林維晟，龔新懷，胡家朋，吳海泉，徐穎惠

(1.武夷學院 生態(tài)與資源工程學院/綠色化工技術福建省高校重點實驗室，福建 武夷山 354300；2.福建邵化化工有限公司，福建 邵武 354000)

酶強化茶皂素修復重金屬污染土壤的研究

林維晟1，龔新懷1，胡家朋1，吳海泉2，徐穎惠1

(1.武夷學院 生態(tài)與資源工程學院/綠色化工技術福建省高校重點實驗室，福建 武夷山 354300；2.福建邵化化工有限公司，福建 邵武 354000)

茶皂素；酶；重金屬污染；土壤；修復；響應面法

以多種重金屬污染的土壤為材料，研究了生物酶、茶皂素和兩者組合等處理方式對重金屬的去除效果。結果表明：酶和茶皂素對土壤中重金屬有良好的去除效果，起到協(xié)同、互補作用。采用響應面法優(yōu)化反應條件，得到pH值4.0、反應溫度35℃、茶皂素溶液和酶溶液配比3 ∶1的最佳淋洗修復條件，此時Cd、Cr、Cu、Ni、Zn去除率分別為88.87%、81.64%、43.33%、47.16%、62.03%，去除率的大小順序為Cd>Cr>Zn>Ni>Cu。酶與茶皂素組合淋洗液能有效去除酸提取態(tài)、可還原態(tài)和可氧化態(tài)的重金屬，表明組合液在重金屬污染土壤修復方面具有較好的應用前景。

土壤是人類賴以生存的物質基礎，當重金屬元素通過各種途徑進入土壤環(huán)境后，容易存留于土壤而被農(nóng)作物吸收，進而通過食物鏈對人體及生態(tài)造成危害。土壤重金屬污染具有隱蔽性、積累性、滯后性和長期性的特點，治理難度很大[1-2]。重金屬污染土壤修復研究已成為土壤修復的重要課題。在眾多土壤修復技術中，淋洗技術被認為是一種可廣泛應用、很有發(fā)展?jié)摿Φ男迯头椒╗3]，其中生物表面活性劑具有低毒性、可生物降解、表面活性高等優(yōu)點，可回收加以重復利用，具有較高的經(jīng)濟價值[4-6]。目前，研究較多的生物表面活性劑有鼠李糖脂、槐糖脂、皂角苷等[7]，其中以皂角苷等最為常見，且價格相對便宜，目前已被廣泛應用于制藥、環(huán)保、化妝品和洗滌劑制作等領域。由于土壤污染具有多樣性和復合性，因此單一的生物表面活性劑往往難以取得良好的修復效果。而生物酶是一種理想的生物螯合劑，具有對環(huán)境營養(yǎng)條件要求不高，對低濃度污染物處理更有效的特性，在和毒物共存時能保持較高活性，在土壤中具有較大的移動性，相比微生物、植物對重金屬污染土壤的處理更具優(yōu)勢[8-9]。利用生物表面活性劑和生物酶組合可有效提高重金屬污染土壤的處理效果。因此，本研究嘗試將酶與茶皂素組合應用于污染土壤中Cd、Cr等重金屬的淋洗、解吸、去除，探討了茶皂素和酶對重金屬的去除效果，并利用響應面法對組合液的去除反應條件進行優(yōu)化，通過對去除前后土壤中重金屬的存在形態(tài)進行比較，綜合評價復合洗脫的效果，以期為重金屬污染土壤修復技術研究提供參考。

1 試驗材料與方法

1.1 供試土樣

土壤樣品采自武夷山市武夷學院明月湖邊，為黏土，自然風干后，過100目篩，用于制作人工污染土壤樣品。將100 g土壤樣品浸入由CuSO4·5H2O、ZnSO4·7H2O、Cd(NO3)2·4H2O、Cr(NO3)3·9H2O、NiCl2·6H2O配制的500 mL混合溶液中(含Cu、Zn、Cd、Cr、Ni分別為100.5、439.7、4.8、365.2、128.1 mg/L)，恒溫振蕩72 h，離心除去上層清液，自然風干陳化2周，備用。經(jīng)測試，該人工污染土壤樣品pH值為6.80，有機質含量為2.87%，陽離子交換容量為12.45 cmol/kg，Cd、Cr、Cu、Ni、Zn含量分別為2.38、93.33、279.38、148.39、89.68 mg/kg。

1.2 試劑與儀器

試驗采用茶皂素(上海鑫純化學試劑有限公司)，臨界膠團濃度(CMC)為0.53 g/L；生物酶(實驗室自制)，酶活為3 200 U/g。試驗儀器為AA-6300原子吸收分光光度計(日本島津公司)等。

1.3 試驗方法

(1)酶處理重金屬污染土壤工藝條件。精確稱取0.6 g人工污染土壤樣品置于錐形瓶中，加入酶溶液15 mL，在不同的質量濃度、反應時間、pH值條件下，35 ℃恒溫振蕩12 h。離心分離后，取上清液用火焰原子吸收分光光度法測定各重金屬含量。

(2)茶皂素處理重金屬污染土壤工藝條件。精確稱取0.6 g人工污染土壤樣品，加入茶皂素溶液15 mL，在不同的質量濃度、反應時間、pH值條件下，25 ℃恒溫振蕩12 h。離心分離，測定各重金屬含量。

(3)酶與茶皂素組合處理重金屬污染土壤工藝條件。在上述試驗的基礎上，精確稱取0.6 g人工污染土壤樣品加入不同配比(茶皂素溶液體積 ∶酶溶液體積)的茶皂素和酶組合液共20 mL，恒溫振蕩12 h，測定各重金屬含量。在單因素的基礎上，根據(jù)Box-Behnken中心組合設計原理，以組合液的pH值、反應溫度、配比3個因素為自變量，重金屬去除率為響應值，進行三因素三水平的響應面分析試驗，試驗因素與水平見表1，以確定土壤重金屬去除的最佳工藝條件。

表1 響應面法分析因素與水平

(4)重金屬形態(tài)的測定。稱取10.0 g人工污染土壤樣品，用茶皂素與酶組合液處理，在最佳工藝條件下，恒溫振蕩12 h，離心后去除上層清液，風干。分別稱取組合液處理前后土壤樣品各3份，每份2.5 g，土樣中重金屬形態(tài)采用BCR法分級提取，原子吸收分光光度法測定，分別測得酸提取態(tài)、可還原態(tài)、可氧化態(tài)和殘渣態(tài)等4種形態(tài)的重金屬含量。

2 結果與分析

2.1 酶溶液pH值、質量濃度和反應時間對重金屬去除率的影響

pH值是影響土壤重金屬去除率的重要因素。Wasay等[10]研究表明，當反應pH值為3.0～5.0時，土壤的理化結構會被破壞，大部分有機螯合物所帶的羧基容易發(fā)生分解，而羧基發(fā)生分解后才能和重金屬結合。為考察酶溶液pH值變化對重金屬去除率的影響，經(jīng)初探性試驗，本試驗設置pH值范圍為3.4～5.0，結果見圖1。由圖1可知，酸性較強時，酶對重金屬的去除率較高，說明酶分子中的巰基和羧基在酸性條件下易分解，與重金屬產(chǎn)生良好的絡合，其中：Cr、Cd在土樣中的存在形態(tài)以酸提取態(tài)為主，在酸性條件下，去除率變化較大；Cu、Zn、Ni在土樣中的存在形態(tài)以可還原態(tài)、可氧化態(tài)和殘渣態(tài)為主，酶較難與之絡合，去除效果相對不理想。

酶質量濃度對重金屬去除效果影響的試驗結果見圖2。由圖2知，酶質量濃度低于0.20%時，重金屬去除率隨酶濃度的升高而增加，主要原因是酶作為蛋白質，需要一定量的重金屬離子作為輔基，在反應初期重金屬的加入能促進酶活性中心與底物產(chǎn)生配位結合，使酶分子及其活性中心保持一定的空間結構，酶催化反應改變了平衡性質和酶蛋白的表面電荷，增強酶活性，起激活作用[11]；當酶質量濃度超過0.20%時，重金屬去除率有所下降，主要原因是重金屬占據(jù)了酶的活性中心，或與酶分子的巰基、胺基和羧基結合，導致酶活性降低，抑制了酶促反應[11]。

圖1 酶溶液pH值對重金屬去除效果的影響

圖2 酶質量濃度對重金屬去除效果的影響

反應時間對重金屬去除效果影響的試驗結果見圖3。由圖3可知，反應時間低于12 h時，重金屬去除率隨反應時間的增加而升高；反應時間達到12 h后，重金屬去除率基本趨于穩(wěn)定。其機理可能是在反應初期受傳質阻力等影響，酶溶液不易進入土壤中與重金屬相結合，因而去除率較低，隨著反應時間增加，酶促反應增加，重金屬的去除率也就提高了；反應中后期，酶的活性中心達到飽和，形成較穩(wěn)定的絡合物，產(chǎn)生與底物的競爭性抑制作用，因此酶促反應速率保持恒定[12]。

圖3 酶溶液反應時間對重金屬去除效果的影響

2.2 茶皂素溶液pH值、質量濃度和反應時間對重金屬去除率的影響

pH值是影響茶皂素去除重金屬的重要因素，溶液pH值對重金屬去除效果影響的試驗結果見圖4。由圖4可知，溶液pH值為3.0～4.0時，土壤中各重金屬的去除率呈一定上升趨勢；pH值為4.0～7.0時，去除率又有明顯下降。分析其原因可能是，pH值為3.0～4.0時，酸性較強，茶皂素中的羧基容易脫氧離子化，降低了茶皂素的CMC(臨界膠束濃度)，形成更多小型膠束，茶皂素更易與重金屬進行絡合，增大重金屬的去除率；pH值為4.0～7.0時，酸性減弱，茶皂素中的羧基不容易脫氧離子化，不利于重金屬的去除。同時，重金屬在土壤中形成了不同的化學形態(tài)，表現(xiàn)出不同的活性與生物有效性。一般來講，pH值為4.0左右時，酸提取態(tài)的重金屬隨有機物的降解得到釋放，容易被生物吸收，因此Cr、Cd去除率較高；而可還原態(tài)、可氧化態(tài)和殘渣態(tài)的重金屬穩(wěn)定程度相對較大，不易釋放，因此Cu、Ni、Zn去除率不高。

圖4 茶皂素溶液pH值對重金屬去除效果的影響

茶皂素質量濃度對重金屬去除效果影響的試驗結果見圖5。由圖5可知，當茶皂素質量濃度較低時，以單分子形式吸附重金屬，重金屬去除率較低；隨著質量濃度的增大，超過其臨界膠束濃度，可形成膠團，這種膠團將重金屬包圍轉移到液相，同時阻止了重金屬與土壤顆粒的重新結合，則重金屬去除率明顯提高；茶皂素質量濃度增加，重金屬離子的去除率隨之提高，但濃度增加到一定數(shù)值后，與重金屬的絡合反應達到平衡，重金屬的去除率趨于穩(wěn)定，因此去除率又有所下降[13-14]。

反應時間對重金屬去除效果影響的試驗結果見圖6。由圖6可知，反應時間在12 h內，隨著時間的增加，各重金屬的去除率明顯上升，12 h后各重金屬去除率變化不大。這可能是因為土壤中的重金屬和茶皂素之間絡合反應的傳質過程需要一定的時間，隨振蕩時間的增加，傳質作用增強，茶皂素進入土壤內部增多，增溶作用增強，重金屬去除率提高。此外，在土壤修復過程中，茶皂素去除重金屬效果還受到金屬形態(tài)、土壤理化性質等因素的共同影響，并且隨振蕩反應時間的增加，重金屬存在重新從水相轉移到土壤中的可能性。在反應后期，各重金屬的解吸與吸附達到動態(tài)平衡，去除率變化不大。

圖5 茶皂素質量濃度對重金屬去除效果的影響

圖6 茶皂素反應時間對重金屬去除效果的影響

以上試驗研究表明，在相似反應條件下，茶皂素和酶對重金屬都有一定的去除效果：茶皂素對Cd、Cr、Zn、Ni有一定去除效果，對Cu的去除效果不理想；酶對Cd、Cr、Zn、Cu有較好的去除效果，對Ni的去除不理想；茶皂素和酶在重金屬去除上形成一定的互補性，說明酶強化茶皂素去除土壤中重金屬是可行的，有利于提高去除效果，實現(xiàn)土壤的“綠色修復”。

2.3 酶與茶皂素組合處理重金屬污染土壤最佳工藝條件

2.3.1 酶與茶皂素配比

采用質量濃度0.2%的酶溶液與質量濃度3.0%的茶皂素混合液對供試土壤進行處理，試驗結果見圖7。由圖7可知，保持混合液總量(20 mL)不變，隨著茶皂素加入量增大，各金屬離子去除率呈上升趨勢；當茶皂素溶液加入量達15 mL時，重金屬的去除率有所下降，即茶皂素加入量15.0 mL、酶加入量5.0 mL、茶皂素溶液和酶溶液的配比為3 ∶1時，各重金屬的去除率達到最大值。試驗表明，一方面酶能增加茶皂素處理效果，表現(xiàn)出協(xié)同增溶、去除作用；另一方面茶皂素用量大于酶的用量，說明重金屬的去除其傳質阻力可能來自于將重金屬從土壤中的增溶、洗脫過程，而重金屬與酶螯合作用阻力小，更易進行。

圖7 不同配比的反應液對各重金屬去除率的影響

2.3.2 組合液處理重金屬污染土壤試驗分析

以Cd為例，采用統(tǒng)計軟件Design Expert進行試驗設計并優(yōu)化，結果見表2。以pH值、配比、反應溫度3個無因次因素為自變量、Cd去除率為響應值，得到Cd去除率對3個無因次因素的二次多元回歸方程為

Y=195.088 4+0.042 1X1+49.401 8X2+

5.281 3X3+15.192 0X12+109.279 7X22+

6.261 8 X32+0.000 1 X1X2+0.012 1 X1X3+

(1)

式中：Y為Cd去除率，%；X1為pH值；X2為酶和茶皂素組合液配比；X3為反應溫度，℃。

表2 回歸模型方差分析

同理，利用響應面法對Cr、Cu、Ni、Zn進行分析，結果表明各回歸方程擬合度和可信度均較高，試驗誤差較小，方程模擬效果好，可用于酶與茶皂素組合處理重金屬Cr、Cu、Ni、Zn污染土壤工藝研究的試驗分析與預測。各因素在試驗范圍內對去除率的影響大小均為pH值(A )>反應溫度(C)>溶液配比(B)。在各因素選取范圍內，通過Design Expert軟件分析回歸模型，得出最優(yōu)去除率工藝參數(shù)為pH值 4.0、反應溫度35 ℃、溶液配比 3 ∶1。響應面法預測出來的最佳結果Cr、Cu、Ni、Zn去除率分別為81.88%、43.47%、47.23%、62.09%。經(jīng)重復試驗，Cr、Cu、Ni、Zn去除率分別為81.64%、43.33%、47.16%、62.03%，與理論預測值相比，相對誤差分別為2.9‰、3.2‰、1.5‰、0.97‰，結果較理想。5種重金屬去除率的大小順序為Cd>Cr>Zn>Ni>Cu。

2.4 修復前后土壤中重金屬形態(tài)變化

在最優(yōu)去除工藝參數(shù)條件下，利用BCR法對組合法處理前后土壤中各重金屬的形態(tài)分析結果見圖8。Cd、Cr主要以酸提取態(tài)存在，Cu、Ni、Zn主要以可氧化態(tài)、殘渣態(tài)存在。處理前，Cd的酸提取態(tài)含量為58.40%，可氧化態(tài)、殘渣態(tài)和可還原態(tài)含量分別為23.94%、9.67%和7.99%；Cr以酸提取態(tài)含量為主，可還原態(tài)和殘渣態(tài)含量相對較少；Ni主要以殘渣態(tài)存在，殘渣態(tài)含量為40.10%，可氧化態(tài)、酸提取態(tài)和可還原態(tài)含量分別為29.80%、18.17%、12.03%；Cu、Zn主要以殘渣態(tài)存在，其含量分別為30.12%、52.99%。經(jīng)茶皂素和酶處理后，各形態(tài)的重金屬含量都有所減少。酸提取態(tài)的Cd幾乎全部被去除，可氧化態(tài)含量明顯下降，可還原態(tài)與殘渣態(tài)的含量也有所減少。Cr的各形態(tài)重金屬變化規(guī)律與Cd基本相似。對于Cu、Ni和Zn，組合液對酸提取態(tài)(交換態(tài)和碳酸鹽結合態(tài))的去除效果較好，去除率分別為82.94%、52.78%、42.78%；對可氧化態(tài)的去除率分別為81.47%、50.53%、46.67%；可還原態(tài)，Cu、Ni的去除率為46.48%、51.69%，Zn去除率不高。殘渣態(tài)Ni的去除率僅為33.45%，去除率較低。朱清清等[13]、李光德等[15]研究表明用皂角苷淋洗條件下，酸提取態(tài)的重金屬最易被去除，其次為可還原態(tài)，可氧化態(tài)和殘渣態(tài)的重金屬則很難被去除。本試驗結果表明，酶與茶皂素組合的淋洗液對酸提取態(tài)的重金屬去除效果最好，對可還原態(tài)、可氧化態(tài)的重金屬也有一定的去除效果。

圖8 茶皂素與酶對土壤中重金屬形態(tài)的影響

3 結 語

(1)酶與茶皂素組合液對土壤中重金屬都具有一定的去除效果，尤其是溶液質量濃度和pH值對重金屬去除效果影響較大。茶皂素和酶有相似的去除反應條件，且在重金屬去除方面有一定的互補，因此兩者組合對重金屬污染土壤進行生態(tài)修復是可行的。

(2)優(yōu)化試驗結果表明，采用質量濃度0.2%的酶和質量濃度3.0%的茶皂素組合液作為淋洗液，在pH 4.0、反應溫度35 ℃、配比3 ∶1的最佳淋洗修復條件下，Cd、Cr、Cu、Ni、Zn去除率分別為88.87%、81.64%、43.33%、47.16%、62.03%，去除率的大小順序為Cd>Cr>Zn>Ni>Cu。

(3)修復前后土壤中重金屬的形態(tài)變化表明，因不同存在形態(tài)重金屬與酶、茶皂素的絡合能力不同，故其去除率差別較大。酶與茶皂素組合淋洗液能有效去除酸提取態(tài)、可還原態(tài)和可氧化態(tài)的重金屬，與單一使用茶皂素相比較，重金屬去除率有一定的提高，同時也減少了茶皂素用量，有助于降低處理成本，表明酶與茶皂素組合可用于重金屬污染土壤的修復。

[1] 任仁,張敦信.化學與環(huán)境[M].北京:化學工業(yè)出版社,2002:159-167.

[2] 朱清清.表面活性劑對土壤中重金屬污染的去除研究[D].上海:東華大學,2011:1-2.

[3] 鄧佑,陽小成,尹華軍.化學-生物聯(lián)合技術對重金屬-有機物復合污染土壤的修復研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學,2010,38(4):1940-1942.

[4]Mulligan C N. Environmental applications for biosurfactants[J]. Environmental Pollution,2005,133(2):183-198.

[5]Mulligan C N,Yong R N,Gibbs B F.Heavy metal removal from sediments by biosurfactants[J].Journal of Hazardous Materials,2001,85(1-2):111-125.

[6]Hong K J,Tokunaga S,Kajiuchi T. Evaluation of remediation process with plant-derived biosurfactant for recovery of heavy metals from contaminated soils[J].Chemosphere,2002,49(4):379-387.

[7]Mulligan C N,Yong R N,Gibbs B F, et al. Metal removal from contaminated soil and sediments by the biosurfactant surfactin[J].Environmental Science and Technology,1999,33(21):3812-3820.

[8]Nannipieri P, Bollag J M. Use of enzymes to detoxify pesticides-contaminated soils and waters[J].Journal Environment Quality,1991,20(3):510-517.

[9]Bollag J M. Decontaminating soil with enzymes[J].Environment Science & Technology, 1992, 26(10):1876-1881.

[10] Wasay S A, Barrington S, Tokunaga S.Organic acids for the insitu remediation of soils polluted by heavy metals: Soil flushing in columns[J].Water Air and Soil Pollution,2001,127(1-4):301-314.

[11]和文祥,朱銘莪,張一平.土壤酶與重金屬關系的研究現(xiàn)狀[J].土壤與環(huán)境,2000,9(2):139-142.

[12]費楊,王曉麗.重金屬污染對土壤酶活性的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學,2014,42(1):99-101.

[13]朱清清,邵超英,張琢,等.生物表面活性劑皂角苷增效去除土壤中重金屬的研究[J].環(huán)境科學學報,2010,30(12):2491-2498.

[14]蔣煜峰,展惠英,張德懿,等.皂角苷絡合洗脫污灌土壤中重金屬的研究[J].環(huán)境科學學報,2006,26(8):1315-1319.

[15]李光德,張中文,敬佩,等.茶皂素對潮土重金屬污染的淋洗修復作用[J].農(nóng)業(yè)工程學報,2009,25(10):231-235.

(責任編輯 李楊楊)

福建省科技廳區(qū)域重大項目(2012Y3008)；福建省教育廳高校專項項目(JK2011058)；南平市科技局科技計劃項目(N2012Z06(4))

X53

A

1000-0941(2015)06-0044-05

林維晟(1972—)，男，福建福州市人，講師，碩士，主要從事環(huán)境生物技術方面的研究。

2014-09-16