張 天，李祥龍，周榮艷，李蘭會

(1.河北科技師范學(xué)院，秦皇島066600； 2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，保定 071000； 3.晉州市職教中心，晉州 052260)

不同毛色山羊皮膚組織Agouti基因剪接體類型研究

張 天1，2，3，李祥龍1，2*，周榮艷2，李蘭會2

(1.河北科技師范學(xué)院，秦皇島066600； 2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，保定 071000； 3.晉州市職教中心，晉州 052260)

本研究旨在探討白色和黑色山羊皮膚組織Agouti基因所具有的不同剪接體類型。采用PCR擴(kuò)增和5′RACE方法分別獲得白色和黑色山羊皮膚組織Agouti基因部分基因組序列及mRNA 序列，并進(jìn)行拼接比對。結(jié)果，分別獲得了長度為27 793和27 858 bp的白色和黑色山羊Agouti基因序列，發(fā)現(xiàn)4段序列(88、180、81和79 bp)與綿羊mRNA序列相匹配，這些片段與5′RACE所檢測到的外顯子1可變剪接體長度對應(yīng)，其中的180、81和79 bp為新發(fā)現(xiàn)片段。白色山羊檢測到It、It′、IA、2C和IE 5種類型剪接體，黑色山羊僅檢測到It和It′ 2種類型剪接體。剪接體之間和剪接體內(nèi)部均存在長度變異。結(jié)果提示，IA、2C和IE可變剪接可能與山羊毛色形成有關(guān)。

山羊；Agouti基因；皮膚組織；剪接體類型

動物毛色主要通過肉眼來識別，是鑒定品種外貌的重要標(biāo)志，它在識別品種純度、親緣關(guān)系，確定雜交組合、評價產(chǎn)品質(zhì)量等方面有一定優(yōu)勢，是最能夠引起人類關(guān)注的品種特征之一[1-2]。毛色對于許多動物來說是一項重要的生產(chǎn)及可利用的質(zhì)量性狀，是哺乳動物中第一個作為遺傳學(xué)分析的表型性狀[3]。Agouti基因編碼周圍黑素細(xì)胞真皮乳頭細(xì)胞分泌的Agouti信號蛋白(Agouti signal protein，ASIP)，這是一種旁分泌信號分子[4]，此蛋白與黑素細(xì)胞刺激素α(α-melanocyte stimulating hormone，α-MSH)競爭性地結(jié)合黑素皮質(zhì)素受體1(Melanocortin receptor1，MC1R)，控制褐黑色素和真黑色素的生物合成，決定二者的數(shù)量與比例，從而形成不同類型的黑色素，產(chǎn)生不同的毛色[5-6]。另外，Agouti基因與其相關(guān)蛋白是糖尿病與腫瘤、肥胖等人類疾病的研究熱點之一，Agouti基因位點的全面檢測將為動物品種資源的保存與利用提供重要參考[7]。

控制山羊被毛顏色遺傳的基因座主要有4個：野生型座位A(稱為刺鼠毛色基因座位)、稀釋毛色因子座位D、“上位白”座位I、白斑座位S，4個基因都位于常染色體上，它們之間不存在連鎖關(guān)系[8-9]。毛色與經(jīng)濟(jì)性狀關(guān)系不大，但與生長速度、瘦肉率及對疫病的抵抗力等生產(chǎn)性能有直接關(guān)系，Agouti基因與山羊毛色形成有很大關(guān)系，故Agouti基因?qū)ι窖蛏a(chǎn)性能方面也有影響[10]。山羊Agouti基因已被定位于13q22[11]。哺乳動物Agouti基因含有4個外顯子，外顯子2、3、4編碼131～133個氨基酸，非翻譯外顯子1存在不同剪接體。動物皮膚組織中，Agouti基因非翻譯外顯子1所存在的不同剪接體類型可能與該基因的表達(dá)存在某種特定關(guān)系，進(jìn)而影響毛色的變化。

本試驗研究探討了白色和黑色山羊皮膚組織Agouti基因5′非翻譯區(qū)外顯子1的剪接體變異類型，為探討山羊毛色分子調(diào)控機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 山羊Agouti基因序列的擴(kuò)增

1.1.1 樣品來源及引物設(shè)計 使用實驗室-20 ℃冰箱保存的遼寧絨山羊(白色)和雷州山羊(黑色)血液樣品各3個提取DNA，擴(kuò)增山羊的Agouti基因序列。擴(kuò)增所用引物見表1。

表1Agouti基因5′非翻譯區(qū)PCR擴(kuò)增測序引物

Table 1 Primers used for amplifying 5′UTR of goatAgoutigene

引物Primer序列(5′→3′)Sequence擴(kuò)增長度/bpSize退火溫度/℃Annealingtemperature延伸時間/sExtendingtime循環(huán)數(shù)CycleP1F：TGCTTGATTGGCTGTTCTTCR：TCACTGATGGCAATTCTTCC226160．014535P2F：GGCTGCTTCCATTTGCTGTAR：ACCTGGGTGGTTGGTGATAT267058．016035P3F：TAATGTTTCCCCTAATCCR：TGCTTTCTAAGAGTTTGTCG123856．07535P4F：CTCTTAGGGATAGGCAACACR：CCTCTTCCAAGGGATAGTTC289162．017035P5F：CTGGCTCTTGGTTGCTGTR：TGACTCTGGGTGGAGGTTA293556．917035P6F：GTGAGACTCTTCCTGCCTGTGR：GGTGGCGCAGACAGTAAAG352363．021535P7F：ATCAGCCCTGGGATTTCTTR：GCTTTATCACCCACCCTTCT235860．014535AGT1F：CGGGAGTAATCCAAGAGTCR：TGAGGGAAGAGGAAGCAG39355．06035AGT2F：CATCTGAGACCCAGCATAGCR：CTCACAAACCACCCTACCAT262362．716035AGT3F：AGAACCTGGCTACTATTGCTR：TTGAGAACTGCTGGTGAGAA129558．09035

F代表上游引物，R代表下游引物

The F and R represent forward and reverse primers，respectively

1.1.2 PCR反應(yīng)及產(chǎn)物檢測與回收 PCR反應(yīng)總體積50 μL：滅菌水32 μL、10×LA PCR Buffer II(Mg2+Plus)5 μL、dNTP Mixture(各2.5 mmol·L-1)8 μL、模板DNA 2.5 μL、P1(20 μmol·L-1)1 μL、P2(20 μmol·L-1)1 μL、TaKaRa LATaq(5 U·μL-1)0.5 μL。

PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 預(yù)變性5 min；94 ℃ 變性30 s，退火30 s，72 ℃ 延伸(根據(jù)目的片段大小確定延伸時間)，30～35個循環(huán)；72 ℃ 終延伸10 min，4 ℃終止保存。用1.0%～2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒回收。

1.1.3 回收產(chǎn)物連接、轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)及陽性重組子鑒定 按照pEASY-T3 Cloning Kit說明書將回收的PCR產(chǎn)物通過TA克隆連接到pEASY-T3載體上，過夜培養(yǎng)。用滅菌牙簽挑取白色且形狀圓潤的單菌落至含有3～5 mL 100 mg·L-1Amp+的LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)6～10 h，菌液PCR鑒定重組子。陽性克隆送北京中科希林生物科技有限責(zé)任公司測序。

1.2 山羊Agouti基因5′RACE

1.2.1 RNA提取、純化及反轉(zhuǎn)錄 樣品為12月齡左右的4只白色(B1、B2、B3和B4)和3只黑色(H1、H2和H3)太行山羊皮膚組織。按照TaKaRa RNAiso Plus說明書提取RNA，純化后的RNA用NANODROP 2000超微量分光光度計測定濃度及純度。經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠150 V，150 mA電泳10 min，凝膠成像系統(tǒng)觀察、拍照并保存，將28S和18S條帶的亮度和寬度比例均為2∶1的RNA按SMARTer 5′RACE cDNA Amplification Kit說明書反轉(zhuǎn)錄。RT產(chǎn)物保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計 以綿羊mRNA為模板，SMARTer 5′RACE cDNA Amplification Kit中10×Universal Primer A Mix(UPM)和Nested Universal Primer A(NUP，10 μmol·L-1)為上游引物，設(shè)計下游引物RT1、GSP和NGSP(表2)用作5′RACE試驗的引物。

表2 5′RACE所用引物

Table 2 Primers for 5′RACE

引物Primer序列(5′→3′)SequenceRT1GGAGCAGGCGCTGCGGAAGAAGSPGCGGAAGAAGCGGCACTGGCAGAAGGCNGSPTCCTCAGGTGCCAGGTGGCTGT

1.2.3 5′RACE反應(yīng)條件及克隆測序 按照Advantage 2 PCR Kit說明書分別進(jìn)行Outer PCR和Inner PCR，瓊脂糖檢測法檢測PCR產(chǎn)物，高亮條帶的產(chǎn)物均進(jìn)行切膠回收。將回收的Inner PCR產(chǎn)物(B1、B4和H3)通過TA克隆連接到pMD19-T載體上，Inner PCR產(chǎn)物(B2、B3、H1和H2)通過TA克隆連接到pEASY-T3載體上，過夜培養(yǎng)。按上述過程進(jìn)行陽性重組子鑒定和測序。

2 結(jié) 果

2.1 山羊Agouti基因序列分析

2.1.1 山羊Agouti基因序列擴(kuò)增 引物P1～P7及AGT1～AGT3擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠檢測，10對引物擴(kuò)增產(chǎn)物的大小與預(yù)期大小一致，均進(jìn)行切膠回收，回收后的產(chǎn)物均進(jìn)行連接和轉(zhuǎn)化，菌液PCR檢測、獲取陽性克隆并測序，切膠回收后電泳結(jié)果如圖1。

2.1.2Agouti基因結(jié)構(gòu)分析 DNAMAN6.0軟件分析后，利用CAP3 Sequence Assembly Program將P1～P7擴(kuò)增獲得的序列進(jìn)行拼接，分別得到長度為16 161和16 226 bp的白色和黑色山羊拼接序列。將P1～P7拼接獲得的序列再與12 847 bp(JN651404+EF587236)[12]的序列進(jìn)行拼接，分別得到長度為27 793和27 858 bp的白色和黑色山羊Agouti基因拼接序列。引物AGT1、AGT2、AGT3擴(kuò)增白色山羊獲得的序列長度分別為364、2 625和1 296 bp；擴(kuò)增黑色山羊獲得的序列長度分別為367.2622和1 298 bp。

前期所得的長度為7 357 bp的JN651404包括Agouti基因外顯子1(90 bp)和5′非翻譯區(qū)部分序列(7 267 bp)[13]。利用BioEdit7.0以及Spidey軟件與綿羊mRNA(NM_001134303.1)比對分析，本試驗獲得的白色和黑色山羊Agouti基因序列在外顯子2之前除了88 bp已經(jīng)預(yù)測外，又發(fā)現(xiàn)3段與綿羊mRNA相匹配序列，長度分別為180、81和79 bp(表3)。

2.2 山羊Agouti基因的5′RACE擴(kuò)增

2.2.1 山羊Agouti基因反轉(zhuǎn)錄 山羊皮膚組織提取RNA后進(jìn)行純化，純化后的RNA 28S 與18S 泳帶亮度及寬度比例接近 2∶1，且 28S 整齊、清晰，無嚴(yán)重拖尾，表明 RNA 純度和完整性較好。NANODROP 2000 超微量分光光度計測得樣品 A260 nm/A280 nm為 1.8～2.0[14]，說明純化后的 RNA 質(zhì)量較高，可以直接進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

7 只山羊 Outer PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物均無特異帶，整個電泳條帶呈現(xiàn)彌散狀(即無法區(qū)分的抹帶)，故需將 Outer PCR 產(chǎn)物稀釋后進(jìn)行Inner PCR。Inner PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測：白色山羊 B1、B2、B3、B4 分別存在3、4、2、2條帶，黑色山羊 H1、H2、H3 分別存在 3、2、1 條帶，由于擴(kuò)增過程中可能產(chǎn)生非特異性條帶，故需將各條帶均切膠回收通過連接、轉(zhuǎn)化，菌液測序判定目的條帶。切膠純化結(jié)果如圖2所示。

每個圖中從左到右依次為Marker、白色山羊和黑色山羊的擴(kuò)增條帶From left to right are Marker，amplification products of white and black goats，respectively in each figure圖1 山羊Agouti基因擴(kuò)增Fig.1 Amplifying electrophoresis of goat Agouti gene

表3 白色和黑色山羊5′非翻譯區(qū)分析

Table 3 Analysis results of 5′UTR in white and black goats

山羊毛色Coatcolor擴(kuò)增和拼接序列Sequence位置/bpLocation綿羊mRNA位置/bpLocationofsheepmRNA長度/bpLength相似性/%Similarity白色山羊WhitegoatAGT1擴(kuò)增364bp152～2321～8181100AGT2擴(kuò)增2625bp1416～149477～15579100433～622154～33318097．822216～22303334～4218897．727793bp拼接序列22606～22774422～59016998．824091～24155591～6556510027617～27787656～82617199．4黑色山羊BlackgoatAGT1擴(kuò)增367bp154～2341～8181100AGT2擴(kuò)增2622bp1411～148977～15579100433～622154～33318098．322281～22368334～4218897．727858bp拼接序列22671～22839422～59016998．824156～24220591～6556510027682～27852656～82617199．4

2.2.2 山羊Agouti基因5′末端序列陽性克隆鑒定 山羊Agouti基因5′末端序列PCR擴(kuò)增中出現(xiàn)的條帶分別切膠回收后連接至載體。經(jīng)菌液PCR檢測B1、B2、B3、H1和H2均出現(xiàn)多種不同大小的片段，B4和H3出現(xiàn)1種片段結(jié)果(圖3)，將檢測到的大小不同的片段均進(jìn)行測序。測序得到的序列結(jié)果用BioEdit 7.0軟件去除載體并找到上、下游引物，B1、B2、B3、B4、H1、H2和H3分別發(fā)現(xiàn)2、5、3、1、2、2和1種不同長度的序列可以與Agouti基因比對上。

各圖中從左到右依次為Marker、Inner PCR切膠回收條帶From left to right are Marker，result of Inner PCR，respectively in each figure圖2 Inner PCR切膠回收Fig.2 Results of Inner PCR

各圖中從左到右依次為Marker、菌液PCR獲得的不同大小片段From left to right are Marker，different fragments by bacterium PCR，respectively in each figure圖3 山羊Agouti基因5′末端序列陽性克隆鑒定Fig.3 Clone of Agouti cDNA 5′ termination

2.2.3 山羊5′RACE序列分析

2.2.3.1 白色山羊外顯子1剪接體類型：應(yīng)用Spidey軟件將B1、B2、B3和B4測序結(jié)果與獲得的白色山羊Agouti基因序列比對分析，結(jié)果列于表4，分析得出4只白色山羊各種剪接體類型(圖4)，4只白色山羊中共檢測到5種不同類型剪接體，同一類型的剪接體存在不同程度的長度變異。B1存在It和It′ 2種類型的剪接體，It包括兩段，長度分別為58和81 bp。B2存在It、It′、IA、2C和IE 5種類型剪接體，2C在基因組上的位置包含在牛2C(DQ000238.1)剪接體在基因組位置之內(nèi)，說明2C剪接體存在于B2中；最長的It為200 bp，其余It出現(xiàn)不同程度缺失；最長的It′為80 bp；IA、2C、IE長度分別為59、85、95 bp。B3存在It、It′和IE 3種類型的剪接體，最長的It為134 bp，其余It 出現(xiàn)不同程度缺失；最長的It′為80 bp；IE的長度為95 bp。B4存在It、It′ 2種類型的剪接體，長度分別為83和79 bp。將各個白色山羊所得的每條序列均用通過NCBI的Blast在線軟件與山羊基因組序列(AJPT01136617.1)進(jìn)行比較，每條序列與山羊13號染色體同一區(qū)域序列的相似性均在84% 以上，大多數(shù)相似性為100%，B1、B2、B3、B4 均包括部分Exon2和部分Exon1。綜合4只白色山羊5′RACE結(jié)果得出，4只白色山羊Exon1都能檢測兩種不同的剪接體類型：It、It′，最長的It為200 bp，其余It序列出現(xiàn)不同程度缺失； It′一種長度為80 bp，另一種長度為79 bp。白色山羊B2還檢測到IA、2C、IE 3種不同的剪接體類型，白色山羊B3也檢測到IE剪接體的存在。

1～364，1～2 625，1～1 295，1～27 793代表Agouti基因序列；B1～B4為白色山羊剪接體類型及其在基因組上對應(yīng)的位置和長度The 1-364，1-2 625，1-1 295 and 1-27 793 represent Agouti sequences；The B1-B4 represent the location and length of Agouti gene spliceosome in white goat圖4 白色山羊剪接體類型Fig.4 Spliceosome types in white goat

2.2.3.2 黑色山羊外顯子1剪接體類型：應(yīng)用Spidey軟件將H1、H2和H3測序結(jié)果與獲得的黑色山羊Agouti基因序列比對分析，結(jié)果列于表5，分析得出3只黑色山羊不同剪接體類型(圖5)，3只黑色山羊中僅檢測到2種類型剪接體，即It和It′，同一種剪接體也存在不同程度的長度變異。H1存在It、It′ 2 種類型的剪接體，最長的It為134 bp；最長的It′ 為80 bp。H2 存在It、It′ 2種類型的剪接體，最長的It為160 bp；最長的It′ 為80 bp； H3只存在It′ 1種類型的剪接體，長度為51 bp。將各個黑色山羊所得的每條序列均用通過NCBI的Blast在線軟件與山羊基因組序列(AJPT01136617.1)進(jìn)行比較，每條序列與山羊13號染色體同一區(qū)域序列的相似性均在99% 以上，H1、H2、H3均包括部分Exon2和部分Exon1。綜合3只黑色山羊5′RACE結(jié)果得出：黑色山羊Exon1檢測到兩種不同的剪接體類型：It和It′，最長的It為160 bp，其余It序列出現(xiàn)不同程度缺失；It′一種長度為80 bp，另一種長度為79 bp。

表4 白色山羊Spidey分析結(jié)果

Table 4 Spidey analysis of white goat B1-B4

山羊Goat擴(kuò)增和拼接序列Sequence位置/bpLocationmRNA位置/bpLocationofmRNA長度/bpLength相似性/%SimilarityB1結(jié)果1(329bp)27793bp拼接序列22604～22697236～32994100AGT1擴(kuò)增364bp254～311106～16358100AGT2擴(kuò)增2625bp1415～1494158～23780100B1結(jié)果2(277bp)27793bp拼接序列22604～22697184～27794100AGT1擴(kuò)增364bp152～23231～11181100AGT2擴(kuò)增2625bp1416～1494107～18579100B2結(jié)果1(332bp)27793bp拼接序列7189～7282156～2408598．8(得到兩段)22606～22697241～33292100AGT1擴(kuò)增364bp178～23232～8655100AGT2擴(kuò)增2625bp1416～149482～16079100B2結(jié)果2(324bp)27793bp拼接序列22604～22697231～32494100AGT1擴(kuò)增364bp106～23232～15812798．4AGT2擴(kuò)增2625bp1416～1494154～23279100B2結(jié)果3(378bp)27793bp拼接序列22605～22697286～37893100AGT1擴(kuò)增364bp185～31132～15812798．4AGT2擴(kuò)增2625bp1415～1494153～23280100AGT3擴(kuò)增1296bp752～810228～28659100B2結(jié)果4(397bp)27793bp拼接序列22604～22697304～39794100AGT1擴(kuò)增364bp112～31132～23120099．5AGT2擴(kuò)增2625bp1415～1494226～30580100B2結(jié)果5(438bp)27793bp拼接序列22209～22303252～3469597．9(得到兩段)22606～22697347～43892100AGT1擴(kuò)增364bp159～31132～184153100AGT2擴(kuò)增2625bp1415～1494179～25880100B3結(jié)果1(280bp)27793bp拼接序列22604～22697187～28094100AGT1擴(kuò)增364bp150～23232～11483100AGT2擴(kuò)增2625bp1416～1494110～18879100B3結(jié)果2(400bp)27793bp拼接序列22209～22303214～3089598．9(得到兩段)22606～22697309～40092100AGT1擴(kuò)增364bp196～31131～146116100AGT2擴(kuò)增2625bp1415～1494141～22080100B3結(jié)果3(329bp)27793bp拼接序列22604～22697236～32994100AGT1擴(kuò)增364bp178～31130～163134100AGT2擴(kuò)增2625bp1415～1494158～23780100B4結(jié)果1(280bp)27793bp拼接序列22604～22697187～28094100AGT1擴(kuò)增364bp150～23232～11483100AGT2擴(kuò)增2625bp1416～1494110～18879100

表5 黑色山羊H1～H3 Spidey 分析

Table 5 Spidey results of black goat H1-H3

山羊Goat擴(kuò)增和拼接序列Sequence位置/bpLocationmRNA位置/bpLocationofmRNA長度/bpLength相似性/%SimilarityH1結(jié)果1(333bp)27858bp拼接序列22669～22762240～33394100AGT1擴(kuò)增367bp124～23457～167111100AGT2擴(kuò)增2622bp1411～1489163～24179100H1結(jié)果2(331bp)27858bp拼接序列22669～22762238～33194100AGT1擴(kuò)增367bp180～31332～165134100AGT2擴(kuò)增2622bp1410～1489160～23980100H2結(jié)果1(357bp)27858bp拼接序列22669～22762264～35794100AGT1擴(kuò)增367bp154～31332～191160100AGT2擴(kuò)增2622bp1410～1489186～26580100H2結(jié)果2(280bp)27858bp拼接序列22669～22762187～28094100AGT1擴(kuò)增367bp152～23432～1148398．4AGT2擴(kuò)增2622bp1411～1489110～18879100H3結(jié)果1(173bp)27858bp拼接序列22669～2276280～17394100AGT2擴(kuò)增2622bp1439～148931～8151100

1～367、1～2622、1～1298、1～27858代表Agouti基因序列；H1～H3部分為黑色山羊剪接體類型及其在基因組上對應(yīng)的位置和長度The 1-367，1-2622，1-1298 and 1-27858 represent Agouti；The H1-H3 represent the location and length of Agouti gene spliceosome in black goat圖5 黑色山羊剪接體類型Fig.5 Spliceosome types in black goat

3 討 論

3.1 山羊Agouti基因5′非翻譯區(qū)序列變異

山羊Agouti基因5′非翻譯區(qū)外顯子1存在不同類型剪接體，之前獲得的12 847 bp(JN651404+EF587236)基因組序列不足以檢測到更多的剪接體類型。研究發(fā)現(xiàn)，綿羊的白色是由于Agouti基因附近190 kb(包括AHCY基因和ICTH基因啟動子)順接重復(fù)引起的[15]，而綿羊CH243-455O4 這條較長的序列跨越了兩個重復(fù)，CH243-455O4 反向互補序列與12 847 bp這段序列相似性很高，故以綿羊CH243-455O4 反向互補序列為模板擴(kuò)增12 847 bp 之前部分序列。另外，將綿羊CH243-455O4 反向互補序列與綿羊ItIt′IA(EU420026.1)、ItIt′(EU420024.1)比對，CH243-455O4的反向互補序列中包括53 571～53 651、57 572～57 650、64 870～64 928 bp的3段序列預(yù)測為外顯子1的不同剪接體類型，故也擴(kuò)增了CH243-455O4反向互補序列中包括該3段的序列。

獲得的基因組序列與綿羊mRNA序列比對分析后，分別得到長度為88、180、81和79 bp的山羊Agouti基因5′非翻譯區(qū)序列，推測山羊Agouti基因5′非翻譯區(qū)可能包含4個或更多不同長度的非編碼外顯子，而5′ RACE所檢測到的外顯子1可變剪接體基本與此對應(yīng)。

3.2 山羊外顯子1剪接體變異

菌液測序得出的所有序列結(jié)果首先進(jìn)行Blast分析，將非特異性擴(kuò)增的序列去除，各個測序結(jié)果均與山羊基因組的相似性在98% 以上，只是結(jié)合的位置與長短略有差別，此部分結(jié)果與牛、綿羊中的報道一致[16-17]。對白、黑、棕色羊駝Agouti基因進(jìn)行5′RACE檢測，發(fā)現(xiàn)了3種不同長度的5′非翻譯區(qū)序列，分別為136、142、196 bp；長度為196 bp的5′ 非翻譯區(qū)序列與牛外顯子1C的相似性高達(dá)85%[17]。本研究中白色山羊(B1、B2、B3)，黑色山羊(H1、H2)分別獲得2種或者大于2種5′ 非翻譯區(qū)序列，其長度均不相同，與羊駝研究結(jié)果類似。5′RACE結(jié)果發(fā)現(xiàn)，白色山羊B2 存在5種類型剪接體，分別是It、It′、IA、2C、IE，白色山羊均存在It、It′ 2種類型，B3也檢測到IE 剪接體的存在，每只山羊得出的剪接體的類型與數(shù)目不同，這與山羊個體本身也有關(guān)；黑色山羊H1、H2存在2種類型剪接體：It、It′，黑色山羊H3只存在一段很短的It′，可能與H3 RNA提取的完整性較差相關(guān)，或者H3本身就只有一種類型的剪接體。分析得出：白色、黑色山羊Agouti基因外顯子1剪接體類型不同，不同的剪接形式可能產(chǎn)生不同毛色，IA、2C、IE可變剪接形式只在白色山羊中發(fā)現(xiàn)，推測：IA、2C、IE可變剪接體可能與山羊白色形成有關(guān)。黑色、白色山羊It、It′ 均存在不同程度的缺失，推測：可能是在反轉(zhuǎn)錄過程中由于使用的是特異性引物，包含It、It′ 的兩段序列反轉(zhuǎn)錄后得到較多長度不同的片段，后續(xù)，需將5′RACE試驗結(jié)果通過RT-PCR或qRT-PCR進(jìn)行驗證，進(jìn)一步證實此部分結(jié)果的可靠性。根據(jù)白色、黑色山羊It、It′ 以及白色山羊IA在基因組上所處的位置推測：5′ RACE 所檢測的4只白色山羊和3只黑色山羊均存在拷貝變異，而綿羊的白色是由于Agouti基因附近190 kb順接重復(fù)的啟動子引起位于下游的Agouti基因表達(dá)從而表現(xiàn)白色，黑色綿羊Agouti基因不表達(dá)，山羊所得結(jié)果與綿羊有差異，后續(xù)可以通過試驗驗證從而進(jìn)一步確定拷貝是否確實存在。

4 結(jié) 論

4.1 擴(kuò)增獲得的基因序列與12 847 bp(JN651404+EF587236)序列拼接獲得了長度分別為27 793和27 858 bp白色和黑色山羊Agouti基因序列。擴(kuò)增獲得CH243-455O4的反向互補序列中包括53 571～53 651、57 572～57 650和64 870～64 928 bp 3段序列，白色山羊獲得的包含此3段序列長度分別為364、2 625和1 296 bp；黑色山羊獲得的包含此3段序列的長度分別為367、2 622和1 298 bp。

4.2 獲得了與綿羊mRNA序列相匹配的長度分別為88、180、81和79 bp的山羊Agouti基因5′非翻譯區(qū)序列，其中的180、81和79 bp為新發(fā)現(xiàn)片段，推測山羊Agouti基因5′非翻譯區(qū)可能包含4個或更多不同長度的非編碼外顯子，與5′RACE所檢測到的外顯子1可變剪接體長度有所對應(yīng)。

4.3 白色山羊中檢測到5種類型的外顯子1剪接體，即It、It′、IA、2C和IE，黑色山羊僅檢測到It和It′ 2種可變剪接體。剪接體之間和剪接體內(nèi)部均存在長度變異。IA、2C和IE可變剪接體可能與山羊毛色形成有關(guān)。

[1] 潘紅梅.KIT基因與榮昌豬毛色相關(guān)性研究[D].重慶：西南大學(xué)，2006. PAN H M.Study on the relationship betweenKITgene and coat color of Rongchang pig[D].Chongqing：Southwest University，2006.(in Chinese)

[2] 虧開興，楊國榮，朱芳賢，等.BMY牛與婆羅門牛的毛色遺傳[J].黃牛雜志，2005，4(31)：19-21. QU K X，YANG G R，ZHU F X，et al.Coat color inheritance of BMY and Brahman cattle[J].JournalofYellowCattleScience，2005，4(31)：19-21.(in Chinese)

[3] BYRD J C，BRESALIER R S.Mucins and mucin binding proteins in colorectal cancer[J].CancerMetastasisRev，2004，23(1-2)：77-99.

[4] 何孟頡.家兔MITF基因同源性、多態(tài)性分析及不同時期表達(dá)水平研究[D].揚州：揚州大學(xué)，2012. HE M J.Homology，polymorphism analysis and expression levels in different stages ofMITFgene in rabbit[D].Yangzhou：Yangzhou University，2012.(in Chinese)

[5] 白小青，王金勇.豬毛色遺傳的研究進(jìn)展[J].動物科學(xué)與動物醫(yī)學(xué)，2004，8(21)：32-33. BAI X Q，WANG J Y.The advance of researches of genetics of coat color of pigs[J].AnimalScienceandVeterinaryMedicine，2004，8(21)：32-33.(in Chinese)

[6] ARGESON A C，NELSON K K，SIRACUSA L D.Molecular basis of the pleiotropic phenotype of mice carrying the hypervariable yellow(Ahvy) mutation at the agouti locus[J].Genetics，1996，142(2)：557-567.(in Chinese)

[7] 劉琳玲，邢秀梅，王桂武，等.Agouti基因研究進(jìn)展[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2011，(8)：37-38. LIU L L，XING X M，WANG G W，et al.Progress in the study ofAgoutigene[J].HeilongjiangAnimalScienceandVeterinaryMedicine，2011，(8)：37-38.(in Chinese)

[8] SEARLE A G.Comparative genetics of coat color in mammals[M].London：Logos Press，1968.

[9] LUSH J L.Inheritance of horns wattles，and color in grade Toggenburg goats[J].JHered，1926，17：73-91.[10] ASDELL S A，SMITH A D B.Inheritance of color，beard，tassels and horns in the goat[J].JHered，1928，19(9)：425-430.

[11] SCHIBLER L，VAIMAN D，OUSTRY A，et al.Comparative gene mapping：a fine-scale survey of chromosome rearrangements between ruminants and humans[J].GenomeRes，1998，8(9)：901-915.

[12] TANG C J，ZHOU R Y，LI X L，et al.Variation of 423 G>T in theAgoutigene exon 4 in indigenous Chinese goat breeds[J].BiochemGenet，2008，46(11-12)：770-780.

[13] 吳偉偉.山羊Agouti基因5′UTR變異及ASIP蛋白表達(dá)定位研究[D].保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012. WU W W.Study on the variation ofAgoutigene 5′ UTR and ASIP location in goat[D].Baoding：Agricultural University of Hebei，2012.(in Chinese)

[14] 劉 佳，董常生，范瑞文，等.周期素依賴性蛋白激酶-5在不同毛色羊駝皮膚中的表達(dá)[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2010，41(4)：478-483. LIU J，DONG C S，F(xiàn)AN R W，et al.Expression of cyclin dependent kinase 5 in alpaca skin of different hair colors[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica， 2010，41(4)：478-483.(in Chinese)

[15] NORRIS B J，WHAN V A.A gene duplication affecting expression of the ovineASIPgene is responsible for white and black sheep[J].GenomeRes，2008，18(8)：1282-1293.

[16] GIRARDOT M，GUIBERT S，LAFORET M P，et al.The insertion of a full lengthBostaurusLINE element is responsible for a transcriptional deregulation of the NormandeAgoutigene[J].PigmentCellRes，2006，19(4)：346-355.

[17] CHANDRAMOHAN B，RENIERRI C，LA MANNA V，et al.The alpacaagoutigene：Genomic locus，transcripts and causative mutations of eumelanic and pheomelanic coat color[J].Gene，2013，521(2)：303-310.

(編輯 郭云雁)

Study onAgoutiSpliceosome Types in Goat Skin with Different Coat Color

ZHANG Tian1，2，3，LI Xiang-long1，2*，ZHOU Rong-yan2，LI Lan-hui2

(1.HebeiNormalUniversityofScience&Technology，Qinhuangdao066600，China；2.AgriculturalUniversityofHebei，Baoding071000，China；3.JinzhouVocationalEducationCenter，Jinzhou052260，China)

The objective of this study was to investigate the variant types of goatAgoutigene spliceosome in goat skin with different coat color.The sequences and mRNA of goatAgoutigene were obtained and analyzed from goat skin with different coat color by PCR and 5′RACE methods，respectively.The 27 793 and 27 858 bp of partialAgoutigene sequences were obtained from white and black goat skin，respectively.Four fragments，88，180，81 and 79 bp，in which the 180，81 and 79 bp were first detected in goat，were matched with the sequences of sheep mRNA and corresponded with the length of exon 1 spliceosome obtained by 5′RACE.The 5 types(It，It′，IA，2C and IE) of spliceosome were detected in goat skin with white coat color，and only 2 types(It and It′) were found in goat skin with black coat color.There was length variation within and among spliceosomes.The result indicate that the IA，2C and IE might be related with the formation of goat coat color.

goat；Agoutigene；skin tissue；spliceosome types

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.11.004

2014-12-31

國家自然科學(xué)基金(31172196)；河北省高校創(chuàng)新團(tuán)隊領(lǐng)軍人才培育計劃(LJRC004)；河北省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計劃重點基礎(chǔ)研究項目(15962901D)

張 天(1987-)，女，河北藁城人，碩士，主要從事動物遺傳育種研究，E-mail：zhangtian19870417@163.com

*通信作者：李祥龍，博士，教授，博導(dǎo)，主要從事動物遺傳育種研究，E-mail：Lixianglongcn@yahoo.com

S827；S813.3

A

0366-6964(2015)11-1934-10