吳翠蘭，何怡寧，李和鳴，孫新寬，譚渝才，韋天超，磨美蘭，韋 平

(廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南寧 530005)

一株重組雞傳染性支氣管炎病毒的分離及結(jié)構(gòu)蛋白基因變異和血清型分析

吳翠蘭，何怡寧，李和鳴，孫新寬，譚渝才，韋天超，磨美蘭*，韋 平*

(廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南寧 530005)

為進(jìn)一步了解雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)流行株的遺傳變異情況，對(duì)2013年從免疫失敗的廣西某雞場中分離到的一株IBV(GX-NN130048)進(jìn)行S1、E、M和N基因的擴(kuò)增、測序、相似性比較、系統(tǒng)進(jìn)化樹繪制和重組分析以及血清型鑒定?；蛐蛄蟹治鼋Y(jié)果表明，分離株GX-NN130048的S蛋白裂解位點(diǎn)序列為RRSRR，S1、E、M和N基因與參考株核苷酸相似性分別在60.8%～90.1%、81.0%～94.2%、86.1%～93.8%和86.0%～93.3%；進(jìn)化樹分析顯示，分離株GX-NN130048的S1基因與疫苗毒株4/91同屬一群，而E、M和N基因則與毒株LX4屬于同一群；重組分析顯示，分離株GX-NN130048的S1基因來源于疫苗毒株4/91和GX-HC1006野毒株(LX4型)的重組；血清型分析表明，該分離株的血清型不同于疫苗株H120和4/91。研究表明分離株GX-NN130048是一株重組毒株，其結(jié)構(gòu)基因和血清型均發(fā)生變異。本研究再次提供證據(jù)說明，疫苗株4/91越來越多參與到IBV流行株通過基因重組導(dǎo)致的遺傳變異事件當(dāng)中，并可能由此導(dǎo)致新血清型的出現(xiàn)。這可能是現(xiàn)場免疫失敗的一個(gè)主要原因。有必要繼續(xù)加強(qiáng)對(duì)IBV的監(jiān)測和新疫苗的研發(fā)。

傳染性支氣管炎病毒；重組；基因；血清型；變異

雞傳染性支氣管炎(infectious bronchitis，IB)是由冠狀病毒雞傳染性支氣管炎病毒(infectious bronchitis virus，IBV)引起雞的一種急性高度接觸性傳染病[1]。IBV主要危害雞的呼吸道和泌尿生殖道，引起雞的氣管啰音、打噴嚏、咳嗽、蛋雞產(chǎn)蛋量和蛋品質(zhì)的下降等[2- 3]，給養(yǎng)雞業(yè)造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。

IBV為不分節(jié)段的單股正鏈RNA病毒[4-5]，基因組全長27.6 kb，包含四種結(jié)構(gòu)蛋白，即纖突(S)蛋白、小膜(E)蛋白、膜(M)蛋白和核衣殼(N)蛋白[6-8]。S蛋白可以裂解為S1、S2兩個(gè)糖基化蛋白，其中，S1可產(chǎn)生病毒中和抗體和血凝抑制抗體以及交叉反應(yīng)[9]。S2包含兩個(gè)抗原決定因素，這可能影響S1的特定抗體結(jié)合位點(diǎn)[2，10]。E蛋白是病毒顆粒組裝和釋放所必需[2，6]。M蛋白是糖基化蛋白，與病毒RNA的合成、誘導(dǎo)白細(xì)胞產(chǎn)生α-干擾素有關(guān)[11-12]。N蛋白在病毒復(fù)制、組裝、細(xì)胞免疫中起重要作用[1]。以往的研究通常只研究S1基因或部分結(jié)構(gòu)基因[2]，極少同時(shí)研究四種結(jié)構(gòu)蛋白。同時(shí)研究S1、E、M、N這四種結(jié)構(gòu)基因，可避免單基因分析可能造成的假象，更準(zhǔn)確、科學(xué)分析IBV的遺傳變異，有助于了解IBV的變異規(guī)律和分子機(jī)制。

盡管一直以來都廣泛使用多種商品疫苗，但現(xiàn)場IB的問題仍不斷出現(xiàn)[13-14]，給養(yǎng)雞企業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。這主要由于IBV基因組極易發(fā)生突變、缺失、插入和重組，導(dǎo)致多種基因型和血清型的產(chǎn)生。目前全世界已有30多種血清型，且不同血清型之間交叉保護(hù)效果差或者完全沒有保護(hù)作用。不同國家、地區(qū)流行的IBV存在差異，因此及時(shí)掌握本地區(qū)現(xiàn)場流行毒株基因的變異乃至抗原性的變化，對(duì)該病的防控和疫苗的研發(fā)都非常重要。本研究對(duì)2013年從免疫失敗的廣西某雞場的病雞中分離得到的一株IBV分離株的S1、E、M和N基因進(jìn)行序列分析，并與國內(nèi)外的分離株和疫苗株進(jìn)行相似性比較、進(jìn)化樹和重組分析以及血清型鑒定，旨在了解該分離株的基因和抗原變異情況，以便更全面闡述IBV變異規(guī)律和分子機(jī)制以及為新疫苗的研發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來源

病料來源于廣西某雞場22 d齡病雞的氣管及腎。該雞群發(fā)病率為50%，剖檢病變主要為氣管下端有黏液以及腎出現(xiàn)尿酸鹽沉積等。該雞群在7 d齡免疫過H120疫苗，13 d齡免疫過某腎型IBV疫苗。

1.2 試驗(yàn)雞胚

SPF雞胚購自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；18～20 d齡健康雞胚購于廣西華桂源種雞場。

1.3 主要試劑

Trizol、dNTP Mix、DL2000 DNA Marker、2×TaqPCR MasterMix和瓊脂糖凝膠回收試劑盒均購自Tiangen公司；M-MLV購自Invitrogen公司；pMD18-T載體購自TaKaRa公司；DH5α感受態(tài)細(xì)胞由本課題組制備保存；DMEM培養(yǎng)基為GIBCO公司產(chǎn)品。

1.4 單因子血清

6種不同血清型的單因子血清：GX-YL5(血清1型)、GX-C(血清2型)、H120(血清3型)、GX-YL1(血清4型)、GX-NN7(血清5型)和GX-YL9(血清6型)，由本課題組制備保存[15]。

1.5 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank中已經(jīng)發(fā)表的IBV序列，利用Oligo7軟件設(shè)計(jì)4對(duì)特異性引物，具體引物信息見表1。

1.6 病毒增殖

無菌采取病變氣管、腎等組織進(jìn)行充分研磨，反復(fù)凍融3次之后，5 000 r·min-1離心5 min，取上清液用0.22 μm微孔濾器除菌后接種于9日齡SPF雞胚尿囊腔，劑量為0.2 mL·枚-1，37 ℃培養(yǎng)48～96 h后，無菌收集雞胚尿囊液。

表1 引物序列信息

Table 1 The information of primer sequences

引物Primer序列(5'→3')Sequence(5'→3')長度/bpLength基因片段ThefragmentofgeneS1-FGATTGTGCATGGTGGACAATG2137S1+部分S2 S1andpartialofS2S1-RGATTTGGACCTTATCCATACGE-FCCDCAAAATGCACCTAATG1486部分S2+3abc PartialofS2and3abcE-RCTWGTTGCATABCCATACTGM-FCGGAATTCAGTTTCCTAAGAACGGTTGGAA740部分E+M PartialofEandMM-RCCCAAGCTTCTCTACACGCACACATTTATN-FGAGGATCCATGGCAAGCGGTAAGG1495部分5ab+N Partialof5abandNN-RGACATTTCCCTGGCGATAGAC

1.7 病毒RNA的提取和基因的RT-PCR擴(kuò)增

參照Trizol試劑盒說明方法抽提雞胚尿囊的核酸RNA，并按照M-MLV說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，應(yīng)用設(shè)計(jì)的4對(duì)特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25 μL，包括2×TaqPCR MasterMix 12.5 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，模板2 μL，ddH2O 8.5 μL。S1、E、M、N基因的擴(kuò)增反應(yīng)參數(shù)：95 ℃ 5 min；95 ℃ 40 s，56 ℃(52 ℃、52 ℃、52 ℃)50 s，72 ℃ 1 min30 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.8 基因的克隆測序和分析

按常規(guī)方法純化回收PCR產(chǎn)物，與pMD18-T連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，PCR鑒定后取3個(gè)陽性菌液送Invitrogen公司測序。應(yīng)用MegAlign軟件的Clustal W Method進(jìn)行序列比對(duì)和相似性分析，應(yīng)用MEGA5.10軟件的Neighbor-joining method對(duì)分離株和包括常用疫苗株、國內(nèi)分離株及國際上其他血清型的參考毒株[S1(45株)、E(43株)、M(45株)、N(45株)]基因核苷酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，應(yīng)用RDP4.33軟件進(jìn)行重組分析。

1.9 血清型鑒定

雞胚氣管環(huán)的制備與培養(yǎng)按照本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)的方法[16]；根據(jù)Reed-Muench法[17]計(jì)算分離株的雞胚氣管環(huán)半數(shù)感染量(TOC-ID50)；然后采用固定病毒稀釋各單因子血清的方法，根據(jù)TOC-ID50的結(jié)果在24孔板上進(jìn)行血清中和試驗(yàn)[16]。

2 結(jié) 果

2.1 病毒的分離和鑒定

將發(fā)病雞氣管和腎處理上清液接種雞胚96 h后無雞胚死亡。對(duì)雞胚尿囊液的核酸RNA進(jìn)行RT-PCR鑒定，擴(kuò)增得到片段與目的片段大小相符，測序結(jié)果表明為IBV，命名為GX-NN130048，其S1、E、M和N基因登錄號(hào)分別為KJ999796、KM279002、KF975406和KJ940503。

2.2 分離株S1、E、M和N基因的擴(kuò)增和序列測定

M.DL2000 DNA 相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) ；1～4.分別為4對(duì)引物RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物M.DL2000 DNA marker；1-4.Products of RT-PCR with 4 primer pairs，respectively圖1 毒株GX-NN130048基因RT-PCR擴(kuò)增電泳Fig.1 Electrophoresis of RT-PCR amplified products of GX-NN130048 isolate

以分離株GX-NN130048核酸RNA為模板，應(yīng)用設(shè)計(jì)的4對(duì)特異引物對(duì)S1、E、M和N基因進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增片段大小分別為2 137、1 486、740和1 495 bp(圖1)，與預(yù)計(jì)大小相符。測序結(jié)果表明，IBV分離株的S1基因片段長為1 620 bp，編碼由540個(gè)氨基酸殘基組成的多肽，其裂解位點(diǎn)為RRSRR。E基因片段長為327 bp，編碼由108個(gè)氨基酸殘基組成的多肽。M基因片段長為678 bp，編碼由225個(gè)氨基酸殘基組成的多肽。N基因片段長為1 230 bp，編碼由409個(gè)氨基酸殘基組成的多肽。

2.3 基因序列的相似性比較

相似性分析結(jié)果表明，分離株GX-NN130048的S1、E、M和N基因與參考株的核苷酸相似性分別在60.8%～90.1%、81.0%～94.2%、86.1%～93.8%和86.0%～93.3%，遺傳距離分別在10.6～55.0、6.1～22.0、6.5～15.5和7.1～15.5；推導(dǎo)氨基酸相似性分別在74.0%～88.3%(除與Delaware、Georgia分別為49.3%、48.9%外)、73.5%～94.5%、86.2%～96.9%(除與Gray株為65.9%外)和83.4%～95.6%，遺傳距離分別在12.7～31.9(除與Delaware、Georgia分別為81.6、82.9外)、5.7～32.7、3.2～15.3(除與Gray株為45.3外)和4.5～18.8；與疫苗株H120、4/91的核苷酸相似性見表2。與現(xiàn)階段占主導(dǎo)地位的流行株LX4的核苷酸相似性相比，除了S1(85.9%)基因外，其余基因均在90%以上。以H120為參考，該分離株的S1基因分別在24—25(N)、120—121(GS)處有3個(gè)氨基酸插入。

表2 分離株GX-NN130048結(jié)構(gòu)基因與H120、4/91核苷酸相似性比較

Table 2 Nucleotide homology comparison of the structural genes of GX-NN130048 with H120 and 4/91

%

2.4 基因的進(jìn)化樹分析

基于分離株GX-NN130048和參考株的S1、E、M和N核苷酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2)顯示，該分離株GX-NN130048的S1基因與4/91同屬一群，且與4/91親緣關(guān)系較近；其余基因均屬于LX4型，但E基因及N基因與A2、CK/CH/LHLJ/95I、LDT3、partridge/GD/S14/2003、LX4等毒株親緣關(guān)系較近，而M基因與LX4親緣關(guān)系較近。

2.5 基因序列的重組分析

利用RDP4.33軟件對(duì)分離株GX-NN130048的S1、E、M及N基因進(jìn)行重組分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分離株GX-NN130048的S1基因來源于疫苗株4/91和LX4型的分離株GX-HC1006之間的重組，重組區(qū)域?yàn)镾1基因C-端部分(3—613 bp)，見圖3中左側(cè)部分。其RDP、GENECONV、BootScan、MaxChi、Chimaera、SiScan、3Seq的P值分別為1.455×10-38、7.109×10-35、1.235×10-38、1.810×10-26、3.782×10-27、3.251×10-31、2.959×10-79。分離株GX-NN130048的S1基因的C-端和N-端分別與LX4型分離株GX-HC1006和疫苗株4/91具有很高的相似性，分別為99.6%和98.2%。

2.6 分離株的血清型分析

根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算分離株GX-NN130048的TOC-ID50為10-4.5mL- 1，表明該分離株在TOC上生長良好。隨即進(jìn)行的中和試驗(yàn)的結(jié)果如表3。根據(jù)中和滴度相同或相差一個(gè)滴度即屬于同一血清型的判斷標(biāo)準(zhǔn)[15]，分離株GX-NN130048與GX-YL5為同一個(gè)血清型，屬于血清1型，與常用的疫苗株H120(血清3型)和4/91型(血清5型)[15]均屬不同的血清型。

表3 分離株GX-NN130048中和試驗(yàn)結(jié)果

Table 3 The results of neutralization test of GX-NN130048 isolate

毒株Virus分離株與各抗血清血清的中和滴度NeutralizationtitersofvirusesagainsttheantiseraGX-YL5GX-CH120GX-YL1GX-NN7GX-YL9GX-NN1300481∶5121∶161∶1281∶641∶641∶32

3 討 論

廣西是全國養(yǎng)禽大省之一，盡管廣泛使用疫苗，但近年來IB仍頻繁發(fā)生，給廣西養(yǎng)禽業(yè)造成較嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。本研究中分離株GX-NN130048是從免疫過H120株和某腎型疫株苗疫苗的雞群中分離到，說明了免疫的疫苗不能對(duì)流行毒株提供足夠的保護(hù)。相似性分析結(jié)果顯示，分離株GX-NN130048的S1、E、M和N基因與參考株核苷酸相似性分別在60.8%～90.1%、81.0%～94.2%、86.1%～93.8%和86.0%～93.3%，與疫苗株H120的S1、E、M和N基因核苷酸相似性分別為78.1%、86.2%、90.2%和87.8%，因此，4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白基因與疫苗比較均出現(xiàn)明顯的變異，其中S1基因變異程度最大，E基因其次。4個(gè)結(jié)構(gòu)基因均發(fā)生變異在一定程度上解釋了雞群免疫失敗的原因。

圖2 分離株GX-NN130048與參考株的S1、E、M、N基因系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic trees based on nucleotide sequence of S1，E，M and N genes of GX-NN130048 and IBV reference strains

圖3 分離株GX-NN130048的RDP重組分析結(jié)果，左側(cè)部分為潛在的重組區(qū)域Fig.3 RDP screenshots displaying the possible recombination event on GX-NN130048 isolate.The left area demarcates the potential recombination regions

為了更進(jìn)一步了解分離株GX-NN130048的分子流行病學(xué)特征，本研究對(duì)其S1、E、M以及N基因分別繪制核苷酸系統(tǒng)進(jìn)化樹。進(jìn)化樹分析表明各結(jié)構(gòu)基因在進(jìn)化關(guān)系上并不平行，S1基因與4/91株為同一群，且與4/91親緣關(guān)系較近；其余基因均屬于LX4型，本研究還發(fā)現(xiàn)，除了S1基因與疫苗株4/91進(jìn)化遺傳距離較近些，E、M和N基因與常用疫苗株H120、4/91進(jìn)化遺傳距離稍遠(yuǎn)。由此可知，該分離株已發(fā)生變異且不同結(jié)構(gòu)基因變異程度不同。目前我國流行的IBV 主要是LX4型病毒[18]。從20世紀(jì)80年代至2011年本課題組從廣西共分離到近60株IBV毒株，基于S1基因構(gòu)建進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)存在7個(gè)IBV基因型，其中1985-2008年的IBV分離株主要以CK/CH/LSC/99I型為主，2009—2011年主要以LX4型為主[19]。本研究中，根據(jù)S1基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹，分離株GX-NN130048屬于4/91型，不同于當(dāng)前廣泛流行的LX4型毒株，但其另外的三個(gè)結(jié)構(gòu)基因均屬于LX4型，表明該毒株可能發(fā)生了基因重組。因此，進(jìn)行多個(gè)結(jié)構(gòu)基因的分析避免了單基因分析造成的假象，進(jìn)行多基因的分析是非常有必要的。

重組是IBV發(fā)生變異的另一重要機(jī)制[20]。通過對(duì)IBV重組的研究可以加深對(duì)IBV遺傳多樣性與進(jìn)化機(jī)制的理解，從而更好地控制該病。重組可以發(fā)生在野毒株之間[21-22]，或者在野毒株和疫苗株之間[23-24]。現(xiàn)階段，我國流行的IB病例50%以上是LX4型的病毒引起[25]，4/91活疫苗也被養(yǎng)殖場廣泛地使用。本研究中，重組軟件分析結(jié)果表明分離株GX-NN130048的S1基因來自LX4型分離株GX-HC1006和疫苗株4/91的重組。本課題組曾發(fā)現(xiàn)2006-2007年的5個(gè)廣西分離株為疫苗株4/91與CK/CH/LSC/99I基因型野毒株的重組株，而CK/CH/LSC/99I基因型正是2006—2007年廣西流行野毒株的主要型[26]。國內(nèi)其他研究團(tuán)隊(duì)也發(fā)現(xiàn)了涉及疫苗株4/91的重組株[24，26-27]，并且重組株毒力增強(qiáng)[27- 28]。因此，隨著4/91株活疫苗的應(yīng)用，該毒株越來越多地參與IBV流行毒株的重組，導(dǎo)致新毒株(包括新基因型和新血清型)的出現(xiàn)，甚至引起毒力增強(qiáng)。4/91活疫苗雖對(duì)免疫雞群產(chǎn)生一定的保護(hù)作用，但使用過4/91疫苗的雞場對(duì)該疫苗產(chǎn)生“依賴”作用[29]。此外，另外一個(gè)值得思考的問題是，在我們對(duì)現(xiàn)場連續(xù)多年的跟蹤研究證明，4/91型毒株的分離比例比較低(10.5%，6/57)[19]。因此，4/91活疫苗是否有必要作為常規(guī)疫苗頻繁使用值得思考。

血清型是衡量毒株保護(hù)性抗原以及免疫保護(hù)最直接的方法，是選擇合適疫苗及研發(fā)新型疫苗的根據(jù)，對(duì)疫病控制非常重要。因此，本研究進(jìn)一步對(duì)分離株GX-NN130048進(jìn)行了血清型鑒定，結(jié)果表明，分離株GX-NN130048屬于血清1型，與常用疫苗株H120(血清3型)和4/91(血清5型)[15]不屬于同一個(gè)血清型。根據(jù)本研究的分析結(jié)果，分離株GX-NN130048可能是由疫苗株4/91和GX-HC1006野毒株重組而來。本課題組前期的研究表明GX-HC1006分離株屬于血清5型[30]，疫苗株4/91也屬于血清5型[15]，分離株GX-NN130048屬于血清1型，可能的解釋是S1基因的重組區(qū)域改變了抗原決定簇區(qū)域的關(guān)鍵位點(diǎn)，因?yàn)榇蟛糠值谋Ｗo(hù)性抗原表位位于S1基因C端的1/4區(qū)域和3/4區(qū)域中[2，10]。本課題組前期對(duì)1985—2011年的50多株IBV的血清型進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)廣西IBV分屬于7個(gè)不同的血清型而且不同時(shí)期各血清型所占比例也不同，現(xiàn)階段優(yōu)勢血清型為1、2、3型(三者所占比例總和達(dá)到70%以上)[31-32]。本研究結(jié)果再次提供證據(jù)表明，研制包括血清型1、2、3型的IBV多價(jià)滅活油苗對(duì)廣西IB的防控具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

IBV整個(gè)基因組均可發(fā)生重組，最容易發(fā)生重組的是IBV的nsp 2(non-structural proteins)、nsp3、nsp16和S蛋白基因，重組斷點(diǎn)(breakpoints)在S基因的附近或S基因內(nèi)部可能會(huì)導(dǎo)致新血清型或新冠狀病毒的出現(xiàn)[33]。本研究中分離株GX-NN130048的重組斷點(diǎn)在S基因內(nèi)部，其血清型已發(fā)生改變，除了S1基因外，其他非結(jié)構(gòu)基因是否存在重組，有必要對(duì)全基因序列進(jìn)行測序。同時(shí)，重組可能導(dǎo)致IBV毒力的增強(qiáng)[27-28]，有必要對(duì)該毒株的致病性、免疫原性等生物學(xué)特性進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

IBV分離株GX-NN130048是來源于LX4型野毒株與疫苗株4/91的重組株，分離株的4個(gè)結(jié)構(gòu)基因和血清型均發(fā)生變異，而且其血清型也與常用疫苗株的不同。研究結(jié)果說明流行株的變異是引起免疫失敗的主要原因，同時(shí)說明疫苗株4/91越來越多地參與IBV流行株的遺傳變異并可能導(dǎo)致新血清型的出現(xiàn)，值得注意這一問題，而且有必要加強(qiáng)對(duì)IBV的監(jiān)測和新疫苗的研發(fā)。

[1] 蘇敬良，高 福，索 勛，譯.禽病學(xué)[M].12版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2012：108-130. SU J L，GAO F，SUO X，the main translation.Diseases of poultry[M].12thedition. Beijing：China Agriculture Press，2012：108-130.(in Chinese)

[2] MO M L，HONG S M，KWON H J，et al.Genetic diversity of spike，3a，3b andEgenes of infectious bronchitis viruses and emergence of new recombinants in Korea[J].Viruses，2013，5(2)：550-567.

[3] CAVANAGH D.Severe acute respiratory syndrome vaccine development：Experiences of vaccination against avian infectious bronchitis coronavirus[J].AvianPathol，2003，32(6)：567-582.

[4] SELIM K，ARAFA A S，HUSSEIN A H，et al.Molecular characterization of infectious bronchitis viruses isolated from broiler and layer chicken farms in Egypt during 2012[J].IntJVSciMed，2013，1(1)：102-108.

[5] 孫 裴，施 雷，魏建忠，等.雞傳染性支氣管炎病毒感染的分子機(jī)制[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013，34(12)：199-203. SUN P，SHI L，WEI J Z，et al.Advance in molecular mechanism of infectious bronchitis virus infection[J].ProgressinVeterinaryMedicine，2013，34(12)：199-203.(in Chinese)

[6] LIU X L，SU J L，ZHAO J X，et al.Complete genome sequence analysis of a predominant infectious bronchitis virus(IBV) strain in China[J].VirusGenes，2009，38(1)：56-65.

[7] 肖朝庭，時(shí) 莉，宋翥遠(yuǎn)，等.傳染性支氣管炎病毒疫苗株H52的全基因組克隆與分析[J].中國動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào)，2009，17(2)：17-23. XIAO C T，SHI L，SONG Z Y，et al.Cloning and sequence analysis of the complete genome of infectious bronchitis virus vaccine strain H52[J].ChineseJournalofAnimalInfectiousDiseases，2009，17(2)：17-23.(in Chinese)

[8] KUO S M，KAO H W，HOU M H，et al.Evolution of infectious bronchitis virus in Taiwan：Positively selected sites in the nucleocapsid protein and their effects on RNA-binding activity[J].VetMicrobiol，2013，162(2-4)：408-418.

[9] JIA W，KARACA K，PARRISH C R，et al.A novel variant of avian infectious bronchitis virus resulting from recombination among three different strains[J].ArchVirol，1995，140(2)：259-271.

[10] CAVANAGH D，DAVIS P J，COOK J K，et al.Location of the amino acid differences in the S1 spike glycoprotein subunit of closely related serotypes of infectious bronchitis virus[J].AvianPathol，1992，21(1)：33-43.

[11] 磨美蘭，李 孟，韋 平，等.雞傳染性支氣管炎病毒廣西流行株3種主要結(jié)構(gòu)蛋白基因的遺傳變異分析[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2010，41(9)：1138-1146. MO M L，LI M，WEI P，et al.Genetic variations of main structural genes of infectious bronchitis virus strains isolated in Guangxi province of China[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica，2010，41(9)：1138-1146.(in Chinese)

[12] 胡北俠，楊少華，許傳田，等.2008-2012年山東省雞傳染性支氣管炎病毒遺傳演化分析和致病性研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2014，45(5)：795-801. HU B X，YANG S H，XU C T，et al.Phylogenetic analysis and pathogenicity infectious bronchitis virus isolated in Shangdong province during 2008-2012[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica，2014，45(5)：795-801.(in Chinese)

[13] 磨美蘭，李 孟，韋正吉，等.廣西1985年～2008年IBV分離株S1基因高變區(qū)I和N基因的序列和系統(tǒng)進(jìn)化分析[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2009，31(10)：761-766. MO M L，LI M，WEI Z J，et al.Sequence and phylogenetic analysis of S1 gene hypervariable region I and N genes of infectious bronchitis viruses isolated in Guangxi province of China from 1985 to 2008[J].ChineseJournalofPreventiveVeterinaryMedicine，2009，31(10)：761-766.(in Chinese)

[14] MO M L，HUANG B C，WEI P，et al.Complete genome sequences of two Chinese virulent avian coronavirus infectious bronchitis virus variants[J].JVirol， 2012，86(19)：10903-10904.

[15] 王秀英，韋 平，陳秋英，等.雞傳染性支氣管炎病毒廣西分離株血清型的分析[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2010，30(2)：183-187. WANG X Y，WEI P，CHEN Q Y，et al.Serotyping of Guangxi isolates of infectious bronchitis virus[J].ChineseJournalofVeterinaryScience，2010，30(2)：183-187.(in Chinese)

[16] 李康然，韋 平，梁梅芳，等.用氣管環(huán)培養(yǎng)中和試驗(yàn)對(duì)雞傳染性支氣管炎病毒進(jìn)行血清定型[J].廣西農(nóng)院學(xué)報(bào)，1991，10(3)：1-6. LI K R，WEI P，LIANG M F，et al.The serotyping of Guangxi isolates of avian infectious bronchitis virus by neutralization test in chicken tracheal cultures[J].JournalofGuangxiAgriculturalCollege，1991，10(3)：1-6.(in Chinese)

[17] YU L，JIANG Y，LOW S，et al.Characterization of three infectious bronchitis virus isolates from China associated with proventriculus in vaccinated chickens[J].AvianDis，2001，45(2)：416-424.

[18] HAN Z X，SUN C Y，YAN B，et al.A 15-year analysis of molecular epidemiology of avian infectious bronchitis coronavirus in China[J].InfectGenetEvol，2011，11(1)：190-200.

[19] 磨美蘭，李 孟，何 坤，等.近期廣西雞傳染性支氣管炎流行概況及防控措施[J].廣西畜牧獸醫(yī)，2013，29(2)：67-70. MO M L，LI M，HE K，et al.The general situation and preventive measure of infectious bronchitis virus in Guangxi province recently[J].GuangxiJournalofAnimalHusbandry&VeterinaryMedicine，2013，29(2)：67-70.(in Chinese)

[20] CAVANAGH D.Coronavirus avian infectious bronchitis virus[J].VetRes，2007，38(2)：281-297.

[21] POHUANG T，CHANSIRIPORNCHAI N，TAWATSIN A，et al.Sequence analysis of S1 genes of infectious bronchitis virus isolated in Thailand during 2008-2009：Identification of natural recombination in the field isolates[J].VirusGenes，2011，43(2)：254-260.

[22] MARDANI K，NOORMOHAMMADI A H，IGNJATOVIC J，et al.Naturally occurring recombination between distant strains of infectious bronchitis virus[J].ArchVirol，2010，155(10)：1581-1586.

[23] OVCHINNIKOVA E V，BOCHKOV Y A，SHCHERBAKOVA L O，et al.Molecular characterization of infectious bronchitis virus isolates from Russia and neighbouring countries：Identification of intertypic recombination in the S1 gene[J].AvianPathol，2011，40(5)：507-514.

[24] ZHANG Y，WANG H N，WANG T，et al.Complete genome sequence and recombination analysis of infectious bronchitis virus attenuated vaccine strain H120[J].VirusGenes，2010，41(3)：377-388.

[25] LI M，MO M L，HUANG B C，et al.Continuous evolution of avian infectious bronchitis virus resulting in different variants co-circulating in Southern China[J].ArchVirol，2013，158(8)：1783-1786.

[26] MO M L，LI M，HUANG B C，et al.Molecular characterization of major structural protein genes of avian coronavirus infectious bronchitis virus isolates in Southern China[J].Viruses，2013，5(12)：3007-3020.

[27] LIU X L，MA H J，XU Q Q，et al.Characterization of a recombinant coronavirus infectious bronchitis virus with distinct S1 subunits of spike and nucleocapsid genes and a 3’untranslated region[J].VetMicrobiol，2013，162(2-4)：429-436.

[28] 張小榮，程靖華，張建軍，等.QX型與4/91型傳染性支氣管炎病毒毒株間的重組分析[C].中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)禽病學(xué)分會(huì)第十六次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集，2012. ZHANG X R，CHENG J H，ZHANG J J，et al.Recombination analysis of infectious bronchitis virus between QX-type and 4/91-type[C].Poultry epidemiology branch of Chinese association of animal science and veterinary medicine on the 16thacademic conference proceedings，2012.(in Chinese)

[29] 劉勝旺.我國雞傳染性支氣管炎流行現(xiàn)狀及原因分析[J].中國家禽，2010，32(16)：5-9. LIU S W.The current situation and analysis of causes of infectious bronchitis virus in China[J].ChinaPoultry，2010，32(16)：5-9.(in Chinese)

[30] 孫 蓉.雞傳染性支氣管炎病毒廣西分離株血清型的鑒定及免疫原性的研究[D].南寧：廣西大學(xué)，2012. SUN R.Serotype identification and immunogenicity of Guangxi isolates of avian infectious bronchitis virus[D]. Nanning：Guangxi University，2012.(in Chinese)

[31] 王秀英，李 孟，韋 平，等.雞傳染性支氣管炎病毒廣西分離毒株抗原相關(guān)性的研究[J].病毒學(xué)報(bào)，2012，28(6)：621-627. WANG X Y，LI M，WEI P，et al.Evaluation of antigenic relationship of Guangxi isolates of infectious bronchitis virus[J].ChineseJournalofVirology，2012，28(6)：621-627.(in Chinese)

[32] 秦麗莉，李 孟，孫 蓉，等.廣西2009～2011年雞傳染性支氣管炎病毒分離株的基因分型及血清分型[J].病毒學(xué)報(bào)，2014，30(2)：162-170. QIN L L，LI M，SUN R，et al.Genotypes and serotypes of avian infectious bronchitis viruses isolated during 2009-2012 in Guangxi，China[J].ChineseJournalofVirology，2014，30(2)：162-170.(in Chinese)

[33] THOR S W，HILT D A，KISSINGER J C，et al.Recombination in avian gamma-coronavirus infectious bronchitis virus[J].Viruses，2011，3(9)：1777-1799.

(編輯 白永平)

Isolation and Analysis of Structural Protein Genes Variation and Serotype of a Recombinant Strain of Chicken Infectious Bronchitis Virus

WU Cui-lan，HE Yi-ning，LI He-ming，SUN Xin-kuan，TAN Yu-cai，WEI Tian-chao，MO Mei-lan*，WEI Ping*

(CollegeofAnimalScienceandTechnology，GuangxiUniversity，Nanning530005，China)

In order to further understand the genetic variation of circulating infectious bronchitis virus(IBV)，S1，E，MandNgenes of an IBV strain(GX-NN130048)，which was isolated from chickens with immunoprophylaxis defeat in Guangxi，were amplified by reverse transcriptase polymerase chain reaction(RT-PCR)，and then cloned，sequenced，and similarity comparison，phylogenetic tree，recombination and serotype analysis were conducted.The results showed that the gene sequence of cleavage site within S protein of GX-NN130048 was RRSRR.The nucleotide similarities ofS1，E，MandNgenes with those of other reference strains were 60.8%-90.1%，81.0%-94.2%，86.1%-93.8% and 86.0%-93.3%，respectively.According to the phylogenetic tree analysis，it was clustered into 4/91-type based onS1 gene，while itsE，MandNgenes belonged to LX4-type.Recombination event was detected inS1 gene，which was a recombinant between vaccine strain 4/91 and isolate GX-HC1006(LX4-type).The serotype analysis revealed that the serotype of GX-NN130048 was different from vaccine strains H120 and 4/91.The results indicated that isolate GX-NN130048 was a recombinant strain and variation existed both in structural genes and serotype.Our results also provide the evidence that the vaccine strain 4/91 has been increasingly involved in genetic variation of IBV epidemic strains，which may lead to the emergence of new serotype，and that may be one of the main causes of vaccine break in the field.Therefore，it is necessary to strengthen the monitoring of IBV field isolates and development of new vaccines.

infectious bronchitis virus；recombination；genes；serotype；variation

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.05.018

2014-09-10

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31360611；31160516)；廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2014GXNSFDA118011；2013GXNSFCA019010)

吳翠蘭(1988-)，女，苗族，湖南鳳凰人，碩士生，主要從事禽病與病原分子生物研究，E-mail：cuilanwu@163.com

*通信作者：磨美蘭，E-mail：momeilan@163.com；韋 平，E-mail：pingwei8@126.com

S852.659.6

A

0366-6964(2015)05-0815-09