孫 敏，梁成珠，王 群，張曉文，肖西志，耿 娟，陳吉祥

(1.中國海洋大學(xué) 海洋生命學(xué)院，青島 266005； 2.山東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，青島 266002)

含非洲馬瘟病毒部分核酸序列的病毒樣顆粒的研制

孫 敏1，2，梁成珠2，王 群2，張曉文2，肖西志2，耿 娟2，陳吉祥1

(1.中國海洋大學(xué) 海洋生命學(xué)院，青島 266005； 2.山東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，青島 266002)

VP7蛋白是非洲馬瘟病毒(AHSV)群特異性蛋白，其編碼基因S7基因常被用作AHSV RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)的靶標(biāo)基因。本研究旨在構(gòu)建耐RNase的內(nèi)含AHSV部分核酸序列的病毒樣顆粒。首先合成S7基因保守序列，然后克隆到含有噬菌體包膜蛋白基因的帶組氨酸純化標(biāo)簽的假病毒表達(dá)載體pNH-MS2his上，成功構(gòu)建原核表達(dá)載體pNH-MS2his-VP7。將重組質(zhì)粒pNH-MS2his-VP7轉(zhuǎn)化BL21(DE3)，并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)及鎳離子親和層析純化后，得到含AHSV 部分RNA片段的病毒樣顆粒。試驗(yàn)證實(shí)該病毒樣顆粒均勻性和穩(wěn)定性良好，可作為AHSV PCR檢測(cè)的質(zhì)控品和標(biāo)準(zhǔn)品使用。

非洲馬瘟病毒；組氨酸標(biāo)簽；病毒樣顆粒；檢測(cè)

非洲馬瘟(African horse sickness，AHS)是馬科動(dòng)物的一種非接觸性傳染的病毒性傳染病，由呼腸孤病毒科(Reoviridae)環(huán)狀病毒屬(Orbivirusgenus)的非洲馬瘟病毒(African horse sickness virus，AHSV)引起。對(duì)于易感動(dòng)物，AHS的致死率可高達(dá)95%。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)把其列入OIE收錄疫病名錄，中國將其列為一類動(dòng)物疫病。非洲馬瘟呈地方性和季節(jié)性流行，主要流行于非洲大陸，近東與中東、西班牙、葡萄牙等非洲以外的國家也曾流行[1-4]。到目前為止，中國還沒有非洲馬瘟的疫情出現(xiàn)。但是隨著對(duì)外貿(mào)易的飛速發(fā)展，中國進(jìn)口動(dòng)物及動(dòng)物性產(chǎn)品大量增加，外來動(dòng)物疾病進(jìn)入我國的風(fēng)險(xiǎn)也隨之增大。積極建立該病的檢測(cè)、監(jiān)測(cè)方法，防止外來動(dòng)物疫病進(jìn)入我國實(shí)屬必要。

AHS的實(shí)驗(yàn)室診斷包括病原學(xué)檢測(cè)和血清學(xué)檢測(cè)，其中病原學(xué)檢測(cè)(即AHSV的檢測(cè))可采用病毒分離、免疫學(xué)和分子生物學(xué)方法[5]。病毒分離是最為經(jīng)典的方法，但費(fèi)時(shí)費(fèi)力；免疫學(xué)方法依賴于高質(zhì)量的特異性單克隆抗體或多克隆抗體，大多為商品化進(jìn)口試劑盒，成本較高；相比之下，以RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光RT-PCR為代表的分子生物學(xué)方法簡(jiǎn)單、快速、經(jīng)濟(jì)，具有前兩種方法無可比擬的優(yōu)勢(shì)。特別是對(duì)于大批量樣本的初篩檢測(cè)，這種優(yōu)勢(shì)更加突出。

AHSV為RNA病毒，在基于PCR的核酸定性和定量檢測(cè)中，影響因素較多，要得到可靠的結(jié)果，必須使用質(zhì)控品或標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制。本研究將AHSVS7基因片段克隆到含有噬菌體包膜蛋白基因的帶組氨酸純化標(biāo)簽的假病毒表達(dá)載體pNH-MS2his上，進(jìn)行原核表達(dá)，得到了含有AHSV 部分RNA片段的病毒樣顆粒。該病毒樣顆粒可用作AHSV PCR檢測(cè)的質(zhì)控品和標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)于保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度和可靠性具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

DH5α 感受態(tài)細(xì)胞、BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞、質(zhì)粒提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；pNH-MS2his質(zhì)粒，本室構(gòu)建；TaqDNA聚合酶、PCR產(chǎn)物膠回收試劑盒、T4 DNA連接試劑盒、限制性內(nèi)切酶HindⅢ、NotⅠ、DNA Marker、One step RT-PCR試劑盒、DNase I、RNaseA等購自大連寶生物公司；Gelred核酸染料購自美國BIOTIUM公司；Ni-NTA Fast Start Kit購自美國QIAGEN公司；其他酵母粉、蛋白胨、氨芐青霉素、IPTG、DEPC、dNTP、瓊脂糖、NaCL、Tris、EDTA、氯仿、異丙醇均為市售分析純。

1.2 主要儀器

生化培養(yǎng)箱(SANYO)、熒光PCR儀(Eppendorf)、梯度PCR儀(Eppendorf)、凝膠成像系統(tǒng)(AlphamagerTM2000)、高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf 5810R)、核酸蛋白分析儀(Eppendorf Biophotometer)、超純水儀(Millpore Simfilter)、透射電子顯微鏡(JEOL JEM-1200EX)、超凈工作臺(tái)(上海智城分析儀器有限公司)、電熱恒溫水槽(上海景洪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)、電泳儀(北京市六一儀器廠)。

1.3 引物和熒光探針的合成

參照OIE《陸生動(dòng)物衛(wèi)生法典》，合成引物和探針，用于非洲馬瘟病毒S7基因保守序列的擴(kuò)增。引物和探針序列如下：上游引物：5′-GGCTCCAACACTCACAAGATGT-3′，下游引物：5′-GGCGGATTAATAGGCTGCATA-3′，MGB探針：5′-TGGCACGCCTTACGCGC-3′。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，ULTRAPAGE純化。探針由AB公司合成。

1.4 非洲馬瘟病毒S7基因保守序列的合成

OIE《陸生動(dòng)物診斷試驗(yàn)和疫苗手冊(cè)》中將編碼VP7蛋白的S7基因片段作為AHSV分子生物學(xué)檢測(cè)的靶標(biāo)基因，公布了引物和探針序列，建立了AHSV的RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法。取其基因擴(kuò)增靶標(biāo)序列，兩端分別添加HindⅢ、NotⅠ酶切位點(diǎn)，委托大連寶生物工程有限公司合成，連入T-Vector pMD19(Simple)載體，構(gòu)建pMD19-VP7質(zhì)粒。目的片段序列為：5′-AAGCTT-GGCTCCAACGCTCACAAGATGTTATGCGTA-TGTTTCTCCCACTTGGCACGCATTACGCGC-TGTCATTTTCCAGCAGATGAATATGCAGCC-TATTAATCCGCCGCGGCCGC-3′。

1.5 帶組氨酸純化標(biāo)簽的病毒樣顆粒表達(dá)載體的制備

用本室構(gòu)建的帶組氨酸純化標(biāo)簽的病毒樣顆粒表達(dá)載體(pNH-MS2his)轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，鋪于氨芐青霉素抗性平板37 ℃培養(yǎng)12～16 h。用滅菌移液器槍頭挑取單個(gè)白色菌落到氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基中，搖菌過夜。次日吸取菌液，離心提取質(zhì)粒備用。

1.6 含非洲馬瘟病毒S7基因RNA片段的重組質(zhì)粒的構(gòu)建

用限制性內(nèi)切酶HindⅢ和NotⅠ分別消化pMD19-VP7質(zhì)粒和pNH-MS2his質(zhì)粒，37 ℃酶切4 h，切膠回收酶切產(chǎn)物，使用T4 DNA連接試劑盒，16 ℃連接5 h。 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，將涂板后獲得的重組克隆搖菌過夜，取菌液進(jìn)行PCR 鑒定。PCR采用25 μL反應(yīng)體系，體系中包括dNTP (2.5 mmol·L-1each)2 μL，10×buffer 2.5 μL，10 pmol·μL-1上游和下游引物各1 μL，菌液5 μL，Taq酶0.3 μL，補(bǔ)水至25 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)擴(kuò)增；72 ℃延伸7 min。電泳確定插入片段大小，PCR產(chǎn)物進(jìn)一步送上海生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。挑選已經(jīng)插入正確片段的菌落植菌。所得陽性重組質(zhì)粒命名為pNH-MS2his-VP7。

1.7 含非洲馬瘟病毒S7基因RNA片段的重組質(zhì)粒的表達(dá)、純化和鑒定

用測(cè)序正確的pNH-MS2his-VP7重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株BL21(DE3)，挑取單個(gè)克隆，接入氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。次日，取過夜培養(yǎng)物按2%加入到LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(OD600 nm=0.6)，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，終濃度為1 mmol·L-1，誘導(dǎo)表達(dá)5 h。4 000 r·min-1離心5 min，收集菌體。使用Ni-NTA Fast Start Kit，加入10 mL裂解緩沖液重懸菌體。冰浴30 min， 4 ℃ 14 000 g離心30 min，留取上清過純化柱。用洗滌緩沖液過柱，洗滌4次后，用1 mL洗脫緩沖液洗脫蛋白質(zhì)，收集流出液。取100 μL流出液，RNaseA和DNaseI各加入1 μL，37 ℃消化4 h后，提取RNA，做PCR和RT-PCR鑒定。PCR檢測(cè)同1.6。RT-PCR檢測(cè)使用One step RT-PCR 試劑盒，采用25 μL反應(yīng)體系，體系中包括Enzyme Mix 1 μL，2×1 step buffer 12.5 μL，10 pmol·μL-1上游和下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，補(bǔ)水至25 μL。反應(yīng)條件：50 ℃ 30 min，反轉(zhuǎn)錄；94 ℃ 2 min 滅活反轉(zhuǎn)錄酶；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)擴(kuò)增；72 ℃ 7 min 延伸。收集到的病毒樣顆粒懸液用1%磷鎢酸染色，JEM-1200EX透射電鏡觀察病毒樣顆粒形態(tài)特征。

1.8 病毒樣顆粒均勻性試驗(yàn)

[6]，對(duì)所制備的病毒樣顆粒進(jìn)行均勻性試驗(yàn)。從-80 ℃保存的病毒樣顆粒懸液中隨機(jī)抽取10管，編號(hào)后提取RNA，采用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR測(cè)定上述RNA，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定2次，記錄Ct值。實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)使用One step RT-PCR 試劑盒，采用25 μL反應(yīng)體系，體系中包括Enzyme Mix 1 μL，2×1 step buffer 12.5 μL，10 pmol·μL-1上游和下游引物各1.5 μL，10 pmol·μL-1探針0.625 μL，DNA模板1 μL，補(bǔ)水至25 μL。反應(yīng)條件：50 ℃ 30 min，反轉(zhuǎn)錄；94 ℃ 2 min 滅活反轉(zhuǎn)錄酶；94 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，45個(gè)循環(huán)擴(kuò)增。試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行F檢驗(yàn)，若F<顯著水平α(通常α=0.05)的臨界值Fα(f1，f2)，則表明樣品間無顯著差異，樣品均勻。

1.9 病毒樣顆粒穩(wěn)定性試驗(yàn)

參考文獻(xiàn)[6]，考察所制備病毒樣顆粒的穩(wěn)定性。將病毒樣顆粒懸液分裝至凍存管中，每管50 μL。從已分裝好的病毒樣顆粒懸液中隨機(jī)抽取12管按以下條件保存，每種條件保存3支。保存條件：(1)室溫(20～25 ℃)，相對(duì)濕度20%～25%，14 d；(2)冰箱冷藏(2～8 ℃)，90 d；(3)-20 ℃，180 d；(4)-80 ℃，180 d(對(duì)照組)。提取上述病毒樣顆粒懸液RNA，采用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定2次，記錄Ct值。采用“平均值一致性檢驗(yàn)法(t檢驗(yàn)法)”進(jìn)行穩(wěn)定性檢驗(yàn)。若t<顯著水平α(通常α=0.05)的臨界值tα(n1+n2-2)，則表明樣品間無顯著差異，樣品穩(wěn)定。

2 結(jié) 果

2.1 表達(dá)載體pNH-MS2his-VP7的構(gòu)建

利用限制性內(nèi)切酶HindⅢ和NotⅠ雙酶切質(zhì)粒pNH-MS2his和pMD19-VP7(圖1、圖2)，膠回收酶切后的載體pNH-MS2his和VP7片段進(jìn)行連接反應(yīng)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取4個(gè)單克隆菌落進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果全部為陽性(圖3)。將PCR產(chǎn)物進(jìn)一步送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與已知序列比對(duì)，序列相似性為100%，表明已正確構(gòu)建表達(dá)載體pNH-MS2his-VP7，AHSVS7基因片段正確克隆到載體pNH-MS2his上。

2.2 內(nèi)含AHSV RNA片段的病毒樣顆粒的原核表達(dá)及鑒定

pNH-MS2his-VP7經(jīng)轉(zhuǎn)化宿主菌表達(dá)，并使用Ni柱純化收集得到的病毒樣顆粒，加入RNase A和DNase I消化后，使用RNA提取試劑盒提取病毒樣顆粒RNA，將得到的RNA分成兩份，一份進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后PCR擴(kuò)增；另一份不進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，直接PCR擴(kuò)增。電泳檢測(cè)結(jié)果顯示進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)102 bp的目的條帶，未進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄直接PCR擴(kuò)增則沒有出現(xiàn)目的條帶(圖4)，表明表達(dá)產(chǎn)物中包裹的為RNA片段。病毒樣顆粒懸液采用磷鎢酸染色后，透射電鏡下觀察，可見直徑為23 cm左右的圓形顆粒，即為誘導(dǎo)表達(dá)得到的病毒樣顆粒(圖5)。

M.DL15000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(TaKaRa)；1.未經(jīng)過酶切的pNH-MS2his；2.酶切后的pNH-MS2hisM.DNA molecular weight marker DL15000 (TaKaRa)；1.Plasmid pNH-MS2his not digested with enzymes；2.Plasmid pNH-MS2his digested with enzymes圖1 質(zhì)粒pNH-MS2his HindⅢ和NotⅠ雙酶切后的電泳圖譜Fig.1 Electrophoresis of plasmid pNH-MS2his digested with HindⅢ and NotⅠ

M.DL2000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(TaKaRa)；1.未經(jīng)過酶切的pMD19-VP7；2.酶切后的pMD19-VP7M.DNA molecular weight marker DL2000 (TaKaRa)；1.Plasmid pMD19-VP7 not digested with enzymes；2.Plasmid pMD19-VP7 digested with enzymes圖2 質(zhì)粒pMD19-VP7 HindⅢ和NotⅠ雙酶切后的電泳圖譜Fig.2 Electrophoresis of plasmid pMD19-VP7 digested with HindⅢ and NotⅠ

M.DL2000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(TaKaRa)；1.空白對(duì)照；2～5.pNH-MS2his-VP7擴(kuò)增產(chǎn)物M.DNA molecular weight marker DL2000 (TaKaRa)；1.Blank control；2-5.The amplification products of pNH-MS2his-VP7圖3 表達(dá)載體pNH-MS2his-VP7的PCR電泳圖譜Fig.3 Electrophoresis of pNH-MS2his-VP7

M.DL2000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(TaKaRa)；1.PCR空白對(duì)照；2.病毒樣顆粒RNA的PCR結(jié)果；3.RT-PCR空白對(duì)照；4.病毒樣顆粒RNA的RT-PCR結(jié)果M.DNA molecular weight marker DL2000 (TaKaRa)；1.Blank control of PCR；2.Electrophoresis of virus-like particles after PCR；3.Blank control of RT-PCR；4.Electrophoresis of virus-like particles after RT-PCR圖4 病毒樣顆粒的PCR和RT-PCR電泳圖譜Fig.4 PCR and RT-PCR electrophoresis of virus-like particles

2.3 病毒樣顆粒的均勻性檢測(cè)

對(duì)抽取的10管病毒樣顆粒混懸液提取RNA，使用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其在260 nm和280 nm的吸光度，確定RNA濃度和純度(表1)。濃度和純度的變異系數(shù)分別為0.093和0.047，表明提取的RNA各管間差異不大，質(zhì)量良好。對(duì)提取的RNA 進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果采取單因素方差分析法，進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，結(jié)果證實(shí)F

圖5 病毒樣顆粒的透射電鏡圖像Fig.5 TEM image of virus-like particles

2.4 病毒樣顆粒的穩(wěn)定性檢測(cè)

將不同保存條件下的病毒樣顆粒溶液，提取RNA后，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)，試驗(yàn)結(jié)果顯示不同條件保存下的各組樣品其Ct值無明顯差異。進(jìn)一步將各組試驗(yàn)樣品的試驗(yàn)數(shù)據(jù)分別與-80 ℃保存樣品的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，t檢驗(yàn)的結(jié)果證實(shí)各組t值均小于t檢驗(yàn)的臨界值(表4)，表明該病毒樣顆粒在穩(wěn)定性檢測(cè)周期內(nèi)具有非常好的穩(wěn)定性。

3 討 論

在RNA病毒核酸檢測(cè)過程中，質(zhì)控品或標(biāo)準(zhǔn)品的使用至關(guān)重要。它是保證檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠的根本條件，也是測(cè)量設(shè)備的校準(zhǔn)、測(cè)量程序的評(píng)定或確認(rèn)以及不同實(shí)驗(yàn)室間結(jié)果比較的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。目前，RNA病毒核酸檢測(cè)使用的質(zhì)控品或標(biāo)準(zhǔn)品主要來源于病毒培養(yǎng)物或由RNA逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA。前者存在生物安全的隱患且易被核糖核酸酶降解，后者則不能體現(xiàn)核酸提取和反轉(zhuǎn)錄過程對(duì)測(cè)定的影響。利用MS2噬菌體，制備內(nèi)含特定RNA的病毒樣顆?；蚍Q之為盔甲R(shí)NA(armored RNA)是近幾年發(fā)展起來的RNA核酸標(biāo)準(zhǔn)品制備技術(shù)。該技術(shù)解決了傳統(tǒng)質(zhì)控品和標(biāo)準(zhǔn)品存在的問題，代表了RNA病毒核酸檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的發(fā)展方向。目前利用該技術(shù)制備的質(zhì)控品和標(biāo)準(zhǔn)品廣泛用于RNA病毒的檢測(cè)[7-11]。

表1 RNA濃度和純度

Table 1 Concentration and purity of RNA

樣品Sample12345678910平均值A(chǔ)verage變異系數(shù)Coefficientofvariation濃度Concentration4.304.504.204.705.104.603.905.304.904.404.590.093純度Purity1.761.821.811.721.852.021.911.871.931.891.860.047

表2 病毒樣顆粒均勻性試驗(yàn)結(jié)果

Table 2 The results on the uniformity experiment of virus-like particles

實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)果(Ct)Theresultsofreal-timeRT-PCR(Ct)樣品Sample12345678910總平均值Overallaverage第一次測(cè)量First23.1323.4423.9623.4523.8123.3523.7723.2723.3623.64第二次測(cè)量Second23.3923.8324.2823.9623.5223.5923.4523.5123.4823.5523.587平均值A(chǔ)verage23.2623.6424.1223.7123.6723.4723.6123.3923.4223.60

表3 病毒樣顆粒均勻性試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析

Table 3 Statistic analysis of the uniformity experiment of virus-like particles

方差來源Sourcesofvariance自由度Degreeoffreedom平方和Sumofsquares(SS)均方Meansquare(MS)F值Fvalue臨界值Criticalvalue組間BetweenSS90.990.11組內(nèi)WithinSS100.450.04532.75F0.05(9,10)=3.02

表4 病毒樣顆粒穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

Table 4 The results on the stability experiment of virus-like particles

保存條件Thepreservationconditions實(shí)時(shí)熒光RT-PCR測(cè)定結(jié)果(Ct)樣品1Sample1樣品2Sample2樣品3Sample3平均值A(chǔ)verage標(biāo)準(zhǔn)差Standarddeviationt值tvalue臨界值Criticalvalue-80℃180d23.5624.2723.6823.3923.7823.2123.650.3720～25℃14d24.3824.2224.1724.3023.7923.5424.070.33-2.082～8℃90d23.8723.4923.8323.2823.8623.6723.670.24-0.10-20℃180d23.7723.5323.9824.2524.1724.3924.020.32-1.84t0.05(10)=2.23

AHSV屬于呼腸孤病毒科環(huán)狀病毒屬。目前已發(fā)現(xiàn)非洲馬瘟病毒有9個(gè)血清型，病毒基因組包含10個(gè)dsRNA(L1～L3、M4～M6、S7～S10)片段，分別編碼10種蛋白質(zhì)(VP1～VP7和NS1、NS2、NS3/NS3A)。其中VP7是最保守的結(jié)構(gòu)蛋白，為群特異性抗原蛋白，其編碼基因(即S7基因片段)常被用作AHSV RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)的靶標(biāo)基因[2-3]。OIE《陸生動(dòng)物衛(wèi)生法典》中推薦的RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法也基于S7基因片段建立。鑒于此，本研究確定以S7基因片段作為目標(biāo)分子片段，用于病毒樣顆粒的制備。作者將AHSVS7基因片段克隆到含有噬菌體包膜蛋白基因的帶組氨酸純化標(biāo)簽的假病毒表達(dá)載體pNH-MS2his上，進(jìn)行原核表達(dá)，得到了含有AHSVS7 RNA片段的病毒樣顆粒。該病毒樣顆粒具有以下幾個(gè)特點(diǎn)：(1)在表達(dá)載體中引入了組氨酸標(biāo)簽，純化簡(jiǎn)單方便。(2)具有耐RNase的特性，穩(wěn)定性很好，20～25 ℃保存14 d，2～8 ℃保存180 d、—20 ℃保存180 d后提取RNA做熒光定量RT-PCR，其Ct值與-80 ℃保存組無顯著性差異，表明病毒樣顆粒無降解。(3)可以全程模擬RT-PCR過程，作為質(zhì)控品用于AHSV定性檢測(cè)。后續(xù)我們將在現(xiàn)有工作的基礎(chǔ)上，選取適當(dāng)?shù)姆椒▽?duì)制備的病毒樣顆粒進(jìn)行定值，定值后可進(jìn)一步作為標(biāo)準(zhǔn)品用于AHSV的定量檢測(cè)。該病毒樣顆粒的制備對(duì)于AHSV檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化、準(zhǔn)確化具有重要意義，應(yīng)用前景十分廣闊。

4 結(jié) 論

VP7蛋白是非洲馬瘟病毒群特異性蛋白質(zhì)，其編碼基因S7基因常被用作AHSV RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)的靶標(biāo)基因。本研究合成S7基因保守序列，克隆到含有噬菌體包膜蛋白基因的帶組氨酸純化標(biāo)簽的假病毒表達(dá)載體pNH-MS2his上，成功構(gòu)建原核表達(dá)載體pNH-MS2his-VP7。將重組質(zhì)粒pNH-MS2his-VP7進(jìn)行轉(zhuǎn)化、誘導(dǎo)、表達(dá)及親和層析純化后，得到含AHSV部分RNA片段的病毒樣顆粒。該病毒樣顆粒直徑約為23 cm，均勻性和穩(wěn)定性良好。

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(編輯 白永平)

Preparation of the Virus-like Particles Containing the Partial Gene Fragment of AHSV

SUN Min1，2，LIANG Cheng-zhu2，WANG Qun2，ZHANG Xiao-wen2，XIAO Xi-zhi2，GENG Juan2，CHEN Ji-xiang1

(1.CollegeofMarineLifeSciences，OceanUniversityofChina，Qingdao266005，China；2.InspectionandQuarantineTechnicalCenterofShandongEntry-exitInspectionandQuarantineBureau，Qingdao266002，China)

This experiment was conducted to prepare the virus-like particles containing the partial gene fragment of African horse sickness virus (AHSV).Genome segment 7 (S7) encoding protein VP7，the group-specific protein of AHSV，is a primary target for reverse transcription-PCR and real time reverse transcription-PCR detection of AHSV.The conservative sequence ofS7 gene was synthesized and cloned into plasmid pNH-MS2his，which contained the coat protein gene ofE.colibacteriophage MS2 and His tag，to construct the prokaryotic express vector pNH-MS2his-VP7.The recombinant plasmid pNH-MS2his-VP7 was transformed into BL21 (DE3).Expression of the target protein was induced by IPTG for 5 h.The virus-like particles containing the S7 RNA sequence of AHSV were simply obtained by induction and sequent Ni+chromatography purification.The virus-like particles were confirmed have good uniformity and stability.They have great prospect as the standard and quality control in the detection of AHSV.

African horse sickness virus；His tag；virus-like particle；detection

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.04.018

2014-08-15

國家質(zhì)檢總局科研基金資助項(xiàng)目(2011IK010；2011IK011)

孫 敏(1976-)，女，山東青島人，高級(jí)獸醫(yī)師，碩士，主要從事動(dòng)植物產(chǎn)品檢測(cè)，E-mail：sunminxh@sina.com

S852.659.4

A

0366-6964(2015)04-0637-07