訾 臣，夏日煒，殷學(xué)梅，喻禮懷，朱國(guó)強(qiáng)，吳圣龍*，包文斌*

(1.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇省動(dòng)物遺傳繁育與分子設(shè)計(jì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州 225009；2.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，揚(yáng)州 225009)

豬MyD88基因干擾重組慢病毒載體的構(gòu)建、病毒包裝及效果評(píng)價(jià)

訾 臣1，夏日煒1，殷學(xué)梅1，喻禮懷1，朱國(guó)強(qiáng)2，吳圣龍1*，包文斌1*

(1.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇省動(dòng)物遺傳繁育與分子設(shè)計(jì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州 225009；2.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，揚(yáng)州 225009)

髓性分化因子88 (MyD88) 作為T(mén)LRs/IL-1R信號(hào)通路中重要的接頭蛋白，在免疫應(yīng)答和疾病防御中起重要作用，作者擬通過(guò)慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)獲得MyD88基因沉默的豬小腸上皮細(xì)胞，為致病菌引起腸道疾病機(jī)制研究提供有效模型。共構(gòu)建4個(gè)靶向豬MyD88基因的shRNA表達(dá)載體和1個(gè)MyD88基因高表達(dá)載體，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法鑒定瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞中MyD88基因轉(zhuǎn)錄水平，篩選獲得干擾豬MyD88基因效率最高的shRNA表達(dá)載體，將其包裝成慢病毒載體，用于建立MyD88基因穩(wěn)定沉默的豬小腸上皮細(xì)胞。最終成功獲得MyD88基因沉默效率達(dá)到69.3%的小腸上皮細(xì)胞，達(dá)到基因功能分析的要求。MyD88基因穩(wěn)定沉默豬腸上皮細(xì)胞的獲得，為豬腸道病原微生物所引起的TLRs/IL-1R信號(hào)通路作用機(jī)制的研究提供了寶貴材料。

豬；MyD88基因；基因沉默；慢病毒載體

髓性分化因子88 (myeloid differentiation protein 88，MyD88) 是TLRs/IL-1R (Toll-like receptors /interleukin-1 receptor) 信號(hào)通路中重要的接頭蛋白，其本質(zhì)是一種細(xì)胞質(zhì)的可溶性蛋白質(zhì)，包含N 端的死亡結(jié)構(gòu)域 (death domain，DD) 和 C 端的TIR結(jié)構(gòu)域 (Toll/interleukin-1 receptor domain)[1]。其TIR結(jié)構(gòu)域與TLRs和IL-1R的TIR 結(jié)構(gòu)域結(jié)合后激活I(lǐng)RAK-1/4 (interleukin receptor associated kinase) 和TRAF-6 (TNF receptor associated factor 6)，最終活化NF-κB (nuclear factor kappa B) 從而激發(fā)促炎因子和多種細(xì)胞介質(zhì)的釋放，并活化淋巴細(xì)胞加速炎癥反應(yīng)蛋白的合成[2-6]。TIR結(jié)構(gòu)域在MyD88信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起到關(guān)鍵作用，MyD88 通過(guò)其C 端的 TIR 結(jié)構(gòu)域與膜受體的 TIR結(jié)構(gòu)域作用，向下游傳遞信號(hào)，且MyD88 所參與的不同受體活化信號(hào)在下游傳遞中基本相似。除了 TLR3 之外，TLRs家族所有成員均可以通過(guò) MyD88 依賴(lài)途徑介導(dǎo)下游信號(hào)傳導(dǎo)。

豬MyD88基因位于豬第13號(hào)染色體，編碼293個(gè)氨基酸的序列，與人相比相似性達(dá)到87%～88%，其在各組織中廣泛表達(dá)，特別是在免疫組織和腸道組織中高表達(dá)[7-8]。這種表達(dá)規(guī)律與MyD88的功能以及TLRs/IL-1R信號(hào)通路在豬腸道中免疫反應(yīng)及感染防御中的重要作用有關(guān)。種類(lèi)繁多和數(shù)量龐大的腸道微生物與消化食糜及腸道組織共同組成一個(gè)復(fù)雜環(huán)境，病原菌侵入和腸道菌群失衡都可能造成腸道疾病的發(fā)生，如產(chǎn)腸毒素大腸桿菌就是在仔豬斷奶時(shí)引起腹瀉和水腫病的主要病原菌。因此對(duì)MyD88基因功能的研究有利于解釋其在豬腸道疾病發(fā)生及免疫調(diào)控中的作用機(jī)制，而腸上皮細(xì)胞系作為體外水平研究基因功能的有效模型，可用于模擬MyD88基因在腸道中的免疫調(diào)控作用。在國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究中，尚未見(jiàn)關(guān)于靶向豬MyD88基因的shRNA表達(dá)載體或者敲除的研究報(bào)道。鑒于MyD88基因在豬腸道抵御病原感染調(diào)控中的重要作用，本試驗(yàn)首次通過(guò)構(gòu)建靶向豬MyD88基因的shRNA表達(dá)載體，篩選高效的干擾序列并包裝成慢病毒載體，以豬腸上皮細(xì)胞系(IPEC-J2)為素材，獲得穩(wěn)定沉默MyD88基因的豬腸上皮細(xì)胞，為MyD88的功能以及TLRs/IL-1R信號(hào)通路在豬腸道免疫應(yīng)答和抗病原的作用機(jī)制研究提供寶貴的試驗(yàn)材料。

1 材料與方法

1.1 材料

干擾載體pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR、pMD-18T、pcDNA3.1(+)、pDONR 221、pLenti6.3/V5-DEST載體、載體構(gòu)建試劑盒BLOCK-iTTMPol II miR RNAi Expression Vector Kit with EmGFP、Packaging Mix、T4 DNA連接酶、高純度質(zhì)粒提取試劑盒、脂質(zhì)體2000、Trizol均購(gòu)自Invitrogen公司(美國(guó))；克隆宿主菌大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存，IPEC-J2小腸上皮細(xì)胞系由美國(guó)賓夕法尼亞大學(xué)惠贈(zèng)；胎牛血清、DMEM和Opti-MEM培養(yǎng)基均購(gòu)自Gibco公司(美國(guó))；SYBR premix ExTaq購(gòu)自TaKaRa公司(中國(guó)，大連)。

1.2 引物設(shè)計(jì)及序列合成

根據(jù)MyD88基因編碼序列(NM_001099923.1)設(shè)計(jì)4個(gè)針對(duì)MyD88基因的干擾序列，序列情況見(jiàn)表1；設(shè)計(jì)MyD88編碼區(qū)克隆PCR引物，見(jiàn)表2；設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物，見(jiàn)表3。

1.3 干擾載體構(gòu)建

將合成序列的Oligo DNA序列通過(guò)退火處理，克隆入pcDNA6.2-GW/EmGFP載體。方法如下：將5對(duì)Oligo各自退火成雙鏈，正反單鏈各5 μL (100 μmol·L-1)，退火緩沖液 (10×) 2 μL，雙蒸水8 μL，置于95 ℃加熱5 min，然后放置室溫自然冷卻20 min，形成雙鏈。4 μL雙鏈DNA (10 nmol·L-1)，2 μL pcDNA6.2-GW/EmGFP (100 ng·μL-1)，1 μL T4 DNA連接酶 (1 U·μL-1)，4 μL連接緩沖液 (5×)，9 μL雙蒸水，室溫連接處理30 min。連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，從含大觀霉素固體培養(yǎng)板上挑取多個(gè)單克隆提取質(zhì)粒并進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證序列連接正確后，抽提高純度質(zhì)粒備用。

表1 shRNA 寡聚單鏈DNA序列

Table 1 The single-strand DNA sequence of shRNAs

名稱(chēng)Nameoligo序列(5'-3')Sequenceoftheoligo(5'-3')1FTGCTGttcggcagtcctcttcaatgcGTTTTGGCCACTGACTGACgcattgaaggactgccgaa1RCCTGttcggcagtccttcaatgcGTCAGTCAGTGGCCAAAACgcattgaagaggactgccgaaC2FTGCTGaagggatgctgctatctacagGTTTTGGCCACTGACTGACctgtagatcagcatccctt2RCCTGaagggatgctgatctacagGTCAGTCAGTGGCCAAAACctgtagatagcagcatcccttC3FTGCTGatctcggtcagacacacataaGTTTTGGCCACTGACTGACttatgtgtctgaccgagat3RCCTGatctcggtcagacacataaGTCAGTCAGTGGCCAAAACttatgtgtgtctgaccgagatC4FTGCTGtaacagggatcagtcgtttctGTTTTGGCCACTGACTGACagaaacgagatccctgtta4RCCTGtaacagggatctcgtttctGTCAGTCAGTGGCCAAAACagaaacgactgatccctgttaCN-FTGCTGaaatgtactgcgcgtggagacGTTTTGGCCACTGACTGACgtctccacgcagtacatttN-RCCTGaaatgtactgcgtggagacGTCAGTCAGTGGCCAAAACgtctccacgcgcagtacatttC

斜體部分為引入酶切位點(diǎn)，小寫(xiě)字母部分為干擾序列及其互補(bǔ)序列，下劃線部分為loop序列

The italic is the introduced enzyme loci，the lowercase is the interference sequence and complementary sequence，and underline represents the loop sequence

表2MyD88編碼區(qū)克隆PCR引物

Table 2 The PCR primers for coding area ofMyD88 gene

引物名稱(chēng)Nameoftheprimer引物核苷酸序列(5'-3')Nucleotidesequenceoftheprimer(5'-3')MyD88-FCCATGGCTGCAGGAGGCMyD88-RGCAGTTCAGGGCAGGGATAG

表3 檢測(cè)MyD88轉(zhuǎn)錄水平的實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物

Table 3 The Real-time PCR primers for transcription ofMyD88 gene

引物名稱(chēng)Nameoftheprimer引物核苷酸序列(5'-3')Nucleotidesequenceoftheprimer(5'-3')MyD88-FGTGCCGTCGGATGGTAGTMyD88-RCAGTGATGAACCGCAGGATGAPDH-FGAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAPDH-RCGCTCCTGGAAGATGGTGAT

1.4 表達(dá)載體構(gòu)建

MyD88基因克隆入pMD-18T載體，測(cè)序驗(yàn)證序列正確后用BamHⅠ/EcoRⅠ各1 μL，5 μL 10×buffer，5 μL TA克隆質(zhì)粒，38 μL雙蒸水，37 ℃酶切2 h。pcDNA3.1(+)質(zhì)粒進(jìn)行相同酶切處理，瓊脂糖凝膠電泳并回收酶切的目的片段。用T4 DNA 連接酶連接回收的片段與載體，0.5 μL T4 DNA連接酶，2 μL回收片段，1 μL線性載體，1 μL連接緩沖液 (10×)，5.5 μL雙蒸水，室溫連接2 h。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，從含氨芐青霉素培養(yǎng)板上挑取多個(gè)單克隆提取質(zhì)粒，并進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證連接序列及方向正確后，搖菌并抽提高純度質(zhì)粒備用。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及干擾效率驗(yàn)證

將干擾載體和高表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞進(jìn)行干擾效果評(píng)價(jià)，挑選干擾效果最好的載體。六孔板中DMEM (10%胎牛血清)培養(yǎng)HEK293細(xì)胞覆蓋率至80%左右時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染；用無(wú)血清Opti-MEM輕洗細(xì)胞2次，加入1.5 mL Opti-MEM；分別用250 μL Opti-MEM稀釋4個(gè)干擾質(zhì)粒以及陰性對(duì)照質(zhì)粒各3 μg，輕輕混勻后各加入1 μg高表達(dá)質(zhì)粒載體；用250 μL Opti-MEM稀釋10 μL 脂質(zhì)體2000試劑，輕輕混勻，室溫孵育5 min；將兩種稀釋液輕輕混合，室溫放置20 min；將每管500 μL脂質(zhì)體-質(zhì)粒復(fù)合物慢慢加入到各細(xì)胞孔中，輕輕混勻；每個(gè)處理重復(fù)3孔。37 ℃，5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后，換不含抗生素完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)過(guò)夜觀察熒光表達(dá)情況。

細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染48 h后，提取總RNA。按照TaKaRa試劑盒說(shuō)明進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，檢測(cè)細(xì)胞中目的基因的干擾情況，干擾效率為1-2-ΔΔCt。

1.6 慢病毒載體包裝及滴度測(cè)定

利用Gateway重組技術(shù)將挑選干擾效果最好的載體重組克隆到慢病毒載體；并利用293T細(xì)胞進(jìn)行慢病毒的包裝；將病毒原液濃縮，并測(cè)定病毒滴度。

EagⅠ線性化處理干擾質(zhì)粒，純化收集酶切產(chǎn)物。通過(guò)BP重組系統(tǒng)將干擾序列重組到pDONR 221載體，繼而通過(guò)LR重組系統(tǒng)將干擾序列重組到pLenti6.3/V5-DEST載體中。轉(zhuǎn)化挑取克隆，測(cè)序正確重組質(zhì)?？寺∶麨閜Lenti-MyD88-shRNA，進(jìn)行大量箘液培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒。

9 μg Packaging Mix (pLP1，pLP2，pLP/VSVG) 和3 μg pLenti-MyD88-shRNA質(zhì)粒加入1.5 mL Opti-MEM，取36 μL 脂質(zhì)體2000 加入1.5 mL Opti-MEM，室溫靜置5 min，輕輕將兩者混合，室溫放置20 min。293T細(xì)胞的10 cm培養(yǎng)皿換5 mL Opti-MEM，將3 mL混合液加入培養(yǎng)皿中。37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，6 h后換DMEM (10%胎牛血清) 完全培養(yǎng)液。48 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，3 000 r·min-1離心10 min，去除細(xì)胞和碎片，并用0.45 μm的濾器過(guò)濾；將病毒原液在50 000 g下超速離心2 h，去除上清，重懸于opti-MEM培養(yǎng)液中。

用含8 μg·mL-1Polybrene、2% FBS的DMEM培養(yǎng)液，按10倍梯度稀釋病毒液，每梯度各取100 μL加入培養(yǎng)有293T細(xì)胞的96孔板，每梯度3個(gè)重復(fù)孔。24 h后，在熒光顯微鏡下觀察各孔中熒光細(xì)胞數(shù)量，病毒滴度為各孔中表達(dá)熒光的細(xì)胞數(shù)平均數(shù)除以每孔中含有的慢病毒液體積。

1.7 病毒液感染豬小腸上皮細(xì)胞

取滴度為1×108TU·mL-1的pLenti-MyD88-shRNA及陰性對(duì)照病毒液10 μL，分別加入指數(shù)生長(zhǎng)期IPEC-J2細(xì)胞12孔板中，24 h后觀察熒光情況，并于36 h收集總RNA；檢測(cè)MyD88相對(duì)轉(zhuǎn)錄情況，并計(jì)算干擾效率。

2 結(jié) 果

2.1 載體構(gòu)建

通過(guò)對(duì)所挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，最終獲得連接正確的4個(gè)干擾和1個(gè)陰性質(zhì)粒載體，分別命名為pcDNA6.2-GW/EmGFP-shRNA-1、pcDNA6.2-GW/EmGFP-shRNA-2、pcDNA6.2-GW/EmGFP-shRNA-3、pcDNA6.2-GW/EmGFP-shRNA-4，pcDNA6.2-GW/EmGFP-shRNA-NC，測(cè)序圖譜見(jiàn)圖1；以及1個(gè)MyD88高表達(dá)載體，命名為pcDNA3.1-MyD88。

2.2 干擾效率驗(yàn)證

通過(guò)干擾載體與高表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)MyD88基因轉(zhuǎn)錄水平，由圖2可知，1號(hào)干擾載體處理的293細(xì)胞中豬MyD88基因相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平為0.36，干擾效率為0.64，即pcDNA6.2-GW/EmGFP-shRNA-1干擾效率最高，用于慢病毒包裝。

2.3 慢病毒液滴度測(cè)定

包裝載體和慢病毒載體pLenti-MyD88-shRNA共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，24 h后熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光，見(jiàn)圖3P，說(shuō)明包裝成功，可用于病毒液收集及濃縮處理。

病毒液梯度稀釋后用于病毒滴度檢測(cè)，pLenti-MyD88-shRNA病毒顆粒感染細(xì)胞24 h后各孔的熒光情況見(jiàn)圖3，圖中A～E的處理分別加入濃縮病毒液量為2×10-3、2×10-4、2×10-5、2×10-6、2×10-7·mL-1。每個(gè)處理孔均可觀察到發(fā)綠色熒光的細(xì)胞，說(shuō)明所包裝慢病毒顆粒能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)細(xì)胞的感染；且每孔發(fā)出綠色熒光細(xì)胞的數(shù)量隨病毒液梯度濃度變化呈現(xiàn)倍數(shù)差異，由此能夠判斷滴度檢測(cè)的準(zhǔn)確性，并通過(guò)E處理孔中觀察到的少量表達(dá)綠色熒光細(xì)胞進(jìn)行病毒滴度(TU·mL-1)的計(jì)算，病毒滴度的計(jì)算公式為：平均每孔熒光細(xì)胞個(gè)數(shù)/病毒液體積。(30+32+37)/3/(2×10-7) =1.65×108TU·mL-1，該滴度水平達(dá)到了細(xì)胞感染的要求。用Opti-MEM培養(yǎng)液將慢病毒液稀釋至1×108TU·mL-1，并分裝保存于-80 ℃。

2.4 干擾病毒顆粒對(duì)豬小腸上皮細(xì)胞MyD88表達(dá)的干擾效率

pLenti-MyD88-shRNA慢病毒顆粒液感染IPEC-J2細(xì)胞24 h后觀察熒光效果，由圖4可見(jiàn)熒光表達(dá)率較高，能夠用于MyD88基因表達(dá)水平檢測(cè)和干擾效率的分析。由圖5可知，pLenti-MyD88-shRNA病毒顆粒對(duì)IPEC-J2的MyD88基因的干擾效率為69.3%。與干擾效率篩選結(jié)果相近，可用于MyD88基因在腸上皮細(xì)胞中免疫相關(guān)功能分析。

1～4.pcDNA6.2-GW/EmGFP-shRNA-1、pcDNA6.2-GW/EmGFP-shRNA-2、pcDNA6.2-GW/EmGFP-shRNA-3、pcDNA6.2-GW/EmGFP-shRNA-4；NC.pcDNA6.2-GW/EmGFP-shRNA-NC。下圖同1-4.pcDNA6.2-GW/EmGFP-shRNA-1，pcDNA6.2-GW/EmGFP-shRNA-2，pcDNA6.2-GW/EmGFP-shRNA-3，pcDNA6.2-GW/EmGFP-shRNA-4；NC.pcDNA6.2-GW/EmGFP-shRNA-NC.The same as below圖1 干擾載體測(cè)序結(jié)果Fig.1 The sequencing results of interference vectors

NC和1～4依次為陰性和4個(gè)干擾質(zhì)粒載體與高表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞處理NC and 1-4，in turn，represent the 293 cells cotransfected by four interference vectors and the negative plasmid vector respectively together with MyD88 over-expression vector圖2 實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)MyD88基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平及干擾效率分析Fig.2 The mRNA level of MyD88 gene and the interference efficiency detected by Real-time PCR

P.病毒包裝共轉(zhuǎn)染24 h后熒光顯微鏡拍照(100×)； A～E.加入濃縮病毒液量分別為2×10-3、2×10-4、2×10-5、2×10-6、2×10-7 ·mL-1 (40×)P.The photo of lentivirus package by the fluorescence microscope 24 hours after cotransfection (100×)；A-E.Disposed respectively with 2×10-3，2×10-4，2×10-5，2×10-6，2×10-7 ·mL-1 concentrated virus (40×)圖3 病毒包裝及病毒滴度檢測(cè)(24 h)Fig.3 The lentivirus package and virus titer testing

圖4 pLenti-MyD88-shRNA病毒顆粒侵染IPEC-J2細(xì)胞24 h熒光效果(400×)Fig.4 The fluorescent image of IPEC-J2 cell infected by pLenti-MyD88-shRNA virus after 24 hours (400×)

圖5 pLenti-MyD88-shRNA病毒顆粒對(duì)IPEC-J2細(xì)胞MyD88基因干擾效果Fig.5 The interference efficiency of pLenti-MyD88-shRNA virus inhibiting MyD88 gene in IPEC-J2 cell

3 討 論

MyD88是作為T(mén)LRs/IL-1R信號(hào)通路中一個(gè)關(guān)鍵接頭分子，激發(fā)NF-κB構(gòu)成炎癥反應(yīng)通路，在傳遞炎癥信號(hào)和增強(qiáng)炎癥強(qiáng)度，引發(fā)腸道炎癥介質(zhì)的釋放中具有重要的作用[9]。M.Loiarro 等通過(guò)合成MyD88基因TIR結(jié)構(gòu)域的多肽模擬物，成功干擾MyD88的二聚體化作用[10]。腸道致病性大腸桿菌主要通過(guò)釋放內(nèi)毒素(LPS)引起腸道疾病的發(fā)生，TLR4是識(shí)別LPS的主要受體[11]。TLR4信號(hào)通路主要通過(guò)MyD88依賴(lài)和MyD88非依賴(lài)途徑傳導(dǎo)，對(duì)于MyD88基因的功能分析有助于解釋致病性大腸桿菌引起斷奶仔豬腹瀉和水腫病的分子機(jī)制。

研究表明，MyD88基因缺陷小鼠表現(xiàn)出對(duì)LPS刺激的抗性，而野生型個(gè)體在注射LPS后大部分死亡[12]。果蠅中MyD88的過(guò)表達(dá)能誘導(dǎo)抗菌肽的產(chǎn)生，而在MyD88基因突變體中則相反[13]。有研究表明MyD88在LPS誘導(dǎo)的STAT3磷酸化和SOCS3 表達(dá)過(guò)程中起到顯著的調(diào)控作用，且發(fā)現(xiàn)MyD88缺陷小鼠可以抵抗LPS所引起的食欲不振[14]。另外，神經(jīng)方面研究表明MyD88缺陷會(huì)造成小鼠認(rèn)知和行為障礙[15]。

隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，各種基因修飾技術(shù)應(yīng)用于基因功能分析。其中，慢病毒載體法已成熟用于轉(zhuǎn)基因細(xì)胞、胚胎和動(dòng)物個(gè)體的制備[16]。對(duì)于MyD88基因功能的研究方法主要依靠基因敲除技術(shù)獲得基因缺失型突變個(gè)體，分析其在信號(hào)通路中作用?；蚯贸?，依賴(lài)于MyD88的信號(hào)通路被中斷，免疫信號(hào)傳遞過(guò)程發(fā)生改變，雖然能突出目的基因的重要功能，但是不能分析MyD88表達(dá)水平差異所引起的免疫反應(yīng)變化。而RNAi技術(shù)(RNA interference)能在一定水平上沉默靶基因的表達(dá)，為基因不同表達(dá)水平功能分析提供可能，楊浩等通過(guò)構(gòu)建GRN基因短發(fā)夾 RNA慢病毒干擾載體感染豬前體脂肪細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GRN基因表達(dá)的降低能夠促進(jìn)豬前體脂肪細(xì)胞分化[17]；同樣，程佳等利用慢病毒介導(dǎo)shRNA干擾豬RBP4基因，發(fā)現(xiàn)RBP4基因也起著抑制豬前體脂肪細(xì)胞成脂分化的作用[18]。此外，RNAi技術(shù)還被用于抗病毒以及人類(lèi)疾病的治療研究等[19-20]。周謙君等針對(duì)豬MyD88基因設(shè)計(jì)并人工合成雙鏈siRNA分子，成功干擾豬外周血樹(shù)突狀細(xì)胞MyD88基因的表達(dá)[21]，而人工合成siRNA作用的局限在于不能實(shí)現(xiàn)靶基因的長(zhǎng)期穩(wěn)定沉默，慢病毒載體介導(dǎo)的基因整合則能實(shí)現(xiàn)外源shRNA高效穩(wěn)定表達(dá)，從而起到穩(wěn)定沉默靶基因的效果。本研究通過(guò)靶向MyD88基因設(shè)計(jì)并成功構(gòu)建了4個(gè)干擾的shRNA表達(dá)載體，通過(guò)共轉(zhuǎn)染干擾效率篩選試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)4個(gè)干擾載體均能對(duì)MyD88基因起到顯著的干擾作用，但針對(duì)不同靶點(diǎn)的序列表現(xiàn)出不同的沉默效率，其中1號(hào)干擾載體沉默效率最高。同時(shí)，成功將其包裝成慢病毒，獲得了較高滴度的慢病毒液。通過(guò)侵染IPEC-J2細(xì)胞系，沉默效率接近70%，能成功應(yīng)用于穩(wěn)定沉默MyD88基因小腸上皮細(xì)胞系的建立和靶基因功能影響的測(cè)定。

鑒于MyD88在TLRs/IL-1R信號(hào)通路發(fā)揮的重要作用，本研究成功構(gòu)建包裝了慢病毒介導(dǎo)的MyD88基因干擾載體，得到良好的侵染和干擾效果，并成功獲得MyD88基因穩(wěn)定沉默的豬腸上皮細(xì)胞，為MyD88及TLRs/IL-1R信號(hào)通路在豬腸道病原微生物感染所引起的天然免疫分子作用機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。

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(編輯 白永平)

Construction and Packaging of Recombinant Lentivirus Interference Vector Specific to PorcineMyD88 Gene and the Evaluation of the Corresponding Lentivirus

ZI Chen1，XIA Ri-wei1，YIN Xue-mei1，YU Li-huai1，ZHU Guo-qiang2，WU Sheng-long1*，BAO Wen-bin1*

(1.AnimalScienceandTechnologyCollege，YangzhouUniversity，KeyLaboratoryforAnimalGenetics，Breeding，ReproductionandMolecularDesignofJiangsuProvince，Yangzhou225009，China；2.CollegeofVeterinaryMedicine，YangzhouUniversity，Yangzhou225009，China)

Myeloid differentiation factor 88 (MyD88)，an important adaptor protein in TLRs/IL-1R signaling pathways，plays an important role in immune response and disease prevention.This study intends to obtain pig small intestinal epithelial cells in whichMyD88 gene is silent mediated by lentiviru，as an effective model for analyzing molecular mechanism of intestinal disease caused by pathogenic bacteria.In this study，four plasmid expression vectors were constructed，which coded shRNAs against pigMyD88 gene，and the over-expression vector codingMyD88 gene was also constructed.By the method of real-time fluorescent quantitative PCR，the level ofMyD88 gene in the cotransfected 293 cells was detected.The highest efficiency vector was adopted and packaged into lentiviral vector to obtain pig small intestinal epithelial cells with silentMyD88 gene.The IPEC-J2 cell was obtained in which theMyD88 mRNA expression was reduced by 69.3%，meeting the requirement for gene function analysis.The obtained pig intestinal epithelial cell with stableMyD88 gene silencing provides important material for mechanism research of TLRs/IL-1R signal pathway caused by pathogenic microorganisms in pig intestines.

pig；MyD88 gene；gene silencing；lentiviral vector

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.04.021

2014-07-28

國(guó)家自然科學(xué)基金(31172183；31140027)；轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專(zhuān)項(xiàng)(2014ZX0800601B)；江蘇省科技支撐計(jì)劃(BE2012330；BE2013345；BE2014357)；江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目(PAPD)

訾 臣(1987-)，男，山東臨沂人，博士生，主要從事豬抗病育種研究，E-mail：zchandy@163.com

*通信作者：包文斌(1974-)，男，博士，研究員，主要從事豬遺傳育種研究，E-mail：wbbao@yzu.edu.cn；吳圣龍(1963-)，男，博士，研究員，主要從事豬遺傳育種研究，E-mail：slwu@yzu.edu.cn

S852.2

A

0366-6964(2015)04-0657-08