皮文輝，周 平，王立民，唐 紅，郭延華，張譯元，劉守仁，王新華

(新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)綿羊遺傳改良和健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子 832000)

TALENs編輯綿羊成纖維細(xì)胞FGF5基因

皮文輝，周 平，王立民，唐 紅，郭延華，張譯元，劉守仁，王新華*

(新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)綿羊遺傳改良和健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子 832000)

類(lèi)轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物(Transcription activator-like effector，TALE)已經(jīng)成為基因組編輯和基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的有效工具，在多個(gè)物種的基因組中實(shí)現(xiàn)特定位點(diǎn)的刪除、插入和突變。針對(duì)綿羊成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子5(Fibroblast growth factor 5，F(xiàn)GF5)基因起始密碼子ATG位點(diǎn)，設(shè)計(jì)構(gòu)建TALENs(Transcription activator-like effector nucleases，TALENs)。通過(guò)比較分析正常培養(yǎng)和基因組編輯處理的綿羊成纖維細(xì)胞，電轉(zhuǎn)TALENs組合，Surveyor突變檢測(cè)，篩選獲得1對(duì)有效的TALENs。有限稀釋細(xì)胞傳代培養(yǎng)，PCR擴(kuò)增FGF5基因片段，經(jīng)PAGE檢測(cè)篩選發(fā)生突變的細(xì)胞，測(cè)序確認(rèn)FGF5基因ATG位點(diǎn)產(chǎn)生缺失突變細(xì)胞。獲得具有編輯活性的TALENs，為該基因的定點(diǎn)編輯奠定基礎(chǔ)。Surveyor檢測(cè)和測(cè)序結(jié)果表明，在綿羊FGF5基因ATG起始密碼子上游104堿基位點(diǎn)，存在1個(gè)G/C單核苷酸多態(tài)。

類(lèi)轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶；基因組編輯；成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子5基因；單核苷酸多態(tài)；綿羊

J.M.Hébert等[1]針對(duì)小鼠胚胎干細(xì)胞的FGF5基因第一外顯子，采用基因打靶，成功導(dǎo)入含多個(gè)終止密碼子的干擾基因，利用重構(gòu)ES細(xì)胞制作嵌合體小鼠，通過(guò)繁育嵌合體小鼠，獲得FGF5基因敲除的純合體小鼠，證實(shí)缺失FGF5基因使毛囊生長(zhǎng)Ⅵ期延長(zhǎng)，F(xiàn)GF5因子對(duì)毛發(fā)生長(zhǎng)具有抑制作用。T.A.Rosenquist等[2]發(fā)現(xiàn)FGF5的受體FGFRl(Fibroblast growth factor receptor 1，F(xiàn)GFR1)在毛囊真皮乳頭中表達(dá)，表明FGF5誘導(dǎo)毛乳頭促進(jìn)毛囊生長(zhǎng)期向退行期轉(zhuǎn)變。狗、貓等長(zhǎng)毛性狀與FGF5基因突變相關(guān)[3-4]。高愛(ài)琴等發(fā)現(xiàn)綿羊FGF5基因存在多態(tài)性[5]。

在基礎(chǔ)和應(yīng)用研究方面，基因組編輯(Genome editing)技術(shù)能夠快速地實(shí)現(xiàn)遺傳修飾。其中以TALE結(jié)合DNA的高度專(zhuān)一性為理論基礎(chǔ)[6-7]，加之研究開(kāi)發(fā)的模塊化構(gòu)建程序，使TALEs成為基因組編輯(Genome editing)和基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控(Transcriptional modulation)的有效工具[8-12]。TALENs靶向結(jié)合DNA，產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂(DNA double-srand breaks，DSBs)。所有真核細(xì)胞內(nèi)，DSBs激活兩條保守的DNA修復(fù)通路。非同源末端連接修復(fù)(Non-homologous end joining，NHEJ)能夠?qū)嗔训娜旧w重新連接，在斷裂位點(diǎn)產(chǎn)生小片段插入或刪除，定點(diǎn)改變基因組的DNA序列。這一技術(shù)已迅速在多個(gè)物種中(絕大部分在個(gè)體水平)成功應(yīng)用，開(kāi)啟了反向遺傳學(xué)研究的新天地，在基礎(chǔ)理論研究、臨床治療和農(nóng)牧漁業(yè)等領(lǐng)域必將有越來(lái)越廣闊的應(yīng)用前景，并且產(chǎn)生不可估量的深遠(yuǎn)影響[11]。

本研究針對(duì)綿羊FGF5基因的ATG起始密碼子位點(diǎn)，設(shè)計(jì)構(gòu)建了4對(duì)TALENs。通過(guò)綿羊成纖維細(xì)胞測(cè)試，獲得FGF5基因ATG起始密碼子發(fā)生突變的細(xì)胞，將有助于綿羊FGF5基因功能的研究。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

TALE Toolbox kit(No.1000000019)由Addgene非營(yíng)利組織提供。QuickExtract DNA 抽提液(Epicentre，cat.No.QE09050)、Surveyor 凝膠電泳突變檢測(cè)試劑盒(Transgenomic，cat.No.706025)。Herculase II fusion polymerase(Agilent Technologies)、Pfu高保真DNA聚合酶(TIANGEN，Co.No.EP101)、Esp3 I(BsmB I，F(xiàn)ermentas)和AfeI(Fermentas)、BsaI-HF(NEW England Biolabs)、T7 DNA ligase(Enzymatics)、PlasmidSafe ATP-dependent DNase(Epicentre)、DNA A-Tailing Kit(TaKaRa)。瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒(生工生物工程(上海)公司)，DL2000 DNA marker(寶生物工程(大連)公司)，100 bp Plus DNA Ladder Marker(研域(上海)化學(xué)試劑公司)，DH5α大腸桿菌(Escherichiacoli)感受態(tài)細(xì)胞(天根生化科技(北京)公司)，核酸染料GELVIEW(北京百泰克生物技術(shù)公司)，引物合成和測(cè)序由Invitrogen公司完成。DMEM高糖培養(yǎng)液(Gibco，12800-017)，胎牛血清(Biological Industries，04-001-1A)。

1.2 方法

1.2.1 TALENs設(shè)計(jì) 針對(duì)綿羊FGF5基因ATG起始密碼子位點(diǎn)，利用TAL effector Nucleotide Targer 2.0(https：//tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen)設(shè)計(jì)TALENs組合，5′端保留T堿基。圍繞FGF5基因起始密碼子ATG位點(diǎn)周?chē)?，設(shè)計(jì)4對(duì)TALENs組合：TALFGF5F1/TALEFGF5R1、TALFGF5F1/TALEFGF5R2、TALFGF5F2/TALEFGF5R3和TALFGF5F2/TALEFGF5R4。受5′端保留T堿基條件限制，造成TALFGF5F1/TALEFGF5R1和TALFGF5F1/TALEFGF5R2兩對(duì)TALENs組合切割位點(diǎn)位于ATG起始密碼子上游。圖1是TALENs靶向DNA序列。

1.2.2 TALENs構(gòu)建 根據(jù)相關(guān)報(bào)道的程序，應(yīng)用Golden Gate克隆法和PCR構(gòu)建TALENs[9-11]。構(gòu)建程序：首先用Herculase II fusion polymerase PCR擴(kuò)增得到單體模塊DNA。接著用“Golden Gate”克隆法將N1N2N3N4N5N6、N7N8N9N10N11N12和N13N14N15N16N17N18分別組裝形成3個(gè)環(huán)形六聚體。每個(gè)“Golden Gate”反應(yīng)體系中，BsmB I酶切6條單體DNA片段，產(chǎn)生黏性末端依次互補(bǔ)的DNA片段，這些黏性末端順次連接，形成不含BsmB Ⅰ酶切位點(diǎn)的重復(fù)單元串聯(lián)環(huán)形六聚體。然后以環(huán)形六聚體為模板，熱啟動(dòng)PfuDNA聚合酶PCR擴(kuò)增得到線(xiàn)性六聚體。用BsaⅠ酶切TALENs骨架質(zhì)粒和3條線(xiàn)性六聚體，產(chǎn)生黏性末端依次互補(bǔ)的DNA片段，再用“Golden Gate”克隆法順次連接DNA片段的黏性末端。AfeⅠ酶切鑒定構(gòu)建TALENs質(zhì)粒的正確性。

圖1 綿羊FGF 5基因ATG起始密碼子位點(diǎn)的TALENs靶序列Fig.1 TALENs targeting the ATG initiation codon of ovine FGF 5 gene

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng) 選取2周歲超細(xì)型細(xì)毛羊公羊，無(wú)菌操作采其耳緣組織，剪碎，采用組織塊培養(yǎng)法，獲得原代成纖維細(xì)胞。經(jīng)過(guò)3次傳代培養(yǎng)獲得的成纖維細(xì)胞，用于TALENs電轉(zhuǎn)處理。綿羊成纖維細(xì)胞培養(yǎng)采用DMEM培養(yǎng)液，15%胎牛血清，37 ℃、5.0% CO2飽和濕度培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合度90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶液消化細(xì)胞，400 g 離心10 min，洗滌收集細(xì)胞，用于電轉(zhuǎn)染和細(xì)胞基因組檢測(cè)。

1.2.4 電轉(zhuǎn)染 按照Amax Nucleofector II電轉(zhuǎn)儀操作說(shuō)明，1∶50倍預(yù)混S1溶液和S2溶液。收集2×106個(gè)細(xì)胞，用100 μL電轉(zhuǎn)液懸浮細(xì)胞，加入5 μg除內(nèi)毒素的TALENs質(zhì)粒(每個(gè)TALEN加2.5 μg)，混勻轉(zhuǎn)入電擊杯中。選擇小鼠胚胎成纖維細(xì)胞電轉(zhuǎn)程序CZ-165，對(duì)綿羊成纖維細(xì)胞實(shí)施電轉(zhuǎn)。靜置10 min，加入培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，將細(xì)胞轉(zhuǎn)入6孔培養(yǎng)板，31 ℃、5.0% CO2飽和濕度培養(yǎng)96 h。1.2.5 Surveyor檢測(cè)TALENs活性 取1/3細(xì)胞收集于200 μL PCR管中，用20 μL QuickExtract DNA 抽提液懸浮細(xì)胞，68 ℃ 15 min、95 ℃ 8 min裂解細(xì)胞。細(xì)胞裂解液做模板，熱啟動(dòng)PfuDNA聚合酶擴(kuò)增靶點(diǎn)DNA序列，引物FGF5svF/FGF5svR：ATTCGCCCTCTCCCATCTCCTC/CG-ATGCCCACTCTGCAGTAGAG。PCR反應(yīng)：95 ℃ 2 min；95 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，68 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；68 ℃ 3 min。PCR擴(kuò)增DNA片段長(zhǎng)629 bp，ATG起始密碼子位于該DNA片段5′端332～334位堿基。根據(jù)高愛(ài)琴報(bào)道，本研究擴(kuò)增的DNA片段5′端340位堿基可能存在TG多態(tài)(圖2)[5]。綿羊野生型基因組DNA擴(kuò)增作為陽(yáng)性對(duì)照。凝膠電泳膠回收純化DNA目的片段。為了實(shí)現(xiàn)DNA異源雙鏈和同源雙鏈雜交。取300 ng膠回收純化DNA，用1×Pfubuffer稀釋至20 μL體積，采用PCR儀控溫進(jìn)行緩慢變性復(fù)性過(guò)程[10]。混合Surveyor突變檢測(cè)試劑成份，42 ℃水浴1 h，加2 μL終止液停止Surveyor 核酸內(nèi)切酶反應(yīng)。10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測(cè)確定TALENs組合的活性。

FGF5svF、FGF5svR.PCR擴(kuò)增629 bp DNA目的片段的引物；FGF5cxF、FGF5cxR.PCR擴(kuò)增406 bpDNA目的片段的引物；ATG.綿羊FGF 5基因起始密碼子；T/G.SNP位點(diǎn)[5]；G/C.SNP位點(diǎn)FGF5svF and FGF5svR.A pair of primers for 629 bp DNA fragment amplified by PCR；FGF5cxF and FGF5cxR.A pair of primers for 406 bp DNA fragment amplified by PCR；ATG.The initiation codon of ovine FGF 5；T/G.A point mutation identified by A.Q.Gao[5]；G/C mutation.Identified by the experiment圖2 PCR擴(kuò)增FGF 5基因示意圖Fig.2 DNA fragment schematic diagram of ovine FGF 5 gene amplified by PCR

1.2.6 細(xì)胞篩選 將TALENs處理有效的試驗(yàn)組細(xì)胞經(jīng)有限稀釋接種于96孔培養(yǎng)板。細(xì)胞培養(yǎng)采用添加15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，37 ℃、5.0%CO2飽和濕度培養(yǎng)。經(jīng)15 d培養(yǎng)，換液1次。96孔板中細(xì)胞生長(zhǎng)至2/3底面積時(shí)，0.25%胰蛋白酶消化，直接傳代至24孔板，6 h后換新鮮培養(yǎng)液。細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)12～18 d，生長(zhǎng)至匯合度90%時(shí)，胰酶消化細(xì)胞，取2/3細(xì)胞凍存，剩余1/3細(xì)胞裂解。試驗(yàn)期共獲得71孔細(xì)胞。用引物FGF5cxF：GTGCACGGAGCAGTGAGAT，F(xiàn)GF5cxR：AGAAGAGG-AAGACACGGTGC，PCR反應(yīng)：95 ℃ 2 min；95 ℃ 20 s，56 ℃ 20 s，68 ℃ 40 s，35個(gè)循環(huán)；68 ℃ 3 min。PCR擴(kuò)增406 bp DNA片段，10% SDS-PAGE電泳檢測(cè)，篩選基因型突變細(xì)胞。采用DNA A-Tailing Kit 處理，PCR擴(kuò)增DNA片段，實(shí)現(xiàn)末端加A，T載體連接測(cè)序。

2 結(jié) 果

2.1 TALENs活性檢測(cè)

1.TALFGF5F1/TALFGF5R1；2.TALFGF5F1/TALFGF5R2；3.TALFGF5F2/TALFGF5R4；4、5.TALFGF5F2/TALFGF5R3；6.綿羊肌肉組織基因組PCR擴(kuò)增片段的Surveyor檢測(cè)結(jié)果；7.綿羊FGF 5基因組的PCR擴(kuò)增片段變性復(fù)性電泳圖；M1、M2.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)1，2，4，5.Invalid TALEN combinations.3.Cleavage activity by TALFGF5F2 and TALFGF5R4 combination；6.Surveyor result of wild-type genome of sheep；7.PCR production with primers FGF5svF and FGF5svR from muscle DNA of sheep；M1，M2.DL2000 and 100 bp Plus DNA Ladder marker圖3 Surveyor檢測(cè)TALENs的裂解活性電泳圖Fig.3 Gel showing the Surveyor nuclease result from different TALEN pairs

Surveyor突變檢測(cè)電泳顯示(圖3)，3號(hào)泳道樣本存在不同的DNA異源雙鏈雜交酶切帶型，說(shuō)明TALFGF5F2/TALFGF5R4組合成功誘導(dǎo)斷裂綿羊成纖維細(xì)胞的FGF5基因DNA雙鏈，產(chǎn)生突變重組結(jié)果。6號(hào)泳道是綿羊肌肉組織基因組PCR擴(kuò)增片段的Surveyor檢測(cè)結(jié)果，7號(hào)泳道是綿羊FGF5基因組的PCR擴(kuò)增片段變性復(fù)性電泳圖，說(shuō)明擴(kuò)增片段自身也含有多態(tài)。如果該多態(tài)位點(diǎn)是T/G，其Surveyor突變檢測(cè)電泳條帶應(yīng)該是包含340和289 bp。而第6泳道電泳條帶大小是400和220 bp左右。這與高愛(ài)琴等[5]發(fā)現(xiàn)的綿羊FGF5基因第1外顯子中的T/G多態(tài)性結(jié)果不相符。根據(jù)第6、7泳道判斷，PCR擴(kuò)增的該綿羊個(gè)體基因組的FGF5 基因629 bp片段存在多態(tài)位點(diǎn)，且是雜合子，目的基因PCR擴(kuò)增Surveyor檢測(cè)片段自身存在多態(tài)性，變性退火后產(chǎn)生異源雙鏈DNA雜交分子(圖3)。

設(shè)計(jì)TALENs作用于ATG位點(diǎn)，如果TALENs有活性，用Surveyor突變檢測(cè)，電泳結(jié)果將產(chǎn)生290和330 bp左右的DNA片段。由于3號(hào)泳道含有大小接近于290和330 bp的DNA條帶，說(shuō)明TALFGF5F2/TALFGF5R4組合具有酶切活性。由于Surveyor酶切條帶較多，較難使用光密度值對(duì)DNA電泳條帶進(jìn)行定量，所以未計(jì)算TALFGF5F2/TALFGF5R4組合的活性。

2.2 細(xì)胞篩選結(jié)果

有限稀釋法將TALENs處理的細(xì)胞接種于96孔板，增殖傳代至24孔培養(yǎng)板。收集2/3的細(xì)胞凍存，1/3的細(xì)胞進(jìn)行PCR檢測(cè)。PCR擴(kuò)增后PAGE電泳分析DNA帶型。從71孔細(xì)胞中得到3個(gè)明顯不同于其它樣品的帶型。圖4中的12、40和64號(hào)細(xì)胞樣品的DNA帶型不同于肌肉組織樣品(“+”泳道)和2號(hào)樣品。

M.100 bp Plus DNA Ladder；+.綿羊肌肉組織樣品；2、12、40、64.有限稀釋后獲得的不同細(xì)胞樣品M.100 bp Plus DNA Ladder marker；+.Ovine muscle；2，12，40，64.Different cell samples圖4 綿羊成纖維細(xì)胞FGF 5基因PCR片段PAGE檢測(cè)結(jié)果Fig.4 PAGE result of FGF 5 gene fragment of ovine fibroblasts with FGF5cxF and FGF5cxR primers

2.3 測(cè)序結(jié)果

不同細(xì)胞基因組擴(kuò)增DNA片段連接T載體測(cè)序。序列比對(duì)結(jié)果如圖5A，缺失堿基位點(diǎn)見(jiàn)圖5B。分析顯示，12反向測(cè)序，黑色豎線(xiàn)標(biāo)記處缺失A堿基；40正向測(cè)序，標(biāo)記處缺失35個(gè)堿基；64反向測(cè)序缺失38個(gè)堿基。其中40和64缺失堿基包含ATG起始密碼子位點(diǎn)(圖5a，方框內(nèi)ATG是起始密碼子)。測(cè)序結(jié)果驗(yàn)證了圖3檢測(cè)結(jié)果，確定獲得針對(duì)綿羊FGF5基因ATG起始密碼子位點(diǎn)有活性的TALENs。

A．不同細(xì)胞FGF 5起始密碼子位點(diǎn)部分堿基序列比對(duì)。野生型序列位于頂行，其余是不同克隆細(xì)胞的序列。B.不同細(xì)胞測(cè)序峰圖。.堿基缺失位置A.Sequence comparison within the ATG initiation codon of ovine FGF 5 sequence of the mutations from different cells.The wild-type sequence was shown at the top.Other sequences are different cells；B.Sequence map of different cells.Black lines showed deletion sites of different cells圖5 測(cè)序結(jié)果序列比對(duì)圖和測(cè)序圖Fig.5 Sequence comparison and sequence map of different cells

比對(duì)測(cè)序結(jié)果，證實(shí)在綿羊FGF5基因ATG起始密碼子上游104堿基位點(diǎn)存在一個(gè)G/C點(diǎn)突變(圖6)。對(duì)該位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)進(jìn)行Surveyor突變檢測(cè)理論分析，酶切DNA片段(629 bp)應(yīng)該產(chǎn)生228和401 bp大小的DNA條帶。這與圖3電泳結(jié)果相符。

圖6 綿羊FGF 5基因ATG起始密碼子上游104 bp處點(diǎn)突變測(cè)序圖Fig.6 A point mutation was identified at 104 base site of the ATG initiation codon upstream of ovine FGF 5 gene

3 討 論

綿羊毛長(zhǎng)是一個(gè)數(shù)量性狀，長(zhǎng)期選育改善了該性狀的表型。綿羊被毛生長(zhǎng)的生理過(guò)程和性狀的遺傳機(jī)理復(fù)雜。從分子水平上探索羊毛的發(fā)生、生長(zhǎng)機(jī)制，對(duì)進(jìn)一步發(fā)掘細(xì)毛羊的遺傳潛力具有理論意義。

FGF5基因是小鼠、大鼠皮膚毛囊周期性生長(zhǎng)的重要調(diào)控因子，參與調(diào)控毛囊從興盛期向休眠期轉(zhuǎn)化，其蛋白直接或間接誘導(dǎo)退行期的啟動(dòng)，對(duì)毛發(fā)生長(zhǎng)具有抑制作用[1-2]。綿羊群體中存在FGF5基因多態(tài)性，該基因?qū)ρ蛎L(zhǎng)作用有待進(jìn)一步研究證實(shí)[5]。本研究中新發(fā)現(xiàn)的SNP處于綿羊FGF5基因mRNA 5′UTR區(qū)(JQ941956)，其生物學(xué)功能需要進(jìn)一步試驗(yàn)確認(rèn)。

將目的基因定點(diǎn)突變或敲除，是研究基因功能的直接途徑之一。J.M.Hébert等[1]構(gòu)建的FGF5基因敲除純合體小鼠，為證實(shí)FGF5基因抑制毛發(fā)生長(zhǎng)提供了直接生物學(xué)證據(jù)。新的基因編輯技術(shù)，拓寬了基因敲除技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域。TALENs技術(shù)已經(jīng)成功用于斑馬魚(yú)、小鼠、家蟬、豬和牛等動(dòng)物，產(chǎn)生基因組定點(diǎn)突變[13-17]。應(yīng)用TALENs技術(shù)定點(diǎn)突變綿羊成纖維細(xì)胞FGF5基因，篩選得到有生物學(xué)活性的TALENs組合，實(shí)現(xiàn)FGF5基因定點(diǎn)突變，獲得起始密碼子ATG缺失的細(xì)胞基因組測(cè)序證據(jù)，為獲得該位點(diǎn)發(fā)生突變的綿羊成纖維細(xì)胞和直接闡明綿羊FGF5基因?qū)ρ蛎L(zhǎng)影響提供基礎(chǔ)。

家畜成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染人工核酸酶后，在30 ℃低溫環(huán)境培養(yǎng)，提高了基因組編輯效率[18-19]。這一簡(jiǎn)單措施被多次采用[17，20]。本實(shí)驗(yàn)室環(huán)境封閉，培養(yǎng)箱設(shè)定30 ℃時(shí)，持續(xù)報(bào)警，很難穩(wěn)定。為了利用低溫培養(yǎng)提高人工核酸酶編輯效率這個(gè)結(jié)論，本研究采用31 ℃低溫培養(yǎng)。

2013年10月6日-11月6日，實(shí)驗(yàn)室選擇FGF5基因起始密碼子敲除的64號(hào)細(xì)胞克隆株作為核供體，進(jìn)行了體細(xì)胞核移植，并移植克隆胚300枚，受體綿羊30只，未獲得妊娠結(jié)果。

應(yīng)用TALENs敲除綿羊FGF5基因起始密碼子，為研究綿羊FGF5基因功能提供了可能性。要獲得FGF5基因?qū)d羊毛發(fā)生長(zhǎng)的功能性研究結(jié)果，需要進(jìn)一步完善試驗(yàn)過(guò)程多個(gè)環(huán)節(jié)，如優(yōu)良的細(xì)胞、單細(xì)胞傳代培養(yǎng)等。在哺乳動(dòng)物受精卵原核期，胞質(zhì)注射TALENs 的mRNA，是獲得基因靶向定點(diǎn)突變個(gè)體動(dòng)物的有效途徑[17，20]。應(yīng)用有效編輯綿羊FGF5基因位點(diǎn)的TALENs，對(duì)綿羊原核期受精卵實(shí)施胞質(zhì)內(nèi)注射mRNA，可能是獲得FGF5基因突變個(gè)體綿羊的更好途徑。研究獲得的有效TALENs、確定新SNP位點(diǎn)，將為推進(jìn)綿羊FGF5基因功能研究提供基礎(chǔ)。

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(編輯 程金華)

Editing Fibroblast Growth Factor 5 Gene in Ovine Fibroblasts Using TALENs

PI Wen-hui，ZHOU Ping，WANG Li-min，TANG Hong，GUO Yan-hua，ZHANG Yi-yuan，LIU Shou-ren，WANG Xin-hua*

(KeyLaboratoryofSheepGeneticImprovementandHealthyProduction，XinjiangAcademyofAgriculturalandReclamationScience，Shihezi832000，China)

Transcriptional activator-like effector (TALE) technologies were established over the last decade as useful tools for genomic editing and transcriptional modulation.Moreover，TALE nucleases (TALENs) technology can be used to bring about targeted gene deletion，insertion and mutagenesis in a siries of species genome.TALENs were designed to target the ATG initiation codon site of ovineFGF5 gene.According to the results of comparing normal culture and genome editing ovine fibroblasts，the activities of TALEN pairs were tested and screened by Surveyor nuclease after electric transfection TALEN plasmid pairs into ovine fibroblasts.After ovine fibroblast clones were cultured by limiting dilution，the screening of mutant cells was identified by PAGE electrophoresis after PCR amplification.The deletion mutations were introduced into ovineFGF5 gene of fibroblasts and identified by DNA sequencing.Mutated cells missing the ATG initiation codon of ovineFGF5 were obtained by valid TALENs.The acquisition of a pair of valid TALENs provides the basis for targeted disruption ovineFGF5 gene.A point mutation was identified at 104 base site of the ATG initiation codon upstream of ovineFGF5 gene by Surveyor mutation detection and sequence analysis.

transcription activator-like effector nuclease(TALEN)；genome editing；fibroblast growth factor 5 (FGF5) gene；single nucleotide polymorphism(SNP)；sheep

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.05.004

2014-11-02

兵團(tuán)國(guó)際合作(2013BC004)；新疆兵團(tuán)綿羊繁育生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(2013KLS01)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31360276)；國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)(2015CB150300)

皮文輝(1972-)，男，新疆石河子人，博士，研究員，主要從事動(dòng)物遺傳育種研究，E-mail：wzjpwh@163.com

*通信作者：王新華，研究員，主要從事轉(zhuǎn)基因動(dòng)物方面的研究，E-mail：wangxinhua5751@163.com

S826.2

A

0366-6964(2015)05-0704-07