劉丹丹，趙 元，韓 蕊，張?jiān)妶?/p>

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，動(dòng)物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林省動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春130118)

β-Conglycinin酶解肽對(duì)仔豬空腸上皮細(xì)胞通透性及緊密連接蛋白表達(dá)的影響

劉丹丹，趙 元*，韓 蕊，張?jiān)妶?/p>

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，動(dòng)物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林省動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春130118)

本研究通過(guò)測(cè)定大豆抗原β-Conglycinin酶解肽(52 ku)對(duì)仔豬空腸上皮細(xì)胞(IPEC)通透性及緊密連接蛋白Occludin與ZO-1 基因mRNA表達(dá)的影響，為探索其對(duì)腸道損傷的相關(guān)機(jī)制提供依據(jù)。本試驗(yàn)分別采用不同濃度(0、0.125、0.25、0.5、1、2 mg·mL-1)52 ku酶解肽處理IPEC 2、4、6、8、12、24 h后，通過(guò)測(cè)定細(xì)胞存活力(MTT值)、跨上皮細(xì)胞電阻值(TEER)以及細(xì)胞培養(yǎng)液中堿性磷酸酶(AP)的活性，檢測(cè)52 ku酶解肽對(duì)細(xì)胞膜通透性的影響。并選取0.5 mg·mL-152 ku酶解肽處理IPEC 24 h后，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)Occludin與ZO-1基因 mRNA表達(dá)量的變化情況。結(jié)果表明，52 ku酶解肽處理仔豬空腸上皮細(xì)胞后，MTT值和TEER呈時(shí)間-劑量依賴性降低(P<0.05)。24 h處理后，AP活性呈顯著升高趨勢(shì)(P<0.05)。與對(duì)照組相比，52 ku酶解肽可使Occludin和ZO-1 基因mRNA相對(duì)表達(dá)量均呈顯著下降趨勢(shì)(P<0.05)?？傊?，52 ku酶解肽使仔豬空腸上皮細(xì)胞通透性增加，并降低Occludin或ZO-1的 mRNA表達(dá)。

大豆抗原β-Conglycinin；52 ku酶解肽；仔豬；IPEC；緊密連接

大豆因其蛋白質(zhì)含量豐富而成為機(jī)體主要的蛋白質(zhì)來(lái)源之一，但與此同時(shí)也是人和動(dòng)物的重要過(guò)敏原之一，使得大豆的食用和飼用價(jià)值受到了極大的影響[1]。其中β-伴大豆球蛋白(β-Conglycinin)是主要致敏原之一。近些年研究發(fā)現(xiàn)，β-Conglycinin進(jìn)入機(jī)體消化道后，即使經(jīng)過(guò)消化酶降解后仍存在抗酶解的肽段。其中52 ku酶解肽是經(jīng)胃蛋白酶酶解后仍含量較多的酶解肽段，其上存有胃蛋白酶和胰蛋白酶酶切位點(diǎn)[2-3]，有完整的IgG和IgE抗體結(jié)合表位，并具有免疫活性，對(duì)仔豬過(guò)敏起著重要作用。

腸上皮細(xì)胞之間主要通過(guò)緊密連接進(jìn)行連接的，緊密連接對(duì)維持和調(diào)節(jié)腸道機(jī)械屏障的通透性起重要作用。緊密連接蛋白主要包括跨膜蛋白(如：Occludin蛋白)和胞質(zhì)蛋白(如：ZO-1蛋白)。Occludin蛋白對(duì)腸道屏障功能起到維持和調(diào)節(jié)作用。ZO-1蛋白不僅與腸道屏障功能和通透性功能的變化情況有關(guān)，還在細(xì)胞物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和細(xì)胞增殖分化過(guò)程中起著重要作用。研究表明，膽汁的淤積會(huì)導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞間的緊密連接蛋白ZO-1和Occludin減少，從而使腸上皮細(xì)胞間緊密連接的完整性受到破壞，上皮屏障及其防護(hù)功能受到了損傷[4]。

因此，本試驗(yàn)研究了52 ku酶解肽對(duì)仔豬空腸上皮細(xì)胞活性和細(xì)胞屏障通透性的影響，同時(shí)通過(guò)對(duì)Occludin和ZO-1基因mRNA表達(dá)量的影響來(lái)探討52 ku酶解肽對(duì)腸黏膜機(jī)械屏障損傷的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試驗(yàn)材料

DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶(Gibco，美國(guó))，青霉素和鏈霉素(Sigma，美國(guó))，0.4 μm Millicell插入式培養(yǎng)皿(Millipore，美國(guó))，AP試劑盒(南京建成生物制品有限公司，中國(guó))，總RNA提取試劑盒(OMEGA，美國(guó))，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒(Applied Biosystems，美國(guó))，熒光探針：ZO-1 Assay ID：Ss 03373514；Occludin Assay ID：Ss03377507；β-actin Assay ID：Ss03376081(由美國(guó)Applied Biosystems公司設(shè)計(jì)合成)。

1.2 仔豬空腸上皮細(xì)胞培養(yǎng)

仔豬空腸上皮細(xì)胞(美國(guó)德州農(nóng)工大學(xué))由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)提供，DMEM/F12高糖培養(yǎng)基中添加7%胎牛血清，1%雙抗。在5% CO2飽和濕度，37 ℃條件下培養(yǎng)，待同代細(xì)胞生長(zhǎng)良好至單層后進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3 52 ku酶解肽提純方法

β-Conglycinin由本實(shí)驗(yàn)室參照I.Setsuko等[5]的免疫法從大豆中分離提純，經(jīng)SDS-PAGE鑒定純度達(dá)95%以上，并從純化的β-Conglycinin中分離提純得到52 ku酶解肽，經(jīng)SDS-PAGE鑒定純度達(dá)90.03%以上，且具有免疫活性[6]，可用做本試驗(yàn)刺激物。

1.4 52 ku酶解肽對(duì)仔豬空腸上皮細(xì)胞活性的影響

仔豬空腸上皮細(xì)胞的活性利用MTT比色法檢測(cè)。將細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，待細(xì)胞融合達(dá)95%以上時(shí)，分別用不同濃度(0、0.125、0.25、0.5、1、2 mg·mL-1)的52 ku酶解肽刺激仔豬空腸上皮細(xì)胞，經(jīng)不同時(shí)間(2、4、6、8、12、24 h)處理后，加入20 μL MTT溶液，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h。最后每孔加入150 μL DMSO，并置搖床上低速振蕩10 min以致結(jié)晶物質(zhì)充分溶解。采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在570 nm處測(cè)定各孔的吸光值。每個(gè)處理6個(gè)重復(fù)。

1.5 TEER值的測(cè)定

將同代生長(zhǎng)良好的仔豬空腸上皮細(xì)胞接種于插入式培養(yǎng)皿中，上層分別加入400 μL不同設(shè)定濃度(0、0.125、0.25、0.5、1、2 mg·mL-1)的52 ku酶解肽的完全DMEM/F12培養(yǎng)液，下層均加入800 μL新鮮無(wú)52 ku酶解肽添加的完全培養(yǎng)液。用跨上皮電阻儀測(cè)定培養(yǎng)2、4、6、8、12、24 h的TEER值，每個(gè)測(cè)定孔均取不同方向的3個(gè)點(diǎn)，并取其均值乘以插入式培養(yǎng)皿的膜面積(0.6 cm2)，為待測(cè)樣品的TEER值，以Ω×cm2表示。每個(gè)處理4個(gè)重復(fù)。

1.6 AP活性的測(cè)定

將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的仔豬空腸上皮細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，同上分別加入不同濃度(0、0.125、0.25、0.5、1、2 mg·mL-1)的52 ku酶解肽培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后，分別收集每孔中的培養(yǎng)上清液，并對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液中AP活性進(jìn)行測(cè)定。細(xì)胞AP活性的測(cè)定步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。每個(gè)處理4個(gè)重復(fù)。

1.7 熒光定量PCR

1.7.1 RNA的提取 在仔豬空腸上皮細(xì)胞中加入不同濃度52 ku酶解肽處理24 h后，進(jìn)行總RNA提取，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。小腸上皮細(xì)胞總RNA的提取按照OMEGA總RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，提取后經(jīng)檢測(cè)RNA的完整性良好，可進(jìn)行下步試驗(yàn)。

1.7.2 目的基因cDNA的合成和實(shí)時(shí)熒光定量PCR cDNA合成采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，反應(yīng)體系為20 μL：2 μL 10×RT Buffer，0.8 μL 25×dNTP Mix，2 μL 10×RT Random Primers，1 μL MultiScribeTM Reverse Transcriptase，2 μg Total RNA，Nuclease-free H2O補(bǔ)至20 μL。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：25 ℃ 10 min；37 ℃ 120 min；85 ℃ 5 min。反應(yīng)所得到的cDNA于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)時(shí)熒光定量PCR法分別測(cè)定緊密連接蛋白Occludin與ZO-1基因 mRNA相對(duì)表達(dá)量。參照實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒，反應(yīng)體系為20 μL：10 μL TaqMan Gene Expression Master Mix(2×)，1 μL TaqMan Gene Expression Assay(20×)，7 μL Nuclease-free H2O，2 μL cDNA模板。反應(yīng)程序：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS17.0分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)以“mean±SD”表示，以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié) 果

2.1 52 ku酶解肽對(duì)IPEC活性的影響

相同培養(yǎng)時(shí)間，隨著52 ku酶解肽濃度的增加，MTT值呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。0.25 mg·mL-152 ku酶解肽濃度處理仔豬空腸上皮細(xì)胞8 h后，MTT值顯著降低(P<0.05)。相同濃度52 ku酶解肽處理仔豬空腸上皮細(xì)胞，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，MTT值呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。0.50 mg·mL-152 ku處理仔豬空腸上皮細(xì)胞 6 h 后，MTT值顯著降低(P<0.05)(圖1)。

每個(gè)處理各個(gè)時(shí)間測(cè)定的樣本數(shù)為6 (n=6)。a、b、c、d、e表示處理相同濃度，不同時(shí)間下52 ku酶解肽對(duì)IPEC MTT值的變化，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同字母表示差異顯著(P<0.05)；v、w、x、y、z表示處理相同時(shí)間，不同濃度下52 ku酶解肽對(duì)IPEC MTT值的變化，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同字母表示差異顯著(P<0.05)Number of samples treated by different concentrations and different times is 6 (n=6). a, b, c, d, e. P<0.05 under the same concentration and different times; v, w, x, y, z. P<0.05 under the same time and different concentrations圖1 不同濃度52 ku酶解肽處理不同時(shí)間IPEC膜MTT值的變化Fig.1 The variation of MTT in IPEC membrane treated with different concentrations of 52 ku hydrolyzed peptide for different time

2.2 52 ku酶解肽細(xì)胞TEER值的影響

每個(gè)處理各個(gè)時(shí)間測(cè)定的樣本數(shù)為4(n=4)Number of samples treated by different concentrations and different times is 4(n=4)圖2 不同濃度52 ku酶解肽處理不同時(shí)間IPEC膜TEER值的變化Fig.2 The variation of TEER in IPEC membrane treated with different concentrations of 52 ku hydrolyzed peptide for different times

細(xì)胞的TEER值呈劑量和時(shí)間依賴性的降低趨勢(shì)，如圖2所示。同一處理濃度，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，TEER值呈現(xiàn)降低趨勢(shì)(P<0.05)，濃度為0.5 mg·mL-152 ku酶解肽處理6、8、12、24 h后，細(xì)胞TEER較對(duì)照組相比分別降低了5.31%、5.94%、7.53%和10.07%(P<0.05)。相同濃度條件下，各個(gè)處理時(shí)間的TEER值較對(duì)照組均顯著性降低(P<0.05)。隨著濃度的增加，濃度為0.5、1、2 mg·mL-152 ku酶解肽處理6 h后，各處理組之間差異顯著，且較對(duì)照組相比，TEER值分別降低了5.31%、7.52%和11.73%(P<0.05)，而0、0.125與0.25 mg·mL-1處理組之間以及0.25與0.5 mg·mL-1處理組間差異不顯著(P>0.05)。24 h時(shí)，0.25、0.5、1、2 mg·mL-1與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)。所以也將24 h作為檢測(cè)仔豬空腸上皮細(xì)胞AP活性與緊密連接蛋白基因表達(dá)的刺激時(shí)間。2.3 52 ku酶解肽對(duì)IPEC AP分化的影響

細(xì)胞AP活性隨著52 ku酶解肽濃度的增加呈現(xiàn)顯著性增長(zhǎng)趨勢(shì)，如圖3所示。隨著濃度的增加，52 ku酶解肽24 h處理仔豬空腸上皮細(xì)胞培養(yǎng)液AP值呈現(xiàn)明顯上升趨勢(shì)(P<0.05)。用0.125、0.25 mg·mL-1的52 ku處理24 h后AP活性較對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)，但0.5、1.0 mg·mL-1處理組之間以及1.0與2 mg·mL-1處理組之間差異不顯著(P>0.05)。

圖柱上的不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)，圖4同The different small letters on columns indicate the significant difference(P<0.05)，the same as Figure4圖3 不同濃度52 ku酶解肽處理24 h IPEC培養(yǎng)液中AP的變化(n=4)Fig.3 The variation of AP in IPEC culture medium treated with different concentrations of 52 ku hydrolyzed peptide for 24 h(n=4)

2.4 52 ku酶解肽對(duì)仔豬空腸上皮細(xì)胞Occludin和ZO-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

不同濃度52 ku酶解肽處理24 h后，仔豬空腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白Occludin和ZO-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量結(jié)果如圖4顯示，隨52 ku酶解肽添加濃度的增大，Occludin和ZO-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量成下降趨勢(shì)。1 mg·mL-1OccludinmRNA相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)，其他濃度與對(duì)照組均達(dá)到極顯著水平(P<0.05)。隨52 ku酶解肽添加濃度的增大，ZO-1 mRNA表達(dá)量均與對(duì)照組相比，差異顯著(P<0.05)。

3 討 論

健康狀態(tài)下的腸上皮細(xì)胞旁間隙是封閉的，緊密連接對(duì)相鄰細(xì)胞的相互連接起著重要作用。大豆是飼糧中主要的植物蛋白源，但即使經(jīng)過(guò)相應(yīng)酶類的酶解，仍會(huì)有一些具有免疫活性的酶解肽段會(huì)進(jìn)入腸道，影響動(dòng)物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化與吸收。因此推測(cè)，52 ku酶解肽是通過(guò)影響緊密連接蛋白的表達(dá)，從而使緊密連接的完整性遭到破壞，進(jìn)而增加了腸黏膜屏障的通透性。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，本研究檢測(cè)了52 ku酶解肽對(duì)仔豬空腸上皮細(xì)胞通透性和緊密連接蛋白中最重要的跨膜蛋白ZO-1和Occludin基因mRNA表達(dá)的影響。首先通過(guò)不同時(shí)間、不同濃度52 ku酶解肽刺激細(xì)胞，通過(guò)檢測(cè)MTT、TEER、AP來(lái)驗(yàn)證其細(xì)胞膜完整性。結(jié)果表明，52 ku酶解肽對(duì)仔豬小腸上皮細(xì)胞活性有一定程度的影響，并隨52 ku濃度升高細(xì)胞存活率下降。隨著52 ku酶解肽濃度的提高，培養(yǎng)液中MTT值也逐漸降低。結(jié)果說(shuō)明，52 ku酶解肽不同程度上抑制了仔豬空腸上皮細(xì)胞增殖。徐君研究報(bào)道證明，用大豆抗原蛋白提取物處理小鼠IEC，隨著提取物濃度的提高，不同程度的抑制了小鼠IEC的增殖[7]。這說(shuō)明一定濃度的52 ku酶解肽導(dǎo)致動(dòng)物腸上皮細(xì)胞減少，本試驗(yàn)結(jié)果與其一致。本試驗(yàn)對(duì)刺激24 h的培養(yǎng)液進(jìn)行AP活力測(cè)定，結(jié)果表明，隨著52 ku酶解肽濃度的提高，培養(yǎng)液中AP值也逐漸升高。研究者也通常用AP活力來(lái)反映鼠、鯉魚(yú)等動(dòng)物的腸上皮細(xì)胞完整性[7-8]，AP值隨52 ku酶解肽濃度的增加也逐漸升高，其結(jié)果與本試驗(yàn)研究結(jié)果一致。

圖4 不同濃度52 ku酶解肽處理24 h對(duì)IPEC Occludin和ZO-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量的變化(n=3)Fig.4 The variation of Occludin or ZO-1 mRNA relative expression in IPEC culture medium treated with different concentrations of 52 ku hydrolyzed peptide for 24 h(n=3)

TEER能夠反映細(xì)胞的完整性和通透性。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，0.50 mg·mL-152 ku酶解肽處理仔豬空腸上皮細(xì)胞培養(yǎng)液TEER值明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。同時(shí)，隨著52 ku酶解肽濃度的提高，培養(yǎng)液中TEER值也逐漸降低。試驗(yàn)表明，52 ku酶解肽損傷了仔豬空腸上皮細(xì)胞的屏障功能，導(dǎo)致其通透性增加；隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)細(xì)胞屏障功能逐漸降低。TEER值的降低與細(xì)胞膜通透性的升高揭示緊密連接蛋白復(fù)合物的改變。有研究證明，隨著大豆球蛋白濃度的增加TEER值下降，這會(huì)造成仔豬空腸上皮細(xì)胞通透性增加，使抗原更容易進(jìn)入血液中導(dǎo)致仔豬過(guò)敏[9]。

目前有研究表明，斷奶仔豬容易產(chǎn)生腸易激綜合癥，導(dǎo)致腸上皮緊密連接蛋白破壞及表達(dá)量降低[10]，腸道通透性增強(qiáng)，仔豬腹瀉。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，除52 ku酶解肽濃度為1 mg·mL-1時(shí)緊密連接蛋白OccludinmRNA相對(duì)表達(dá)量無(wú)明顯變化，其他各濃度腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白Occludin或ZO-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量也顯現(xiàn)下降趨勢(shì)，且差異顯著，ZO-1或OccludinmRNA相對(duì)表達(dá)量下降引發(fā)腸黏膜屏障破壞，與R.Yang等[11]的結(jié)果一致。也有學(xué)者用β-Conglycinin刺激細(xì)胞，結(jié)果導(dǎo)致ZO-1和Occludin表達(dá)量下降，破壞了腸道屏障[12]。這些都證明，蛋白表達(dá)量下降反映了食物致敏原對(duì)仔豬腸道屏障造成了一定程度的損傷。

4 結(jié) 論

52 ku β-Conglycinin酶解肽能破壞仔豬空腸上皮細(xì)胞緊密連接的完整性，加大腸道通透性，破壞屏障功能，降低腸上皮緊密連接蛋白Occludin或ZO-1 基因mRNA的表達(dá)。

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(編輯 郭云雁)

Effects of β-conglycinin Hydrolyzed Peptide on the Permeability and Expression of Tight Junction Protein in Piglet Intestinal Epithelial Cells

LIU Dan-dan，ZHAO Yuan*，HAN Rui，ZHANG Shi-yao

(KeyLaboratoryofAnimalProduction，ProductQualityandSecurityofMinistryofEducation，KeyLaboratoryofAnimalNutritionandFeedsScienceinJilinProvince，CollegeofAnimalScienceandTechnology，JilinAgriculturalUniversity，Changchun130118，China)

The objective of this study was to evaluate the effects of β-Conglycinin hydrolyzed peptide(52 ku) on the permeability and expression of tight junction proteinOccludinandZO-1 in piglet intestinal epithelial cells(IPEC)，which would provide a basis for exploring the mechanisms of intestinal damage.IPEC were treated with different concentrations(0，0.125，0.25，0.5，1 and 2 mg·mL-1) hydrolyzed peptide for 2，4，6，8，12，24 h.The effects of hydrolyzed peptide(52 ku) on cell membrane permeability were determined by measuring the cell viability(MTT values)，transepithelial resistance values(TEER) and alkaline phosphatase(AP) activity in cell culture medium.The mRNA expression ofOccludinandZO-1 were detected by real-time PCR after IPEC treated with 0.5 mg·mL-1hydrolyzed peptide for 24 h.The results showed that MTT and TEER of intestinal epithelial cells treated with hydrolyzed peptide(52 ku) with 0.5 mg·mL-1were decreased by a time-dose dependent manner(P<0.05).With the increase concentration of hydrolyzed peptide(52 ku)，AP activity in 24 h treatment group had a significant increased trend(P<0.05) by dose dependent manner.Also，hydrolyzed peptide(52 ku) could decrease the relative expression ofOccludinandZO-1 mRNA in IPEC(P<0.05).In conclusion，hydrolyzed peptide(52 ku) destructed the permeability and reducedOccludinorZO-1 mRNA expression of tight junction protein in IPEC.

soybean allergic β-Conglycinin；52 ku hydrolyzed peptide；piglets；IPEC；tight junctions

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.05.012

2014-07-08

國(guó)家自然科學(xué)基金青年資金項(xiàng)目(31101719)；省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目青年科研基金(201201098)；吉林省教育廳“十二五”科學(xué)技術(shù)研究規(guī)劃項(xiàng)目

劉丹丹(1988-)，女，吉林松原人，碩士生，主要從事飼料抗?fàn)I養(yǎng)因子研究，E-mail：ddliu19880922@163.com

*通信作者：趙 元，博士，副教授，E-mail：zhaoyuan4CL52@126.com

S828；S815.4

A

0366-6964(2015)05-0768-06