馮曉聲，劉 琪，王悅蕓，周如月，安欣宇，王貴平，賈愛卿

(廣東海大畜牧獸醫(yī)研究院，廣州 511400)

細(xì)胞適應(yīng)性豬流行性腹瀉病毒部分基因序列分析及其致病力研究

馮曉聲，劉 琪，王悅蕓，周如月，安欣宇，王貴平，賈愛卿*

(廣東海大畜牧獸醫(yī)研究院，廣州 511400)

對已經(jīng)適應(yīng)Vero細(xì)胞生長的豬流行性腹瀉病毒CHYJ130330親本代、第38代、第60代、第80代和第100代病毒的S、M、N基因分別進(jìn)行測序及序列比對分析，結(jié)果顯示M和N基因具有高度的保守性，多次傳代后未發(fā)生氨基酸的改變；S基因在第38代時未發(fā)生任何突變，第100代時發(fā)生了17個核苷酸的點突變，導(dǎo)致15個氨基酸發(fā)生改變。動物試驗顯示，第60代病毒仍能引起仔豬嘔吐、腹瀉等癥狀，而第100代的病毒毒力已經(jīng)減弱。S基因的突變是否與病毒的毒力減弱有關(guān)還需進(jìn)一步試驗驗證。

豬流行性腹瀉病毒；突變；S基因；毒力減弱

豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)是尼多目(Nidovirales)、冠狀病毒科(Coronaviridae)、冠狀病毒屬(Coronavirus)1群的成員，是有囊膜的單股正鏈RNA病毒，基因組大小約為28 kb[1]。豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒引起的豬的一種急性高度接觸性腸道傳染病。以嚴(yán)重的腸炎、嘔吐和水樣腹瀉為主要特征，各年齡的豬均易感，尤以2～7日齡仔豬最易感，表現(xiàn)為高發(fā)病率和高致死率[2-3]，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[4-5]。

PEDV的S蛋白為纖突糖蛋白，介導(dǎo)病毒與細(xì)胞的吸附和融合，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體[6]。M蛋白是病毒含量最高的蛋白質(zhì)，屬于跨膜蛋白質(zhì)，在病毒裝配及出芽過程中發(fā)揮重要的作用，該蛋白質(zhì)也是PEDV刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體保護(hù)的重要結(jié)構(gòu)蛋白之一[1]。N蛋白是冠狀病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白之一，為堿性氨基酸富集的磷酸化蛋白質(zhì)[7-8]，不僅與病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制有關(guān)[9-10]，而且還是具有免疫原性的蛋白質(zhì)[11-12]，也是免疫識別相關(guān)靶點，并且在刺激機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫中起重要作用[13]。

目前使用的商品疫苗毒株CV777是經(jīng)過傳代馴化，適應(yīng)Vero細(xì)胞生長的一個病毒株。有文獻(xiàn)報道冠狀病毒經(jīng)體外多次傳代培養(yǎng)后會出現(xiàn)體外適應(yīng)細(xì)胞生長，體內(nèi)毒力減弱的現(xiàn)象[14]。為了探討PEDV在體外生長的適應(yīng)性和體內(nèi)毒力衰減的機(jī)制，我們對PEDV CHYJ130330株[15]的親本代、第38代、第60代、第80代和第100代的S、M、N基因進(jìn)行了測序和序列分析比對，并對其致病力進(jìn)行了研究，以期找到它們之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒和細(xì)胞 PEDV不同代次病毒為本實驗室在Vero細(xì)胞上連續(xù)傳代獲得，選取親本強(qiáng)毒株CHYJ130330和第38、60、80和100代共5個代次的病毒株進(jìn)行測序分析；DH5α由本實驗室保存；pMD-18T克隆載體、限制性內(nèi)切酶HindⅢ和BamHⅠ、LATaq及dNTPs等試劑均購自大連寶生物有限公司；凝膠回收試劑盒、Viral RNA Kit 購自O(shè)MEGA公司。One-step quickcolor Mycoplasma test kit購自廣州雅怡生物有限公司。

1.1.2 引物 根據(jù)本實驗室測定的親本株序列設(shè)計5對引物，分別對S、M、N基因特異性擴(kuò)增，由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成(表1)。

表1 基因擴(kuò)增引物序列

Table 1 Primer pairs for PCR amplification of the PEDVS，MandNgenes

引物名稱Primername引物序列Primersequence位置Nucleotides片段大小/bpSize退火溫度/℃TmS1-1S1-25'-ATCATTTGGTCAACGTAAACAA-3'5'-GAGAACACTTGTTGGCTAA-3'20634—2064921783—21804117055S2-1S2-25'-ACAATTAATTTCACTGGTC-3'5'-AATGCCGCTGCAGAGAAGT-3'21649—2166823030—23049140055S3-1S3-25'-ATAAAGTGGTTACTAATGGCC-3'5'-TATTGAAAAAGTCAAGAAACA-3'22933—2295424779—24794186155M1M25'-ACTTGTCACCGGTTGTGTAA-3'5'-CCAATTTGCTGGTCCTTATT-3'25687—2570326352—2636768152N1N25'-CGGTCAAAACACGGCGACTA-3'5'-CTACCCTGGAACATAGCCA-3'26379—2639627688—27704132656

1.2 病毒的純化與傳代

將分離所得的親本強(qiáng)毒株CHYJ130330接種于長滿單層Vero細(xì)胞的6孔板內(nèi)，進(jìn)行蝕斑純化試驗。當(dāng)孔內(nèi)出現(xiàn)蝕斑時，挑選較小的蝕斑接種1 mL DMEM中，并進(jìn)行3次反復(fù)凍融。將凍融后的液體離心后取上清重復(fù)上述蝕斑純化試驗，總共重復(fù)3～4輪，直至所有蝕斑的大小和形態(tài)基本一致。然后將蝕斑純化所得的病毒接種于Vero細(xì)胞中進(jìn)行連續(xù)傳代，每傳至20～30代時，重新進(jìn)行蝕斑純化試驗。

取親本強(qiáng)毒株CHYJ130330、第38、60、80和100代病毒進(jìn)行后續(xù)試驗時，均分別檢測細(xì)菌、霉菌、支原體以及外源病毒污染。細(xì)菌、霉菌和外源病毒檢驗均按照《中國獸藥典》(2010版)進(jìn)行；支原體檢測按照One step quickcolour Mycoplamsa test kit說明書進(jìn)行。

1.3 病毒核酸的提取

將PEDV CHYJ130330親本代、第38、60、80和100代病毒液用Viral RNA Kit 按照說明書分別提取病毒核酸，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PEDVS、M、N基因的擴(kuò)增和克隆

分別取5 μL不同代次的上述病毒RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后取1 μL作為模板，分別采用S1/S3、M1/M2和N1/N2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，因S基因過長，所以分3段擴(kuò)增測序后再進(jìn)行拼接。50 μL擴(kuò)增體系：10×LATaqBuffer 5.0 μL、2.5 mmol·L-1dNTPs 4.0 μL、10 pmol·μL-1引物各1.0 μL、反轉(zhuǎn)錄成cDNA 2.0 μL、5 U·μL-1LATaq酶0.5 μL，然后加ddH2O調(diào)整終體積至50 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 30 s，退火50 s(退火溫度見表1)，72 ℃ 30 s，共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中電泳回收，按照凝膠回收試劑盒說明書進(jìn)行，回收產(chǎn)物分別將其連接在pMD-18T克隆載體中，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)質(zhì)粒提取，限制性內(nèi)切酶HindⅢ、BamHⅠ酶切鑒定初步篩選陽性克隆。

1.5 PEDVS、M、N基因的序列測定和分析

經(jīng)鑒定的陽性克隆送英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司進(jìn)行序列測定。測定結(jié)果分別利用MEGA4.1 Clustalx和DNAStar軟件進(jìn)行比對及遺傳進(jìn)化分析。

1.6 動物試驗

將PEDV 的親本代、第38、80和100代的病毒液經(jīng)口服給予5日齡的PEDV陰性仔豬，105.0TCID50病毒液1 mL·頭-1，每天人工哺乳，觀察記錄仔豬嘔吐、腹瀉情況，連續(xù)觀察7 d。并收集仔豬糞便拭子，RT-PCR檢測糞便中的PEDV情況。

2 結(jié) 果

2.1 PEDVS、M、N基因的擴(kuò)增及克隆

分別以CHYJ130330親本代、第38、60、80和100代的病毒cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，S、M、N基因擴(kuò)增產(chǎn)物與目的片段預(yù)期大小相符(圖1、2)。

M.DL2000 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～5.CHYJ130330親本代及第38、60、80和100代病毒；6.陰性對照M.DNA molecular weight marker DL2000；1-5.The parent，38th-passaged，60th-passaged，80th-passaged and 100th-passaged CHYJ130330 strain，respectively；6.Negative圖1 M(A)、N(B)基因RT-PCR結(jié)果Fig.1 RT-PCR products of M (A)，N(B) gene

2.2 序列測定及分析

對測序結(jié)果用MEGA4.1 Clustalx和DNAStar軟件進(jìn)行比對分析。

2.2.1M基因序列比對結(jié)果 不同代次病毒M基因測序發(fā)現(xiàn)，M基因共包含681個核苷酸，編碼226個氨基酸。序列比對結(jié)果顯示，第38代和第100代病毒的M基因第96位核苷酸G 突變?yōu)锳，第38、60、80和100代病毒的第150位核苷酸A突變?yōu)門，但均未發(fā)生氨基酸的改變。

2.2.2N基因序列比對結(jié)果 測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)N基因包含1 326個核苷酸，共編碼441個氨基酸。序列比對結(jié)果顯示，N基因的第21位、534位和1 020位核苷酸分別由G 突變?yōu)?A、C突變?yōu)門、C 突變?yōu)門，且均發(fā)生在第38、60、80和100代病毒中，為同義突變，未發(fā)生氨基酸的改變。

2.2.3S基因序列比對結(jié)果S基因分3段擴(kuò)增(S1、S2、S3)，測序完成后再進(jìn)行拼接，拼接結(jié)果顯示其包含4 161個核苷酸，共編碼1 387個氨基酸(表2)。序列比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)，病毒在第38代未發(fā)生序列改變，第60代和80代分別發(fā)生了12個核苷酸突變，其中10個位點的突變導(dǎo)致了氨基酸改變，分別是249位(F→C)、267位(T→N)、805位(S→I)、887位(S→R)、888位(G→R)、1 010位(I→T)、1 050位(N→T)、1 244位(D→G)、1 362位(C→G)和1 379位(V→A)(表2、圖3)。病毒在100代的時候出現(xiàn)了17個核苷酸改變，導(dǎo)致15個氨基酸發(fā)生改變，除了與上述60代和80代病毒發(fā)生同樣的改變外，分別在142位(A→D)、968位(S→P)、1 028位(L→V)、1 071位(Y→H)和1 354位(C→P)也發(fā)生了氨基酸的改變(表2、圖3)。17個突變位點中3個位于S1區(qū)域內(nèi)，其他12個都在S2區(qū)域內(nèi)(圖4)。

M.DL2000 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.S1；2.S2；3.S3；4.陰性對照M.DNA molecular weight marker DL2000；1.S1；2.S2；3.S3；4.Negative圖2 S基因RT-PCR結(jié)果Fig.2 RT-PCR products of S gene

表2S基因發(fā)生突變的核苷酸和氨基酸數(shù)

Table 2 Lengths and mutations in nucleotides and amino acids of theSgene of CHYJ130330 strain

項目Item親本代病毒Parentvirus不同傳代次數(shù)病毒Differentpassagesofvirus386080100核苷酸數(shù)Nucleotide41614161416141614161氨基酸數(shù)Aminoacids13871387138713871387核苷酸突變數(shù)Nucleotidemutations--121217氨基酸替換Aminoacidsubstitutions--101015非同義替換Nonsynonymoussubstitutions--101015

2.3 PEDV致病性分析

仔豬試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，親本代和第38代的病毒在仔豬灌服病毒液48 h內(nèi)引起了仔豬嘔吐、腹瀉等癥狀，糞便拭子RT-PCR可檢測到PEDV，持續(xù)至7 d。第80代病毒在仔豬灌服5 d后表現(xiàn)出輕微的腹瀉癥狀，可在糞便中檢測到PEDV。灌服第100代病毒的仔豬一直未出現(xiàn)腹瀉現(xiàn)象，糞便拭子中也未檢測到PEDV(表3)。

3 討 論

豬流行性腹瀉病毒N蛋白在其結(jié)構(gòu)蛋白中是唯一包被于病毒包膜內(nèi)的磷酸化蛋白，不僅與病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制有關(guān)[9-10]，而且還是具有免疫原性的蛋白質(zhì)[11-12]，也是免疫識別相關(guān)靶點，并且在刺激機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫中起重要作用[13]。本研究中不同代次PEDVN基因的測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，核苷酸序列發(fā)生了三個位點的點突變，但并未引起任何氨基酸的改變，證實病毒的細(xì)胞傳代培養(yǎng)不會導(dǎo)致N蛋白氨基酸的改變。M基因測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)在第96位和150位發(fā)生了兩個點突變，均為同義替換，未引起氨基酸發(fā)生改變，證實M基因較為保守，這與文獻(xiàn)報道的M基因[13，16]具有高度的保守性一致。

PEDV的S蛋白主要介導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，根據(jù)冠狀病毒其他成員S蛋白保守基序，可將其劃分為S1(22—789 aa)和S2(790—1 333 aa)兩個亞基[17]，S1結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)受體結(jié)合，通過S2結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)膜融合[18]。CHYJ130330第100代病毒的S蛋白共出現(xiàn)了15處氨基酸替換，其中3處位于S1結(jié)構(gòu)域中，12處出現(xiàn)在S2結(jié)構(gòu)域中，S2介導(dǎo)膜融合功能，是否這些點突變引起了細(xì)胞病變的加快及其在Vero細(xì)胞上生長的適應(yīng)性還需進(jìn)一步的試驗驗證。有文獻(xiàn)報道PEDV的S蛋白與體外的生長相適應(yīng)，可使體內(nèi)的毒力減弱[19-20]。本研究中對初生仔豬的攻毒試驗顯示，親本代和第38代的病毒在仔豬灌服病毒液后48 h內(nèi)均能引起仔豬較為嚴(yán)重的嘔吐、腹瀉等癥狀，糞便拭子RT-PCR檢測為陽性，且持續(xù)至7 d。第80代病毒分別在仔豬灌服3和5 d后表現(xiàn)出輕微的腹瀉癥狀，可在糞便中檢測到PEDV。第100代病毒使仔豬偶爾可見腹瀉現(xiàn)象，糞便拭子中檢測不到PEDV，試驗證實該病毒經(jīng)傳代后對仔豬的致病力減弱。是否是S蛋白的改變導(dǎo)致了PEDV對仔豬致病力的改變，亦或是M、N與S蛋白的突變協(xié)同作用所致，我們將進(jìn)行進(jìn)一步的試驗驗證。

點代表與CHYJ130330親本相同的氨基酸Dots represent amino acids that are identical to those in the parent CHYJ130330圖3 各代次病毒S基因編碼蛋白質(zhì)序列比對結(jié)果Fig.3 Alignment of the deduced amino acid sequences of the S protein of the parent and passaged PEDV CHYJ130330 strains with that of the parent

表3 仔豬發(fā)病情況

Table 3 Positive pigs with diarrhea and viral RNA in fecal swab samples

組別(接種病毒)Group(inoculatedvirus)仔豬編號PigNo.致病性指標(biāo)Pathogenicityindex不同攻毒時間的結(jié)果Resultsofdifferentinoculationtime0d1d2d3d4d5d6d7d親本代病毒Parentvirus1Diarrheaa-+++++++++++ViralRNAb-+++++++2Diarrheaa-++++++++++++ViralRNAb-+++++++3Diarrheaa--++++++++++++ViralRNAb-+++++++第38代病毒The38th-passagedvirus1Diarrheaa-++++++++++ViralRNAb-+++++++2Diarrheaa-++++++++++ViralRNAb--+++-++3Diarrheaa--+++++++++ViralRNAb-+++++++第80代病毒The80th-passagedvirus1Diarrheaa---+--+-ViralRNAb-----+++2Diarrheaa-----+++ViralRNAb-----+++3Diarrheaa------+-ViralRNAb-----+++第100代病毒The100th-passagedvirus1Diarrheaa-----+--ViralRNAb--------2Diarrheaa--------ViralRNAb--------3Diarrheaa--------ViralRNAb--------

a.正常糞便(-)，輕微腹瀉(+)，腹瀉(++)；b.豬流行性腹瀉病毒RT-PCR檢測結(jié)果陽性(+)或陰性(-)

a.Normal stool (-)，loose stool (+)，diarrhea (++)；b.Positive (+) or negative (-) results for RT-PCR of PEDV

圖4 S基因各突變位點在S蛋白中的位置Fig.4 Schematic representation of mutations in the S protein of the parent，38th-，60th-，80th-，and 100th-passaged CHYJ130330

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(編輯 白永平)

Mutations in Partial Genes of Porcine Epidemic Diarrhea Virus Associated with Growth Adaptationinvitroand Attenuation of Virulenceinvivo

FENG Xiao-sheng，LIU Qi，WANG Yue-yun，ZHOU Ru-yue，AN Xin-yu，WANG Gui-ping，JIA Ai-qing*

(GuangdongHaidInstituteofAnimalHusbandry&Veterinary，Guangzhou511400，China)

In this study，we further maintained the porcine epidemic diarrhea virus CHYJ130330 in Vero cells up to the 100th passage and analyzed changes in the spike(S)，membrane(M)，and nucleocapsid(N) gene sequences and pathogenicity of the virus at the 38th，60th，80th，and 100th passage levels.Sequence analyses revealed a strong selection for theSgene of CHYJ130330 in Vero cells，and all mutations occurring at the 60th，80th，and 100th-passage virus.In contrast，the viralMandNgenes showed a strong conservation during the serial passage.Pigs that experimentally infected with the 60th and 80th-passage virus，but not the 100th-passaged virus，exhibited vomiting and diarrhea，indicating an attenuation of the CHYJ130330 at the 100th passage.Further studies will be required to define whether the mutations in theSgene of CHYJ130330 that had been selected and accumulated during the serial passages are indeed the causalities of the growth adaptationinvitroand the attenuation of virulenceinvivo.

porcine epidemic diarrhea virus；mutation；spike gene；virus attenuation

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.05.015

2014-08-25

廣州市南沙區(qū)技術(shù)開發(fā)項目(2014KF01)；廣州市產(chǎn)學(xué)研協(xié)同創(chuàng)新重大專項(156100070)

馮曉聲(1982-)，男，內(nèi)蒙古人，助理研究員，主要從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)工作，E-mail：fengxsh@haid.com.cn

*通信作者：賈愛卿，高級獸醫(yī)師，E-mail：jiaaq@haid.com.cn

S852.659.6

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0366-6964(2015)05-0792-08