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)動(dòng)物體的某些基因表達(dá)起著重要的調(diào)控作用，其作用主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄或翻譯前水平，而對(duì)翻譯后的影響較小。大多數(shù)的研究主要以豬、雞和大鼠為研究對(duì)象，以綿羊?yàn)檠芯繉?duì)象的試驗(yàn)較少，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)影響基因表達(dá)及分泌是否存在種屬特異性值得探究。本試驗(yàn)以新疆農(nóng)墾科學(xué)院培育的多胎薩?？诵缕废禐樵囼?yàn)材料，采用ELISA方法分析日糧不同蛋白質(zhì)水平影響綿羊外周血中IGF-1和GH的分泌，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法分析日糧不同蛋白質(zhì)水平影響綿羊IGF-1和GH基因表達(dá)，旨在探討營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與內(nèi)分泌及生長(zhǎng)軸基因表達(dá)的關(guān)系，為肉羊新品系培育和高效養(yǎng)殖提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及日糧

選用新疆農(nóng)墾科學(xué)院種羊場(chǎng) 6月齡生長(zhǎng)發(fā)育正常、平均體重33.65 kg的多胎薩福克公羔18只(P>0.05)，按照中國(guó)肉羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)(NY/T816-2004)設(shè)計(jì)日糧，采用單因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)，隨機(jī)分為3組(15%為低蛋白組；18%為中蛋白組；21%為高蛋白組)，每組均以6只羔羊?yàn)檠芯繉?duì)象，各組除日糧蛋白質(zhì)水平不同外，能量及其他營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)基本保持一致。根據(jù)新疆當(dāng)?shù)仫曫B(yǎng)綿羊的主要飼料成分及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值得出飼料配方及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

1.2 樣品采集

每組羔羊單獨(dú)舍飼，每天飼喂 2 次，自由飲水，羔羊經(jīng)預(yù)飼期7 d，試驗(yàn)期120 d，分為0、30、60、90和120 d 5個(gè)時(shí)間點(diǎn)，采樣當(dāng)天于清晨08:00稱量空腹?fàn)顟B(tài)下的羔羊體重，并采集頸靜脈血液2 mL及體側(cè)部皮膚組織。靜脈血于4 ℃靜置1 h，900×g離心15 min，分離血清，取上清分裝，-20 ℃凍存；從低蛋白組、中蛋白組和高蛋白組中各隨機(jī)選取3只羔羊，在5個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集每只羔羊的皮膚組織樣本，皮膚組織立即放入液氮中速凍，-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要儀器與試劑

酶標(biāo)儀(Model 550，美國(guó)Bio-Rad公司)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Light Cycler 2.0，美國(guó)Roche公司)，Precellys 24 組織勻質(zhì)器(法國(guó)Bertin公司)，微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(NanoPhotometer，德國(guó)Implen公司)。

綿羊GH、IGF-1的ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海藍(lán)基生物科技有限公司，E.Z.N.A.TMTotal RNA KitⅠ購(gòu)自美國(guó)Omega生物技術(shù)公司，Primer ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司、FastStar DNA Master SYBR Green I購(gòu)自美國(guó)Roche生物科技公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 綿羊外周血中IGF-1、GH的ELISA檢測(cè) 取分裝5個(gè)時(shí)間點(diǎn)的羔羊血清，共計(jì)90份，根據(jù)ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行綿羊外周血中IGF-1和GH濃度的測(cè)定。

1.4.2 綿羊IGF-1和GH基因的引物設(shè)計(jì) 以3-磷酸甘油醛脫氫酶基因(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogease，GAPDH)作為持家基因，從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)檢索綿羊IGF-1(NM-001009774)、GH(NM-001009315)mRNA序列，用Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)定量PCR引物，GAPDH引物參考楊華等[9]報(bào)道的序列，引物序列見(jiàn)表2，由上海立菲生物技術(shù)有限公司合成。

表1 日糧組成與營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)，%)

Table 1 Compositions and nutrient levels in diet (air dry basis，%)

項(xiàng)目Item低蛋白組Lowproteingroup中蛋白組Mediumproteingroup高蛋白組Highproteingroup日糧組成Ingredient玉米Corn26.010.00.0苜蓿干草Alfalfa30.025.050.0棉籽殼Cottonshell32.027.013.0番茄渣Tomatopomace10.020.010.0食鹽Salt0.50.50.5精料補(bǔ)充料Feedsupplement0.016.025.0石粉Limestone1.01.01.0緩沖劑Bufferingagent0.50.50.5合計(jì)Total100.0100.0100.0營(yíng)養(yǎng)水平Nutrientlevel消化能/(MJ·kg-1)DE15.215.015.4粗蛋白質(zhì)/(g·kg-1)CP150.0180.0210.0鈣/(g·kg-1)Ca4.14.24.3總磷/(g·kg-1)TP2.02.02.1

營(yíng)養(yǎng)水平除代謝能、鈣、磷為計(jì)算值外均為實(shí)測(cè)值

The nutrient levels are measured values，except ME，calcium and phosphorus are calculated values

表2IGF-1、GH和GAPDH引物參數(shù)

Table 2 Parameters of oligo-nucleotide primer pairs for theIGF-1，GHandGAPDH

目的基因Targetgene引物序列(5'-3')Primersequence產(chǎn)物大小/bpProductsize退火溫度/℃AnnealingtemperatureIGF-1F:CCAGTCACATCCTCCTCGR:TACATCTCCAGCCTCCTCA251(76～326)54GHF:TGTTTGCCAACGCTGTGCR:CTGGGTGTTCTGGATGGAGTA119(107～325)56GAPDHF:CTGACCTGCCGCCTGGAGAAAR:GTAGAAGAGTGAGTGTCGCTGTT149(766～914)60

1.4.3 總RNA提取 皮膚組織總RNA提取按照E.Z.N.A.TMTotal RNA KitⅠ試劑盒說(shuō)明書，用微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定總RNA濃度和純度，并用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的質(zhì)量。

1.4.4 RT-PCR 按照Primer ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒說(shuō)明書對(duì)總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。GAPDH、IGF-1和GH基因的PCR反應(yīng)體系為25 μL，包括1.5 μL cDNA模板，12.5 μL 2×EasyTaq PCR SuperMix，上游和下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，退火溫度退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

1.4.5 PCR 產(chǎn)物克隆及序列分析GAPDH、IGF-1和GH基因RT-PCR產(chǎn)物應(yīng)用天根生化科技(北京)有限公司膠回收試劑盒進(jìn)行純化，按照寶生物工程(大連)有限公司pMD18-T Vector Cloning Kit操作說(shuō)明將目的基因與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑選單個(gè)白色菌落進(jìn)行PCR鑒定，陽(yáng)性重組質(zhì)粒的菌液送上海立菲生物技術(shù)有限公司測(cè)序，測(cè)序后的序列應(yīng)用DNAMAN6.0軟件和BLAST進(jìn)行同源性分析。

1.4.6IGF-1和GH基因熒光定量分析 通過(guò)測(cè)序分析驗(yàn)證引物擴(kuò)增片段為目的基因片段，應(yīng)用FastStar DNA Master SYBR Green I試劑盒對(duì)各組綿羊皮膚組織cDNA進(jìn)行IGF-1和GH基因的熒光定量分析。將含有GAPDH、IGF-1和GH基因片段的質(zhì)粒用雙蒸水以10倍梯度連續(xù)稀釋，即100、101、102、103，得到熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)基因4個(gè)梯度，制作熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。

熒光定量PCR反應(yīng)體系為20 μL，其組成為2 μL RT產(chǎn)物，2.4 μL MgCl2(3 mmol·L-1)，目的基因引物(10 μmol·L-1)各1 μL，2 μL FastStar DNA Master SYBR Green I(10×)，補(bǔ)加ddH2O至終體積。反應(yīng)程序：95 ℃ 預(yù)變性10 min；95 ℃ 變性10 s，退火溫度退火10 s，72 ℃ 延伸10 s，45個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸5 min。熔解曲線用于檢驗(yàn)擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，其反應(yīng)程序：95 ℃ 0 s；65 ℃ 15 s；95 ℃ 0 s(溫度變化速率為0.1 ℃·s-1)。5個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組3只羔羊的所有樣品進(jìn)行3次平行檢測(cè)，并在每批次熒光定量PCR反應(yīng)時(shí)設(shè)陰性對(duì)照，記錄各樣品的Ct值。

1.4.7 數(shù)據(jù)分析 采用2-△△Ct方法[10]分析GH和IGF-1基因相對(duì)表達(dá)量，應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析各試驗(yàn)組羔羊的平均日增重、GH和IGF-1基因相對(duì)表達(dá)量及外周血中GH和IGF-1濃度數(shù)據(jù)。采用數(shù)學(xué)模型：yij=μy+αi+β(xij-μx)+eij進(jìn)行單因素協(xié)方差分析，其中，αi為第i種飼料蛋白含量固定效應(yīng)，xij為個(gè)體體重，μy為基因相對(duì)表達(dá)量均值或濃度均值；μx為體重均值；β為y隨x變化的回歸系數(shù)；eij為隨機(jī)誤差。各飼養(yǎng)階段的羔羊平均日增重、基因相對(duì)表達(dá)量及濃度均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，并用Duncan對(duì)各組平均數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 不同蛋白質(zhì)水平日糧對(duì)綿羊平均日增重的影響

從表3結(jié)果可見(jiàn)，整個(gè)飼養(yǎng)期間，3個(gè)試驗(yàn)組羔羊隨著飼養(yǎng)天數(shù)的增加體重增加，低蛋白組、中蛋白組和高蛋白組平均日增重依次187.50、220.83和251.33 g·d-1，60～120 d高蛋白組羔羊平均體重顯著高于低蛋白組(P<0.05)，0～120 d高蛋白組平均日增重顯著高于低蛋白組63.83 g·d-1(P<0.05)，料肉比優(yōu)于低蛋白組，雖然3組間料肉比無(wú)顯著差異，但高蛋白組較低蛋白組更具有潛在的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。飼養(yǎng)期間羔羊增重所消耗的飼料總量即料肉比以高蛋白組最低，中蛋白組次之，低蛋白組最高，表明日糧蛋白水平越高，羔羊的增重越快，飼料報(bào)酬越高。說(shuō)明日糧中蛋白水平能夠影響羔羊增重效果，供給合適的高蛋白水平日糧可促進(jìn)羔羊快速生長(zhǎng)。

2.2 不同蛋白質(zhì)水平日糧對(duì)綿羊外周血中IGF-1和GH含量的影響2.2.1 不同蛋白質(zhì)水平日糧對(duì)綿羊外周血中IGF-1含量的影響 經(jīng)ELISA檢測(cè)分析，綿羊外周血中IGF-1濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=-0.494 4x+3.094 5，R2=0.972 6)的相關(guān)系數(shù)R2大于0.97，結(jié)果良好，可以進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。單因素協(xié)方差分析可見(jiàn)(表4)，整個(gè)飼養(yǎng)期間，各試驗(yàn)組均以飼養(yǎng)0 d時(shí)水平為基線(P>0.05)，低蛋白組IGF-1含量在飼養(yǎng)0～90 d呈下降趨勢(shì)，但在飼養(yǎng)120 d表現(xiàn)上升趨勢(shì)，總體水平較0 d時(shí)含量下降；中蛋白組IGF-1含量在飼養(yǎng)0～120 d呈上升趨勢(shì)；高蛋白組IGF-1含量在飼養(yǎng)30 d上升較快，之后變化波動(dòng)較小，呈平穩(wěn)上升趨勢(shì)。各試驗(yàn)組羔羊外周血中IGF-1在0 d時(shí)含量均無(wú)顯著差異(P>0.05)；60～120 d高蛋白組IGF-1含量均顯著高于低蛋白組(P<0.05)，2組與中蛋白組差異均不顯著(P>0.05)，與羔羊0～120 d的生長(zhǎng)發(fā)育一致。說(shuō)明綿羊生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，日糧蛋白水平和外周血中IGF-1含量呈正相關(guān)，隨著蛋白水平的增加，外周血中IGF-1含量也相應(yīng)增加。

2.2.2 不同蛋白質(zhì)水平日糧對(duì)綿羊外周血中GH含量的影響 經(jīng)ELISA檢測(cè)分析，綿羊外周血中GH濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=-0.428 5x+2.668 2，R2=0.991 3)的相關(guān)系數(shù)R2大于0.99，結(jié)果良好，可以進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。單因素協(xié)方差分析可見(jiàn)(表4)，整個(gè)飼養(yǎng)期間，各試驗(yàn)組均以飼養(yǎng)0 d時(shí)水平為基線(P>0.05)，低蛋白組GH含量在飼養(yǎng)0～120 d呈平穩(wěn)上升趨勢(shì)；中蛋白組GH含量在飼養(yǎng)0～120 d 呈下降趨勢(shì)；高蛋白組GH含量以飼養(yǎng)0 d時(shí)水平最高，為1.59 ng·mL-1，飼養(yǎng)期間GH含量呈下降趨勢(shì)。在飼養(yǎng)60 d時(shí)，低蛋白組GH含量達(dá)到最高，為2.48 ng·mL-1，中蛋白組和高蛋白組GH最高含量為飼養(yǎng)0 d時(shí)含量，即1.74和1.59 ng·mL-1；飼養(yǎng)90 d的低蛋白組GH含量顯著高于高蛋白組(P<0.05)；飼養(yǎng)120 d的低蛋白組GH含量顯著高于中蛋白組和高蛋白組(P<0.05)。說(shuō)明綿羊生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，日糧蛋白水平和外周血中GH含量呈負(fù)相關(guān)，隨著蛋白水平的增加，外周血中GH含量降低。

表3 不同蛋白水平條件綿羊平均日增重、料肉比的變化分析

Table 3 The analysis of average daily gain and efficiency feed utilization under different protein levels

指標(biāo)Index低蛋白組Lowproteingroup中蛋白組Mediumproteingroup高蛋白組Highproteingroup始重/kgInitialweight33.75±2.2733.42±2.4833.78±1.9930d體重/kg30dweight37.15±1.0937.96±1.1438.17±2.1860d體重/kg60dweight42.95±1.58a44.32±1.73ab46.32±1.68b90d體重/kg90dweight49.67±1.49a52.75±2.21ab55.36±2.15b120d體重/kg120dweight56.25±1.67a59.92±1.34ab63.94±1.97b120d平均日增重/(g·d-1)120daveragedailygain187.50±16.88a220.83±13.52ab251.33±9.30b料肉比①Efficiencyfeedutilization①9.20±2.037.84±2.127.14±1.34

同行不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下表同。①.飼料為TMR混合日糧

Values with different lowercase letter in the same row indicate significant difference(P<0.05).The same as below.①.Feed for the total mixed ration

表4 不同蛋白質(zhì)水平條件下IGF-1和GH的含量變化

Table 4 The analysis of IGF-1 and GH concentrations change under different protein levels

ng·mL-1

2.3 不同蛋白質(zhì)水平日糧對(duì)綿羊IGF-1和GH基因表達(dá)的影響

2.3.1 RNA電泳結(jié)果 總RNA經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果(圖1)表明，28S和18S兩條帶清晰，灰度比值接近2∶1，且OD260 nm/OD280 nm比值為1.8～2.0，證明所提取的 RNA 結(jié)構(gòu)完整，可用于下一步合成cDNA。

圖1 總RNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)Fig.1 The agarose gel electrophoresis of total RNA

2.3.2 目的基因PCR擴(kuò)增結(jié)果及序列分析 以綿羊cDNA 為模板，以IGF-1、GH和GAPDH基因引物分別進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，目的基因片段的長(zhǎng)度分別為 251、119和149 bp，經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，與預(yù)期結(jié)果一致(圖2)。經(jīng)序列測(cè)定和序列分析，證明所克隆的基因分別為IGF-1、GH和GAPDH基因片段。

1～5.IGF-1基因PCR產(chǎn)物； 8～12.GH基因PCR產(chǎn)物； 13～18.GAPDH基因PCR產(chǎn)物；M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL2000；6，7，19.空白1-5.IGF-1； 8-12.GH； 13-18.GAPDH； M.DL2000 marker；6，7，19.Control圖2 綿羊IGF-1、GH和GAPDH基因的RT-PCR電泳圖Fig.2 RT-PCR of IGF-1，GH and GAPDH gene of sheep

2.3.3IGF-1和GH基因熒光定量PCR檢測(cè) 通過(guò)熔解曲線分析，發(fā)現(xiàn)IGF-1基因在90 ℃ (圖3)，GH基因在87 ℃ (圖4)，GAPDH基因在90 ℃(圖5)，均為單一峰，3個(gè)基因擴(kuò)增時(shí)均無(wú)非特異性PCR產(chǎn)物、引物二聚體和污染的存在，表明其被特異擴(kuò)增。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR，獲得了S型動(dòng)力學(xué)曲線圖。每個(gè)基因的指數(shù)擴(kuò)增期和平臺(tái)期都比較明顯，從11～32個(gè)循環(huán)均能檢測(cè)出，線性范圍較廣，擴(kuò)增曲線較理想，表明此次實(shí)時(shí)熒光定量PCR試驗(yàn)數(shù)據(jù)能夠用于目的基因的相對(duì)定量分析。

2.3.3.1IGF-1基因的相對(duì)表達(dá)量分析：經(jīng)單因素協(xié)方差分析可見(jiàn)(表5)，整個(gè)飼養(yǎng)期間，各試驗(yàn)組均以飼養(yǎng)0 d時(shí)IGF-1基因相對(duì)表達(dá)量水平為基線(P>0.05)，低蛋白組IGF-1基因相對(duì)表達(dá)量隨飼養(yǎng)天數(shù)增加而呈下降趨勢(shì)，在飼養(yǎng)90 d時(shí)其表達(dá)量維持穩(wěn)定；中蛋白組IGF-1基因相對(duì)表達(dá)量較為平穩(wěn)，總體呈上升趨勢(shì)；高蛋白組IGF-1基因相對(duì)表達(dá)量隨飼養(yǎng)天數(shù)增加呈上升趨勢(shì)。在飼養(yǎng)60和120 d時(shí)，高蛋白組IGF-1基因相對(duì)表達(dá)量顯著高于中蛋白組和低蛋白組(P<0.05)。說(shuō)明綿羊生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，日糧蛋白水平和IGF-1基因的表達(dá)量呈正相關(guān)，隨著蛋白水平的增加，IGF-1基因的表達(dá)豐度增加。

圖3 IGF-1基因的擴(kuò)增曲線與熔解曲線Fig.3 The amplification and dissociation curves of IGF-1 gene

圖4 GH基因的擴(kuò)增曲線與熔解曲線圖 Fig.4 The amplification and dissociation curves of GH gene

圖5 GAPDH基因的擴(kuò)增曲線與熔解曲線Fig.5 The amplification and dissociation curves of GAPDH gene

2.3.3.2GH基因的相對(duì)表達(dá)量分析：經(jīng)單因素協(xié)方差分析可見(jiàn)(表5)，整個(gè)飼養(yǎng)期間，各試驗(yàn)組均以飼養(yǎng)0 d時(shí)GH基因相對(duì)表達(dá)量水平為基線(P>0.05)，低蛋白組、中蛋白組和高蛋白組GH基因相對(duì)表達(dá)量較為平穩(wěn)；整個(gè)飼養(yǎng)期間3個(gè)試驗(yàn)組GH基因表達(dá)量都沒(méi)有顯著變化(P>0.05)。低蛋白組GH基因相對(duì)表達(dá)量在飼養(yǎng)120 d最高，達(dá)到1.42；中蛋白組GH基因相對(duì)表達(dá)量在飼養(yǎng)60 d最高，為1.45；而高蛋白組則以飼養(yǎng)0 d時(shí)GH基因相對(duì)表達(dá)量最高。綿羊生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，日糧蛋白水平?jīng)]有顯著影響GH基因的表達(dá)豐度。

3 討 論

近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，人們已認(rèn)識(shí)到作為外部因子的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與基因表達(dá)之間存在著廣泛的互作，這種互作是動(dòng)物體內(nèi)、外因子互作的一個(gè)重要方面。研究表明，日糧中主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如碳水化合物、蛋白質(zhì)、氨基酸和脂肪對(duì)動(dòng)物體內(nèi)許多基因，如豬生長(zhǎng)激素受體(GHR)[11]、綿羊IGF-1[12]、人IGFBP-1[13]等的表達(dá)都有影響。營(yíng)養(yǎng)與基因表達(dá)調(diào)控已成為當(dāng)今動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)的研究熱點(diǎn)之一，如何通過(guò)改變?nèi)占Z組成調(diào)節(jié)體內(nèi)相關(guān)基因的表達(dá)，從而使動(dòng)物體處于最佳生長(zhǎng)狀態(tài)已成為動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究的重點(diǎn)。

3.1 不同蛋白質(zhì)水平日糧對(duì)綿羊外周血中IGF-1和GH含量的影響

動(dòng)物生長(zhǎng)是一個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程，受營(yíng)養(yǎng)水平、遺傳、內(nèi)分泌調(diào)節(jié)、環(huán)境及飼養(yǎng)管理等眾多因素影響，其中，營(yíng)養(yǎng)水平、環(huán)境及飼養(yǎng)管理等外在因素最終是通過(guò)體內(nèi)神經(jīng)內(nèi)分泌激素的變化而影響動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育。研究證實(shí)，豬[14]和牛[15]等動(dòng)物血液中IGF-1含量與體重及增重呈正相關(guān)。李光玉等[16]報(bào)道日糧中消化蛋白質(zhì)與梅花鹿和東北馬鹿外周血中IGF-1 含量呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，與血清GH濃度無(wú)顯著相關(guān)(P>0.05)；張勇等[17]也指出日糧中蛋白質(zhì)水平的提高能夠增加豬血液中IGF-1的含量。當(dāng)營(yíng)養(yǎng)不良時(shí)，導(dǎo)致血液中GH分泌增加，肝中生長(zhǎng)激素受體(GHR)和血液IGF-1的含量降低[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，中蛋白組和高蛋白組IGF-1含量及日增重隨日齡增加而表現(xiàn)上升趨勢(shì)，但高蛋白組IGF-1含量和平均日增重要高于中蛋白組，差異不顯著(P>0.05)；低蛋白組0～120 d平均日增重則低于高蛋白組(P<0.05)和中蛋白組，且IGF-1含量表現(xiàn)出降低趨勢(shì)。在0～120 d飼養(yǎng)期，外周血中IGF-1含量變化趨勢(shì)與羔羊的生長(zhǎng)發(fā)育趨勢(shì)一致。研究結(jié)果與J.M.Pell等[12]結(jié)論一致，證明了日糧蛋白水平和綿羊外周血中IGF-1含量呈正相關(guān)，日糧蛋白水平的增加，導(dǎo)致外周血中IGF-1含量也相應(yīng)增加。

表5 不同蛋白水平IGF-1和GH基因表達(dá)量變化

Table 5 The relative express analysis ofIGF-1 andGHgenes under different protein levels

基因Gene飼養(yǎng)天數(shù)/dDay低蛋白組Lowproteingroup中蛋白組Mediumproteingroup高蛋白組HighproteingroupIGF-101.83±0.331.65±0.341.71±0.33301.77±0.251.71±0.262.56±0.25601.67±0.21a1.69±0.22a2.59±0.22b901.61±0.371.78±0.392.54±0.371201.61±0.07a1.72±0.07a2.45±0.07bGH01.37±0.111.29±0.111.38±0.11301.39±0.161.30±0.171.33±0.16601.38±0.111.45±0.121.23±0.11901.37±0.061.33±0.061.28±0.061201.42±0.091.30±0.091.27±0.09

研究表明，動(dòng)物的促生長(zhǎng)效應(yīng)主要依賴 GH 刺激產(chǎn)生IGF-1，IGF-1再作用于靶細(xì)胞而發(fā)揮作用。而GH的合成與分泌受生長(zhǎng)激素釋放激素(GHRH)和生長(zhǎng)激素釋放抑制激素(SS)的雙重控制，GHRH 除促進(jìn)分泌GH 外，還可以增加細(xì)胞內(nèi)的mRNA；SS能抑制GHRH 的合成產(chǎn)生，與GHRH 共同調(diào)節(jié)GH。J.N.Mao等[19]試驗(yàn)證明生長(zhǎng)速度慢的肉雞，其血液中GH含量較生長(zhǎng)速度快的要高。P.J.Godowski等[20]證明患有Laron型侏儒癥的病人，其血液中GH水平要高于正常人，但比正常人的IGF-1水平要低。趙茹茜等[21]也在伴性侏儒雞上發(fā)現(xiàn)類似的情況。本研究證明，綿羊生長(zhǎng)發(fā)育中，日糧蛋白水平和外周血中GH含量呈負(fù)相關(guān)，蛋白水平的增加導(dǎo)致外周血中GH含量降低。針對(duì)綿羊的研究結(jié)果與雞和哺乳動(dòng)物的結(jié)論相同，營(yíng)養(yǎng)狀況影響外周血中IGF-1和GH濃度，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)不良導(dǎo)致的生長(zhǎng)受阻，其血液中GH水平往往是升高而并非下降，而血液中IGF-1含量降低。

從本試驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，IGF-1和GH含量在各個(gè)飼養(yǎng)階段表現(xiàn)出負(fù)反饋調(diào)節(jié)，在高蛋白組和低蛋白組尤其明顯，這也說(shuō)明羔羊在應(yīng)對(duì)各種不同蛋白水平的應(yīng)激時(shí)，垂體中GH會(huì)刺激肝臟中IGF-1的合成和分泌，隨后擴(kuò)散到機(jī)體各個(gè)組織中，其通過(guò)抑制肝糖釋出，增加葡萄糖攝取和轉(zhuǎn)化，抑制脂肪分解，促進(jìn)脂質(zhì)和糖原及蛋白質(zhì)的合成而調(diào)節(jié)羔羊的生長(zhǎng)。與中蛋白組相比，高蛋白組羔羊IGF-1含量增加，其GH合成和分泌就會(huì)受到抑制，從而形成一個(gè)負(fù)反饋調(diào)節(jié)回路[22]，使動(dòng)物的生理水平維持在一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)。盡管GH控制著IGF-1的水平，但血液中IGF-1的水平也受其他因素的調(diào)控，如甲狀腺和胰島素等激素也能夠調(diào)節(jié)GH的合成，從而調(diào)節(jié)IGF-1的分泌。同時(shí)，機(jī)體組織本身也可以產(chǎn)生IGF-1，或IGF-1可通過(guò)自分泌以一種局部生長(zhǎng)因子促進(jìn)細(xì)胞增殖，增加動(dòng)物體重[23]。

3.2 不同蛋白質(zhì)水平日糧對(duì)綿羊IGF-1和GH基因表達(dá)的影響

動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育是由多個(gè)基因控制、整合的一個(gè)極其復(fù)雜的生理調(diào)節(jié)過(guò)程。營(yíng)養(yǎng)對(duì)基因表達(dá)主要是通過(guò)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的成分和攝入量影響蛋白質(zhì)合成來(lái)進(jìn)行調(diào)控；其次是基因表達(dá)后其能夠?qū)?dòng)物代謝產(chǎn)生作用，重新分配動(dòng)物生長(zhǎng)需要的物質(zhì)。一般認(rèn)為營(yíng)養(yǎng)不良時(shí)，因肝中GH受體基因表達(dá)豐度的下降致使IGF-1基因的表達(dá)下降，但蛋白質(zhì)和能量的作用機(jī)制有所不同。J.M.Brameld等[24]認(rèn)為，蛋白質(zhì)對(duì)IGF-1基因的表達(dá)主要以氨基酸的形式調(diào)控，而能量則主要以葡萄糖的形式調(diào)控GH受體基因的表達(dá)，進(jìn)而影響IGF-1基因的表達(dá)。

不同學(xué)者先后報(bào)道，用低蛋白質(zhì)或無(wú)蛋白質(zhì)的日糧飼喂小鼠，其肝中IGF-1 mRNA 的表達(dá)量呈明顯的下降趨勢(shì)[25-26]。此外，在蛋白質(zhì)和能量比例不同的日糧下，綿羊肝IGF-1 mRNA 的表達(dá)量也存在同樣的結(jié)果，表明IGF-I基因的轉(zhuǎn)錄水平與營(yíng)養(yǎng)不良密切相關(guān)[27]。研究表明，豬的IGF-1 mRNA的表達(dá)量在豬脂肪組織中隨著蛋白質(zhì)水平的升高而增加，營(yíng)養(yǎng)不良直接抑制IGF-1基因表達(dá)，其主要原因是GH作用受阻[11]。本研究通過(guò)熒光定量PCR分析GH和IGF-1基因的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果表明，日糧中蛋白質(zhì)水平對(duì)IGF-1 mRNA 表達(dá)量存在顯著的影響，其中低蛋白組IGF-1 mRNA表達(dá)量較試驗(yàn)的飼養(yǎng)0 d時(shí)IGF-1表達(dá)量水平有所下降，在60和120 d低蛋白組與中蛋白組的IGF-1表達(dá)量均顯著低于高蛋白組(P<0.05)，這也預(yù)示著羔羊營(yíng)養(yǎng)供給匱乏時(shí)，生長(zhǎng)發(fā)育受到限制，隨著日糧蛋白質(zhì)水平的降低，綿羊IGF-1 mRNA表達(dá)呈下降趨勢(shì)，該規(guī)律與劉景云等[28]和張玲等[29]的研究結(jié)果相同，同樣，當(dāng)日糧中蛋白質(zhì)水平增加時(shí)，IGF-1 mRNA表達(dá)有上升的趨勢(shì)。

GH基因表達(dá)受到生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因的雙向調(diào)控。趙茹茜等[30]報(bào)道，蛋雞cGHmRNA隨營(yíng)養(yǎng)限制其表達(dá)量升高，相反，過(guò)度攝取營(yíng)養(yǎng)則cGHmRNA表現(xiàn)下降。周其偉等[31]研究表明，羔羊GHRHR基因表達(dá)可能影響GH基因表達(dá)，且GHmRNA基因有先升高再下降的表達(dá)變化模式。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)低蛋白組GHmRNA基因表達(dá)量高于高蛋白組，但差異不顯著(P>0.05)，與趙茹茜等[30]結(jié)論一致。針對(duì)綿羊不同飼養(yǎng)階段GHmRNA表達(dá)規(guī)律，低蛋白組GHmRNA表達(dá)呈上升趨勢(shì)，高蛋白組則呈下降趨勢(shì)，該結(jié)論與R.Q.Zhao等[32]在雞研究中的結(jié)果一致。眾所周知，GH首先與細(xì)胞表面特異性受體(GHR)結(jié)合形成配體受體復(fù)合物，再由受體介導(dǎo)激發(fā)一系列生化反應(yīng)，最終啟動(dòng)GH的目標(biāo)基因(IGF-1)轉(zhuǎn)錄；而外周血中GH分泌和合成受GHRH和SS的調(diào)節(jié)，GHRH、SS和GHR調(diào)控作用在生長(zhǎng)發(fā)育中可能并不協(xié)同，是導(dǎo)致本試驗(yàn)中綿羊外周血中GH分泌和皮膚組織中該基因的表達(dá)存在差異的原因之一。此外由于GHmRNA的表達(dá)依賴于其受體的表達(dá)，但這是否引起羔羊GH受體的表達(dá)變化，或者是調(diào)控采食的相關(guān)基因以及內(nèi)分泌系統(tǒng)與基因表達(dá)間的相互作用有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

低蛋白質(zhì)日糧減緩綿羊生長(zhǎng)發(fā)育，促進(jìn)GH分泌，減少IGF-1分泌，下調(diào)IGF-1基因表達(dá)豐度；高蛋白質(zhì)日糧促進(jìn)綿羊生長(zhǎng)發(fā)育，降低GH分泌，增加IGF-1分泌，上調(diào)IGF-1基因表達(dá)豐度。

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(編輯 郭云雁)

Effects of Different Dietary Protein Levels on the Secretion and mRNA Expression of IGF-1 and GH in Sheep

YAN Yun-feng1,2，YANG Hua1*，YANG Yong-lin1，PAN Xiao-liang2， ZOU Yun-long3

(1.TheBreed&BiotechnologyKeyLaboratoryofSheepinBingtuan，XinjiangAcademyofAgriculturalandReclamationSciences，Shihezi832000，China； 2.CollegeofAnimalScienceandTechnology，ShiheziUniversity，Shihezi832001，China； 3.LifeScienceandEngineeringCollegeofNorthwestUniversityforNationalities，Lanzhou730000，China)

The objective of this study was to discuss the effects of different dietary protein levels on insulin-like growth factor-1(IGF-1) and growth hormone(GH) secretion and mRNA expression in sheep，to provide a theoretical basis for scientific preparation of feed and study the growth in sheep.Eighteen 6-month-old prolific Suffolk rams were randomly allocated into 3 treatments with different dietary protein levels(low protein，medium protein and high protein).The concentrations in peripheral blood and mRNA expression levels in skin of IGF-1 and GH were detected at different growth stages(30，60，90 and 120 d) with different dietary protein levels by ELISA and SYBR Green Real-time PCR methods.The results showed that the average daily gain，the concentrations of IGF-1 and GH in peripheral blood，the mRNA expression ofIGF-1 in skin were significantly affected by dietary protein levels.However，mRNA expression ofGHgene did not change significantly.With the increased protein intake，the growth of sheep was faster，the concentration of IGF-1 was increased，but the concentration of GH was decreased in peripheral blood，mRNA expression ofIGF-1 gene was up-regulated.

sheep；protein levels；IGF-1；GH；secretion；gene expression

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.01.011

2014-05-05

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31360541)；兵團(tuán)博士資金專項(xiàng)(2011BB015)；兵團(tuán)農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)項(xiàng)目(2011BA006)

閆云峰(1986-)，男，河北張家口人，碩士生，主要從事動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)調(diào)控研究，E-mail:xjnkyxms@126.com

*通信作者：楊 華，副研究員，E-mail：yhxjcn@sina.com

S826；S816.4

A

0366-6964(2015)01-0085-11