高 嫻，歐陽五慶*，李夢云，劉 岳，王波臻，鄭 寅，楊鳴琦*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，楊凌 712100；2.河南科技大學(xué) 動物科技學(xué)院，洛陽 471003；3.石河子大學(xué) 動物科技學(xué)院，石河子 832003)

托氟沙星納米乳的制備及其急性毒性研究

高 嫻1，歐陽五慶1*，李夢云2，劉 岳1，王波臻3，鄭 寅1，楊鳴琦1*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，楊凌 712100；2.河南科技大學(xué) 動物科技學(xué)院，洛陽 471003；3.石河子大學(xué) 動物科技學(xué)院，石河子 832003)

擬制備托氟沙星納米乳，并對其理化性質(zhì)與急性毒性進(jìn)行研究。以納米乳的載藥量、穩(wěn)定性為考察指標(biāo)，篩選油相、表面活性劑、助溶劑，結(jié)合偽三元相圖確定納米乳的最佳配方，制備托氟沙星納米乳。通過透射電鏡、激光粒度分析儀測定納米乳的微觀形態(tài)、粒徑；用高效液相色譜儀檢測藥物含量，通過影響因素試驗、加速試驗、長期試驗考察其穩(wěn)定性與有效期；經(jīng)小鼠灌胃試驗評價其急性毒性。結(jié)果顯示，托氟沙星納米乳的最佳配方：托氟沙星1.36%、牛至油3.24%、乳酸2.60%、聚氧乙烯醚-40-氫化蓖麻油25.98%、蒸餾水66.82%。該納米乳的乳滴呈圓球形，平均粒徑為16.16 nm，穩(wěn)定性良好，有效期為24個月。托氟沙星在3～100 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)與對應(yīng)的峰面積線性關(guān)系良好，納米乳的平均回收率為99.33%±1.24%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.25%，精密度較高。小鼠灌胃LD50>10 000 mg·kg-1，最大耐受劑量為39.72 g·kg-1。成功制備了托氟沙星納米乳，為進(jìn)一步開發(fā)納米級抗菌藥物提供理論依據(jù)。

托氟沙星；納米乳；偽三元相圖；質(zhì)量評價；急性毒性

托氟沙星(tosufloxacin，TFLX)又名妥舒沙星、托磺沙星，是由日本富山化學(xué)工業(yè)公司綜合研究所研發(fā)的一種新型、廣譜、高效的氟喹諾酮類抗菌藥物[1-2]。TFLX對需氧菌(革蘭陽性菌、革蘭陰性菌)、厭氧菌及沙眼衣原體均具有廣譜抗菌作用，與已上市的同類藥物相比，其對鏈球菌屬、腸球菌屬、葡萄球菌屬等革蘭陽性菌，淋病奈瑟菌及寄生在細(xì)胞內(nèi)的沙門菌、志賀菌具有更強(qiáng)的抗菌作用[3-4]。該藥物主要通過抑制細(xì)菌DNA回旋酶，干擾細(xì)菌DNA的正常轉(zhuǎn)錄與復(fù)制而發(fā)揮作用，同時也可抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ，干擾復(fù)制的DNA分配到子代細(xì)胞，使細(xì)菌死亡。TFLX對細(xì)菌分裂增殖的這種雙重抑制作用，使其抗菌作用更強(qiáng)，交叉耐藥性減少[5]。

TFLX主要用于治療泌尿系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)等感染，其臨床療效顯著，患者不良反應(yīng)輕微[6]，在國外已經(jīng)成為臨床治療急性細(xì)菌性感染的常用抗菌藥物[7-8]。但TFLX幾乎不溶于水，臨床常用的劑型僅有膠囊、片劑，患者服用的依從性較低，且口服后在小腸液中的溶解性嚴(yán)重限制其藥效的發(fā)揮[9]。

納米乳(nanoemulsion，NE)是由水相、油相、表面活性劑、助表面活性劑、助溶劑等以適當(dāng)?shù)谋壤旌?，自發(fā)乳化而成的分散體系，其外觀澄清透明或略渾濁，熱力學(xué)穩(wěn)定，各向同性，乳滴粒徑小于100 nm[10]。納米乳作為一種納米藥物傳遞系統(tǒng)，可改善藥物的溶解性，提高藥物的生物利用度，增強(qiáng)藥物的穩(wěn)定性。

本試驗針對TFLX臨床應(yīng)用中存在的問題，結(jié)合納米乳給藥體系的優(yōu)勢，制備托氟沙星納米乳(以下簡稱為TFLX-NE)，對其理化性質(zhì)、急性毒性進(jìn)行考察，以期為臨床提供一種安全、高效、穩(wěn)定的納米藥物。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

UV2450紫外-可見分光光度儀(日本Shimadzu公司)；Zetasizer Nano ZS型激光粒度分析儀(英國Malvern instrument 公司)；HT7700透射電子顯微鏡(日本Hitachi公司)；FE-20K型pH計(瑞士Mettler Toledo公司)；高效液相色譜儀(日本日立公司)；高效液相色譜工作站D-2000Elite(日本日立公司)；250D光照培養(yǎng)箱(金壇市開發(fā)區(qū)吉特實驗儀器廠)；RM2245轉(zhuǎn)輪切片機(jī)(德國Leica公司)。

托氟沙星(河南天耀科技有限公司)；聚氧乙烯醚-40-氫化蓖麻油(RH-40)、聚氧乙烯醚-40-蓖麻油(EL-40)、吐溫-80(Tween-80)(天津市恒興化學(xué)試劑有限公司)；乳酸(天津市天力化學(xué)試劑有限公司)；牛至油(江西吉安中香天然植物有限公司)；香芹酚(上海康拓化工有限公司)；丁香酚(江西恒城天然香料提煉廠)；肉桂油、肉桂醛(武漢遠(yuǎn)程共創(chuàng)科技有限公司)；乙腈(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 實驗動物

健康青年昆明小白鼠70只，雌雄各半，體重20 g±2 g，購自西北農(nóng)林科技大學(xué)實驗動物中心。飼養(yǎng)溫度25 ℃±2 ℃，相對濕度50%～60%，12 h光暗交替，無抗生素全價小鼠飼料飼喂，自由清潔飲水。

1.3 TFLX-NE的配方篩選與制備

1.3.1 油相的篩選 TFLX的水溶性差，根據(jù)納米乳的制備工藝，將其溶于不同的油脂，選擇溶解度較大的油脂作為油相。取過量的TFLX分別溶于香芹酚、丁香酚、肉桂油、肉桂醛、牛至油中，置于恒溫?fù)u床，25 ℃振搖48 h。吸取上清液，用紫外分光光度法測定TFLX在各油脂中的溶解度，選出適宜的油相。

1.3.2 表面活性劑的篩選 本試驗將制備O/W型納米乳，根據(jù)“乳劑中對乳化劑溶解度大的一相形成外相”和“相似者相溶”原理，選用親水親油平衡值(hydrophile lipophilic balance，HLB)8～18的表面活性劑[11]。選擇藥學(xué)試驗中常用的低毒、低刺激性非離子型表面活性劑RH-40、EL-40、Tween-80。室溫下，將TFLX溶于已篩選出的油相中，表面活性劑/油相分別按質(zhì)量比9∶1～1∶9混合，緩慢滴加蒸餾水，并不斷勻速攪拌，體系將由稀薄變黏稠，再突變?yōu)橄”?，最終成為澄清透明的液體。記錄由黏稠突變?yōu)橄”r的相變點加水量，并計算該臨界體系中各成分的質(zhì)量。以油相、水相、表面活性劑為三個頂點，用Origin Pro 8.0分別繪制偽三元相圖，根據(jù)乳區(qū)面積大小確定表面活性劑。

1.3.3 助溶劑的篩選 TFLX在篩選出的油相中溶解度較低，不能滿足臨床用藥要求，根據(jù)藥物本身的理化性質(zhì)，選擇乳酸作為助溶劑。以油相、表面活性劑、蒸餾水為TFLX-NE的基質(zhì)，考察不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)乳酸(1.6%、2.6%、4.8%)對納米乳形成的影響。1.3.4 TFLX-NE的制備 根據(jù)偽三元相圖及納米乳的載藥量、穩(wěn)定性，確定TFLX-NE的最佳配方。室溫下，依配方先將TFLX加入油相，充分?jǐn)嚢?，再添加乳酸，不斷攪拌使TFLX完全溶解，然后加入表面活性劑，攪拌均勻，最后，邊攪拌邊緩慢滴加蒸餾水，即可制備澄清透明的TFLX-NE。

1.4 TFLX-NE的質(zhì)量評價

1.4.1 TFLX-NE的結(jié)構(gòu)類型鑒別 采用染色法鑒別TFLX-NE的結(jié)構(gòu)類型[12]。將水溶性染料次甲基藍(lán)和脂溶性染料蘇丹Ⅲ分別滴加到已制備的TFLX-NE中，觀察兩種染料的擴(kuò)散速率。若藍(lán)色的次甲基藍(lán)擴(kuò)散速率明顯大于紅色的蘇丹Ⅲ，則該納米乳為水包油型(O/W)；反之則為油包水型(W/O)；若二者擴(kuò)散速率相同，則為雙連續(xù)型(B.C)。

1.4.2 TFLX-NE的微觀形態(tài)觀察 將TFLX-NE用蒸餾水稀釋5倍，滴加在覆蓋有碳膜的銅網(wǎng)上，室溫下自然干燥，在透射電子顯微鏡下觀察納米乳的微觀形態(tài)。

1.4.3 TFLX-NE的粒徑分析 將TFLX-NE用蒸餾水稀釋5倍，室溫下吸取稀釋液至激光粒度分析儀的樣品池，測定其粒徑，重復(fù)3次。

1.4.4 TFLX-NE的pH測定 25 ℃下，用pH計測定TFLX-NE的pH，重復(fù)3次。

1.4.5 TFLX-NE的含量測定

1.4.5.1 選擇檢測波長：用0.1 mol·L-1NaOH溶液配制5 μg·mL-1TFLX對照品溶液，通過UV-2450紫外可見分光光度儀檢測其紫外吸收波長，選擇吸光度最大處作為檢測波長。

1.4.5.2 色譜條件：Diamonsil C18色譜柱(250×4.6 mm，5 μm)；柱溫為室溫；流動相選擇0.025 mol·L-1磷酸溶液-乙腈(85∶15)，三乙胺調(diào)節(jié)pH為3.0；流速1.5 mL·min-1；進(jìn)樣量20 μL。

1.4.5.3 方法專屬性試驗：配制100 μg·mL-1TFLX對照品溶液(0.1 mol·L-1NaOH溶液溶解)、含100 μg·mL-1TFLX的TFLX-NE供試品及空白納米乳供試品，0.45 μm濾器過濾，超聲脫氣，依次進(jìn)樣測定。

1.4.5.4 建立標(biāo)準(zhǔn)曲線：將100 μg·mL-1TFLX對照品溶液用流動相稀釋為50、25、12.5、6.25、3.125 μg·mL-1系列溶液，進(jìn)樣測定，重復(fù)3次，以TFLX濃度(C)對色譜峰面積(A)進(jìn)行線性回歸，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.5.5 回收率試驗：精確量取一定量TFLX對照品加入空白納米乳中，流動相稀釋，使其中TFLX的濃度分別為10、15、20 μg·mL-1。分別重復(fù)進(jìn)樣3次，測定每個樣品的實際濃度。以實測濃度與標(biāo)示濃度的比值，計算各樣品的回收率、平均回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standarad deviation，RSD)[13]。

1.4.5.6 精密度試驗：精確配制10、15、20 μg·mL-1TFLX-NE樣品，分別進(jìn)行日內(nèi)精密度和日間精密度試驗。日內(nèi)精密度試驗于1 d內(nèi)的第1、5、10、24小時測定納米乳中TFLX的含量，日間精密度于第1、3、5、7天測定納米乳中TFLX的含量。

1.4.6 TFLX-NE的穩(wěn)定性考察

1.4.6.1 影響因素試驗

(1)高溫試驗：取一批TFLX-NE，開口置于西林瓶內(nèi)，60 ℃下放置10 d，第5天和第10天取樣，觀察納米乳的外觀是否發(fā)生變化，并檢測藥物含量。

(2)高濕度試驗：取一批TFLX-NE，開口置于西林瓶內(nèi)，在25 ℃、相對濕度90%±5%條件下放置10 d，第5天和第10天取樣，觀察納米乳的外觀變化，并檢測藥物含量。

(3)強(qiáng)光照射試驗：取一批TFLX-NE，開口置于西林瓶內(nèi)，在照度為4 500 lx±500 lx的條件下放置10 d，于第5天和第10天取樣，觀察納米乳的外觀是否發(fā)生變化，并檢測藥物含量[14-15]。

1.4.6.2 加速試驗：取三批TFLX-NE，密封貯存于中性硬質(zhì)無色玻璃瓶內(nèi)，在溫度40 ℃±2 ℃、相對濕度75%±5%的條件下放置6個月，分別于第1、2、3、6個月末取樣一次，觀察納米乳的外觀，檢測其藥物含量[14，16]。

1.4.6.3 長期試驗：取三批TFLX-NE，密封貯存于中性硬質(zhì)無色玻璃瓶內(nèi)，在溫度25 ℃±2 ℃，相對濕度60%±10%的條件下放置18個月。分別于0、3、6、9、12、18個月觀察納米乳的外觀，檢測藥物含量。將結(jié)果與0個月比較，運用Excel 2013進(jìn)行統(tǒng)計分析，確定TFLX-NE的有效期[17]。

1.5 TFLX-NE的急性毒性試驗

1.5.1 LD50測定 參照文獻(xiàn)報道的托氟沙星LD50值[18]，設(shè)計預(yù)試驗探索TFLX-NE灌胃小鼠的0%和100%估計致死量(即Dmin和Dmax)。選取50只健康小鼠，雌雄各半，每組10只，隨機(jī)分為5組(A～E組)，試驗前12 h禁食不禁水。A組為空白對照組，灌胃給予1 000 mg·kg-1生理鹽水；B～E組分別灌胃給予10、100、1 000、10 000 mg·kg-1TFLX-NE。灌胃后持續(xù)觀察30 min，第1、4小時再觀察一次，此后每日至少觀察1次，連續(xù)觀察14 d，詳細(xì)記錄小鼠的中毒表現(xiàn)，毒性反應(yīng)的持續(xù)時間、消失時間以及死亡時間。采用Bliss法計算TFLX-NE的LD50值。試驗結(jié)束，處死試驗小鼠，剖檢，觀察主要器官的病理變化，取其肝、十二指腸、腎，制作石蠟切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察各主要器官的病理變化。

1.5.2 MTD測定 取20只健康小鼠，雌雄各半，試驗前12 h禁食不禁水，以最大體積(0.4 mL·10 g-1)灌胃給予TFLX-NE。給藥后，前4 h持續(xù)觀察，以后每天至少觀察1次，連續(xù)觀察14 d，詳細(xì)記錄小鼠的精神狀況、中毒癥狀、死亡情況等。

試驗結(jié)束，處死小鼠，剖檢，觀察主要器官的病理變化，取小鼠的肝、十二指腸、腎，制作石蠟切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察各主要器官的病理變化。

2 結(jié) 果

2.1 TFLX-NE的配方篩選與制備

2.1.1 油相的篩選 TFLX在各油脂中的溶解度如圖1所示。結(jié)果顯示，TFLX在牛至油中的溶解度最大，確定牛至油為油相。

圖1 托氟沙星在各油脂中的溶解度Fig.1 Solubility of TFLX in various oils

2.1.2 表面活性劑的篩選 以Tween-80為表面活性劑時，無法成功制備TFLX-NE。以RH-40、EL-40為表面活性劑時，均可在一定的比例范圍制備澄清透明的納米乳；當(dāng)以RH-40為表面活性劑時，形成的納米乳區(qū)面積最大，故選擇RH-40為納米乳的表面活性劑(圖2)。

圖2 表面活性劑對納米乳體系的影響Fig.2 Effect of surfactant on the nanoemulsion system

2.1.3 助溶劑的篩選 以乳酸為助溶劑制備TFLX-NE，不同含量的乳酸對納米乳形成的影響見表1。結(jié)果顯示，加入2.6%和4.8%的乳酸，均可制備TFLX-NE，放置30 d，后者發(fā)生絮凝現(xiàn)象，說明制備的納米乳不穩(wěn)定。因此，制備TFLX-NE時，應(yīng)加入2.6%的乳酸。

表1 不同含量乳酸對納米乳體系的影響

Table 1 Effect of different lactic acid content on nanoemulsion system

乳酸含量/%Lacticacidcontent現(xiàn)象描述Symptom30d穩(wěn)定性30dstability結(jié)果判定Results1．6乳白色液體Milkyliquid不穩(wěn)定Unstable×2．6澄清透明液體Clearandtransparentliquid穩(wěn)定，澄清透明液體Stable，clearandtransparentliquid√4．8澄清透明液體Clearandtransparentliquid不穩(wěn)定，絮凝Unstable，flocculation×

×.乳酸含量不適宜；√.乳酸含量適宜

×.The lactic acid content inappropriate；√.The lactic acid content appropriate

2.1.4 TFLX-NE的制備 在盡可能減少輔料添加量的原則上，綜合考慮納米乳的載藥量、穩(wěn)定性等因素，將TFLX-NE各成分的比例確定為TFLX 1.36%、牛至油3.24%、RH-40 25.98%、乳酸2.60%、蒸餾水66.82%。

2.2 TFLX-NE的質(zhì)量評價

2.2.1 TFLX-NE的結(jié)構(gòu)類型鑒別 經(jīng)染色法鑒別，在TFLX-NE中，藍(lán)色的次甲基藍(lán)擴(kuò)散速率明顯大于紅色的蘇丹Ⅲ，說明該納米乳為O/W型。

2.2.2 TFLX-NE的微觀形態(tài)觀察 經(jīng)透射電鏡放大30 000倍觀察，TFLX-NE的乳滴呈均勻分散的圓球形，大小均一，無黏連(圖3)。

圖3 托氟沙星納米乳的電鏡圖片F(xiàn)ig.3 TEM micrograph of TFLX-NE

2.2.3 TFLX-NE的粒徑分析 TFLX-NE的粒徑介于6.50～28.21 nm，平均粒徑為16.16 nm(圖4)，表明TFLX-NE為粒徑分布范圍較窄的多分散體系。

圖4 托氟沙星納米乳的粒徑分布Fig.4 Size distribution of TFLX-NE

2.2.4 TFLX-NE的pH測定 經(jīng)測定，TFLX-NE的pH為3.54±0.02。

2.2.5 TFLX-NE的含量測定 經(jīng)紫外可見分光光度儀檢測，TFLX在277.60和315.00 nm處有吸收峰，其中277.60 nm處為最大吸收峰，故選擇277.60 nm為檢測波長(圖5)。由圖6可知TFLX對照品的保留時間為10.88 min，空白納米乳對TFLX-NE中TFLX含量的測定無干擾，該方法具有專屬性。通過線性回歸求得TFLX的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=93 326C+58 260(R2=0.999 8)，表明TFLX在3～100 μg·mL-1的濃度范圍內(nèi)與對應(yīng)峰面積的線性關(guān)系良好(圖7)。表2顯示TFLX-NE的平均回收率為99.33%±1.24%，RSD為1.25%，說明該方法的準(zhǔn)確度較高。TFLX-NE日內(nèi)精密度的平均RSD為0.82%，日間精密度的平均RSD為0.98%，說明該方法的穩(wěn)定性良好。

圖5 托氟沙星的紫外吸收光譜Fig.5 UV absorption spectra of TFLX

2.2.6 TFLX-NE的穩(wěn)定性考察 當(dāng)體系處于最低能級或各反應(yīng)物的反應(yīng)達(dá)到平衡狀態(tài)時，整個體系熱力學(xué)穩(wěn)定。通過一系列穩(wěn)定性試驗，可以考察納米乳的穩(wěn)定性，避免亞穩(wěn)定態(tài)納米載藥體系，篩選出納米乳的最佳配方。將TFLX-NE置于高溫、高濕度、強(qiáng)光照環(huán)境下，未發(fā)生分層、破乳等現(xiàn)象，藥物含量變化均小于5%。該納米乳在40 ℃±2 ℃，相對濕度75%±5%的條件下，密封貯存6個月，其外觀無明顯變化，藥物含量下降為標(biāo)示量的96.82%。通過長期試驗測定，TFLX-NE的標(biāo)示量-時間線性回歸方程為y=-0.27x+99.16(r=-0.897 1)，經(jīng)統(tǒng)計分析，得出該納米乳的有效期估算圖8。當(dāng)藥物含量下降到標(biāo)示量的90%時，標(biāo)示量與95%可信區(qū)間下界線的交點對應(yīng)的時間為24.40月，為保證臨床用藥的有效性，確定TFLX-NE在25 ℃±2 ℃、相對濕度60%±10%的條件下，有效期為24個月。各試驗結(jié)果表明，TFLX-NE的穩(wěn)定性良好，體系處于最低能級狀態(tài)或體系中各物質(zhì)間的化學(xué)反應(yīng)保持在平衡狀態(tài)，進(jìn)一步說明該納米乳的配方優(yōu)良。

圖6 藥品的色譜圖Fig.6 Chromatogram of drugs

圖7 托氟沙星的濃度-峰面積曲線Fig.7 concentration-peak area curve of TFLX

表2 TFLX-NE回收率試驗結(jié)果

Table 2 Results of recovery test of TFLX-NE

樣品濃度/(μg·mL-1)Sampleconcentration實測值/(μg·mL-1)Measuredvalue回收率/%Recoveryratio平均回收率/%MeanrecoveryratioRSD/%10．009．7997．9415．0014．9699．7399．33±1．241．2520．0020．06100．32

圖8 托氟沙星納米乳的有效期估算Fig.8 Estimation image of shelf life of TFLX-NE

2.3 TFLX-NE的急性毒性試驗

2.3.1 LD50測定 14 d內(nèi)未發(fā)生小鼠死亡現(xiàn)象，小鼠被毛光滑，活動有力，天然腔無分泌物，食欲旺盛，未見明顯的中毒癥狀，說明TFLX-NE灌胃給予小鼠的LD50>10 000 mg·kg-1。剖檢可見小鼠的心、肝、脾、肺、腎、胃、腸等均無明顯的病理變化。光鏡下觀察，用藥組小鼠的肝細(xì)胞圍繞中央靜脈呈放射狀整齊排列，核圓形，偶有雙核現(xiàn)象，與正常對照組比較未見明顯差異(圖9 a、b)。用藥組小鼠的十二指腸黏膜層、黏膜下層、基層、漿膜層結(jié)構(gòu)完整，黏膜上皮排列整齊，杯狀細(xì)胞明顯，十二指腸腺發(fā)達(dá)，與正常對照組比較未見明顯差異(圖9 d、e)。用藥組小鼠的腎單位結(jié)構(gòu)完整，腎小管、集合小管上皮細(xì)胞排列整齊，管腔明顯，與正常對照組比較未見明顯差異(圖9 g、h)。

2.3.2 MTD測定 給藥后第2天小鼠自發(fā)活動減少，被毛豎立，第4天開始逐漸恢復(fù)正常，14 d內(nèi)未發(fā)生死亡情況，TFLX-NE灌胃給予小鼠的MTD為0.4 mL·10 g-1，即39.72 g·kg-1。剖檢可見，小鼠的心、肝、脾、肺、腎、腸等主要器官未發(fā)生明顯的病理變化。光鏡下觀察可見，少部分肝細(xì)胞核濃縮、固染，個別有壞死崩解現(xiàn)象(圖9 c)；十二指腸形態(tài)、結(jié)構(gòu)與正常對照組無明顯差異(圖9 f)；腎中腎小管上皮細(xì)胞少量壞死，與基底膜脫離，甚至脫落至管腔內(nèi)(圖9 i)。

3 討 論

本試驗采用先進(jìn)的納米生物技術(shù)，制備TFLX-NE，其乳滴粒徑介于6.50～28.21 nm，成功解決了TFLX難溶于水的困擾。納米乳制備過程中，最重要的是篩選適宜的油相、表面活性劑以及各組分比例的確定。納米乳的油相需在保證對機(jī)體無毒副作用、無刺激性且穩(wěn)定的基礎(chǔ)上，選擇藥物溶解度高的油脂。確定油相后，根據(jù)“相似相溶”原理，在毒性和刺激性較小的常用非離子型表面活性劑中選擇與油相HLB值相同或接近的表面活性劑，再結(jié)合滴定法繪制偽三元相圖，選擇形成納米乳區(qū)面積最大的表面活性劑[19]。TLX-NE制備過程中選擇TFLX溶解度最高的牛至油為最佳油相，EL-40和RH-40的HLB值均接近牛至油的HLB值，但以RH-40為表面活性劑繪制的偽三元相圖乳區(qū)面積大于EL-40，故選擇RH-40為最佳表面活性劑。O/W型納米乳是脂溶性藥物的良好載體，它不僅可通過油相、表面活性劑提高藥物的溶解度，還可加入助表面活性劑、助溶劑增溶[20]。為進(jìn)一步提高TFLX的溶解度，添加乳酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.6%)為助溶劑，使藥物的含量達(dá)到1.36%。TFLX-NE為淡黃色澄清透明液體，乳滴呈圓球形，分布均勻無黏連。測定TFLX-NE中TFLX的含量時，為消除各種雜質(zhì)的干擾，建立了專一、穩(wěn)定、準(zhǔn)確的高效液相色譜法，這與國內(nèi)外學(xué)者檢測TFLX含量常用的方法保持一致[21-22]。經(jīng)各種穩(wěn)定性試驗考察，該納米乳穩(wěn)定性良好，有效期為24個月。

LD50、MTD是評價藥物急性毒性的重要指標(biāo)，可以為長期毒性試驗、生殖毒性試驗、致突變試驗等提供劑量選擇依據(jù)，從而確定臨床用藥的安全性和劑量[23]。灌胃給予小鼠TFLX-NE，其LD50值大于10 000 mg·kg-1，MTD為39.72 mg·kg-1。按照WHO外源性化學(xué)物質(zhì)的急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)，TFLX-NE屬微毒藥物(≥5 000 mg·kg-1)。病理組織切片可以在細(xì)胞水平上反映受試藥物對組織器官的損傷程度。用TFLX-NE進(jìn)行小鼠經(jīng)口毒性試驗，劑量≤10 000 mg·kg-1時，藥物對小鼠的肝、腎、十二指腸均無損傷；劑量提高到MTD時，藥物對小鼠的肝細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞有輕微損傷，對十二指腸無影響，表明TFLX-NE的安全性較高，有巨大的開發(fā)利用價值。

圖9 灌胃給予不同劑量托氟沙星納米乳后小鼠組織器官的病理變化(400×)Fig.9 Pathological changes in the tissues and organs of mice after oral administration with different doses of TFLX-NE(400×)

4 結(jié) 論

成功制備1.36%的托氟沙星納米乳，外觀澄清透明，平均粒徑為16.16 nm，小鼠灌胃LD50>10 000 mg·kg-1，MTD為39.72 mg·kg-1。

[1] ARGUEDAS A G，AKANIRO J C，STUTMAN H R，et al.Invitroactivity of tosufloxacin，a new quinolone，against respiratory pathogens derived from cystic fibrosis sputum[J].AntimicrobAgentsChemother，1990，34(11)：2223-2227.

[2] 焦紅梅，張嬰元.妥舒沙星[J].中國藥學(xué)雜志，1996，31(4)：240-242. JIAO H M，ZHANG Y Y.Tosufloxacin[J].ChinesePharmaceuticalJournal，1996，31(4)：240-242.(in Chinese)

[3] NOUMI T，NISHIDA N，MINAMI S，et al.Intracellular activity of tosufloxacin(T-3262) againstSalmonellaenteritidisand ability to penetrate into tissue culture cells of human origin[J].AntimicrobAgentsChemother，1990，34(6)：949-953.

[4] SEGRETI J，HIRSCH D J，HARRIS A A，et al.Invitroactivity of tosufloxacin(A-61827，T-3262) against selected genital pathogens[J].AntimicrobAgentsChemother，1990，34(6)：971-973.

[5] 陳杖榴.獸醫(yī)藥理學(xué)[M].3版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2009：271-274. CHEN Z L.Veterinary pharmacology[M].3rd edition.Beijing：China Agriculture Press，2009：271-274.(in Chinese)

[6] HOSHINO T，SATO Y，TOYONAGA Y，et al.Nationwide survey of the development of drug resistance in the pediatric field in 2007 and 2010：drug sensitivity ofHaemophilusinfluenzaein Japan(second report)[J].JInfectChemother，2013，19(3)：495-503.

[7] KING A，BETHUNE L，PHILLIPS I.Theinvitroactivity of tosufloxacin，a new fluorinated quinolone，compared with that of ciprofloxacin and temafloxacin[J].JAntimicrobChemother，1991，28(5)：719-725.

[8] NIKI Y.Pharmacokinetics and safety assessment of tosufloxacin tosilate[J].JInfectChemother，2002，8(1)：1-18.

[9] DATE A A，NAGARSENKER M S.Design and evaluation of self-nanoemulsifying drug delivery systems(SNEDDS) for cefpodoxime proxetil[J].IntJPharm，2007，329(1-2)：166-172.

[10] RAO J，MCCLEMENTS D J.Lemon oil solubilization in mixed surfactant solutions：Rationalizing microemulsion & nanoemulsion formation[J].FoodHydrocolloids，2012，26(1)：268-276.

[11] 張志榮.藥劑學(xué)[M].北京：高等教育出版社，2007：125-132. ZHANG Z R.Pharmaceutics[M].Beijing：Higher Education Press，2007：125-132.(in Chinese)

[12] 郭建軍，歐陽五慶，李會芳，等.非潑羅尼納米乳的制備及理化性質(zhì)與安全性分析[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2013，44(7)：1140-1146. GUO J J，OUYANG W Q，LI H F，et al.Preparation and physical and chemical properties and security analysis of fipronil nanoemulsion[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica，2013，44(7)：1140-1146.(in Chinese)

[13] LI J K，HE X Y，LI M Y，et al.Chemical fingerprint and quantitative analysis for quality control of polyphenols extracted from pomegranate peel by HPLC[J].FoodChem，2015，176：7-11.

[14] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(第二部)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010：176-179. Chinese Pharmacopoeia Commission.Chinese pharmacopoeia(PartⅡ)[M].Beijing：Chemical Industry Press，2010：176-179.(in Chinese)

[15] AHMAD J，MIR S R，KOHLI K.Effect of oil and co-surfactant on the formation of Solutol HS 15 based colloidal drug carrier by Box-Behnken statistical design[J].ColloidSurfA-PhysicochemEngAsp，2014，453：68-77.

[16] ANDRIOLE V T.The Quinolones[M].3rd ed.Pittsburgh：Academic Press，2000：255-284.

[17] 曹德英.藥物劑型與制劑設(shè)計[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2009：84-87. CAO D Y.Pharmaceutical dosage form and preparation design[M].Beijing：Chemical Industry Press，2009：84-87.(in Chinese)

[18] GANELLIN C R，TRIGGLE D J.Dicionary of pharmacological agents(volume 2)[M].London：Chapman & Hall，1996：2389-2394.

[19] 周 瑩，歐陽五慶，鄭星星，等.鹽酸布替萘芬納米乳的制備及其質(zhì)量評價[J].中國獸醫(yī)學(xué)報，2013，33(6)：892-897，504. ZHOU Y，OUYANG W Q，ZHENG X X，et al.Preparation and quality evaluation of butenafine hydrochloride nanoemulsion[J].ChineseJournalofVeterinaryScience，2013，33(6)：892-897，504.(in Chinese)

[20] MALCOLMSON C，LAWRENCE M J.A comparison of the incorporation of model steroids into non-ionic micellar and microemulsion systems[J].JPharmPharmacol，1993，45(2)：141-143.

[21] 朱慶玲，郝銳娟，丁 紅.甲苯磺酸妥舒沙星HPLC測定方法的改進(jìn)[J].北方藥學(xué)，2005，2(6)：13-14. ZHU Q L，HAO R J，DING H.Improvement of the assay of tosufloxacin tosylate by HPLC[J].JournalofNorthPharmacy，2005，2(6)：13-14.(in Chinese)

[22] LYON D J，CHEUNQ S W，CHAN C Y，et al.Rapid HPLC assay of clinafloxacin，fleroxacin，levofloxacin，aparfloxacin and tosufloxacin[J].JAntimicrobChemother，1994，34(3)：446-448.

[23] 周立國.藥物毒理學(xué)[M].2版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2011：131-147. ZHOU L G.Drug toxicology[M].2nd ed.Beijing：China Medical Science Press，2011：131-147.(in Chinese)

(編輯 白永平)

Study on the Preparation and Acute Toxicity of Tosufloxacin Nanoemulsion

GAO Xian1，OUYANG Wu-qing1*，LI Meng-yun2，LIU Yue1，WANG Bo-zhen3，ZHENG Yin1，YANG Ming-qi1*

(1.CollegeofVeterinaryMedicine，NorthwestA&FUniversity，Yangling712100，China；2.CollegeofAnimalScienceandVeterinary，HenanUniversityofScienceandTechnology，Luoyang471003，China；3.CollegeofAnimalScienceandVeterinary，ShiheziUniversity，Shihezi832003，China)

The purpose of this study was to prepare tosufloxacin nanoemulsion and to analyse its physical and chemical properties and acute toxicity.The oil phase，surfactant and solubilizer were selected according to the drug loading and stability of the nanoemulsion，the optimum formula was designed using pseudo-ternary phase diagrm，prepared tosufloxacin nanoemulsion.The configuration and particle size of tosufloxacin nanoemulsion were measured by TEM and LPSA.The drug content of tosufloxacin nanoemulsion was determined through High Performance Liquid Chromatography(HPLC).The stability and shelf life were tested by stress testing，accelerated testing and long-term testing.Its acute toxicity was evaluated by gavage testing in mice.The results showed that the optimum formula of tosufloxacin nanoemulsion was composed of tosufloxacin(1.36%)，origanum oil(3.24%)，lactic acid(2.60%)，RH-40(25.98%)，and distilled water(66.82%).The droplet shape of this nanoemulsion was spherical，with the average diameter of 16.16 nm，and its stability was good，the shelf life was 24 months.As the concentrations of tosufloxacin ranged from 3 to 100 μg·mL-1，the concentrations and peak areas showed good linear relationship；the average recovery rate and relative standard deviation of tosufloxacin nanoemulsion were 99.33%±1.24% and 1.25%，respectively；the precision of this nanoemulsion was well.The LD50of tosufloxacin nanoemulsion was greater than 10 000 mg·kg-1，the MTD of this nanoemulsion was 39.72 g·kg-1.The tosufloxacin nanoemulsion was prepared successfully，and it will provide a theoretical basis for the further development of nanoscale antimicrobial agents.

tosufloxacin；nanoemulsion；pseudo-ternary phase diagram；quality evaluation；acute toxicity

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.11.021

2015-02-16

農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項目(2013GB2G000475)

高 嫻(1989-)，女，山西保德人，碩士生，主要從事動物病理學(xué)研究，E-mail：xianzi908111@163.com

*通信作者：歐陽五慶，教授，主要從事新獸藥研發(fā)、納米生物技術(shù)和細(xì)胞生物學(xué)研究，E-mail：oywq506@sina.com；楊鳴琦，教授，主要從事動物病理學(xué)研究，E-mail：xbndymq@163.com

S859.53

A

0366-6964(2015)11-2069-09