楊 堃

(重慶市食品藥品檢驗(yàn)所，重慶市藥物過程與質(zhì)量控制工程技術(shù)研究中心，重慶，401121)

小兒感冒顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

楊 堃

(重慶市食品藥品檢驗(yàn)所，重慶市藥物過程與質(zhì)量控制工程技術(shù)研究中心，重慶，401121)

目的：建立小兒感冒顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：用TLC法鑒別了小兒感冒顆粒中廣藿香、菊花、連翹和用HPLC法測(cè)定了小兒感冒顆粒中連翹苷的含量；色譜柱為DiamonsilTMC18柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)，柱溫為30 ℃，以乙腈-水(24∶76)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為202 nm，流速1.0 mL/min。結(jié)果：在TLC色譜中均能檢出百秋李醇、菊花、連翹苷；且特征斑點(diǎn)明顯，陰性無干擾；連翹苷在0.023 62 μg～0.590 5 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，r=0.99999(n=6)，平均回收率為99.06%，RSD=1.5%.結(jié)論：方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好；可用于小兒感冒顆粒的質(zhì)量控制。

小兒感冒顆粒；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；TLC；HPLC；連翹苷

小兒感冒顆粒是由廣藿香、菊花、連翹、地黃、白薇、地骨皮、石膏、大青葉、板藍(lán)根等共10味藥組成的復(fù)方制劑，收載于《中華人民共和國藥典》2010年版一部[1]，功用為疏風(fēng)解表，清熱解毒。原標(biāo)準(zhǔn)僅收載大青葉、板藍(lán)根的薄層色譜鑒別。本文在既往研究的基礎(chǔ)上，本文采用薄層色譜法對(duì)方中廣藿香、連翹、菊花進(jìn)行了定性鑒別，并采用高效液相色譜法制定了方中連翹(以連翹苷計(jì))含量測(cè)定方法，為更好地控制小兒感冒顆粒的質(zhì)量提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 小兒感冒顆粒(批號(hào)為：20120206、20120207、20120208，云南白藥集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)，廣藿香、連翹、菊花等處方中的各味藥材由太極集團(tuán)重慶桐君閣藥廠有限公司提供。百秋李醇(批號(hào)：772-200008)、菊花(批號(hào)：121384-200801)、連翹苷(批號(hào)：110821-200805)，購自中國藥品生物制品檢定研究院。

1.2 儀器 高效液相色譜儀：Agilent HP1100(包括四元泵，柱溫箱，自動(dòng)進(jìn)樣器，二級(jí)管陣列檢測(cè)器)；KQ3200B型超聲波清洗器(功率500W，頻率40KHZ)。

1.3 試藥 硅膠G(化學(xué)純，青島海洋化工廠)，其余試劑、試藥均為分析純。

2 方法

2.1 薄層鑒別

2.1.1 廣藿香的薄層鑒別[2]取本品24 g，研細(xì)，加乙醚適量，浸泡24 h以上，時(shí)時(shí)振搖，濾過，濾液低溫蒸干，殘?jiān)右宜嵋阴? mL使溶解，作為供試品溶液。另取百秋李醇對(duì)照品，加乙酸乙酯制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(附錄Ⅵ B)試驗(yàn)，吸取供試品溶液20～30 μL，對(duì)照品溶液1～2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(30～60 ℃)-乙酸乙酯-冰醋酸(95∶5∶0.2)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸試液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照無干擾。(見圖1)

圖1 小兒感冒顆粒廣藿香的TLC鑒別圖譜

注：1.陰性對(duì)照(缺廣藿香)25 μL；2.樣品(云南白藥集團(tuán)，批號(hào)：20120206)20 μL；3.樣品(云南白藥集團(tuán)，批號(hào)：20120207)20 μL；4.樣品(云南白藥集團(tuán)，批號(hào)：20120208)20 μL；5.百秋李醇對(duì)照品2 μL

2.1.2 菊花的薄層鑒別[3-4]取本品6 g，研細(xì)，加甲醇30 mL，超聲處理20 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，用稀鹽酸調(diào)pH值至2～3，用乙酸乙酯振搖提取3次，每次20 mL，合并乙酸乙酯提取液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取菊花對(duì)照藥材1 g，加稀鹽酸1 mL和乙酸乙酯20 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)右宜嵋阴? mL使溶解，作為對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法(附錄Ⅵ B)試驗(yàn)，吸取供試品溶液1～2 μL，對(duì)照藥材溶液2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(7∶3∶0.5)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%三氯化鋁乙醇試液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照無干擾。(見圖2)

2.1.3 連翹的薄層鑒別[5-7]取本品6 g，研細(xì)，加甲醇30 mL，超聲處理20 min，濾過，濾液蒸干。殘?jiān)?.2%氫氧化鈉溶液20 mL，加熱使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次20 mL；取正丁醇提取液，再用正丁醇飽和的水洗滌2次，每次30 mL，合并正丁醇液，蒸干，殘?jiān)?.2%氫氧化鈉溶液20 mL，加熱使溶解，再用三氯甲烷振搖提取3次，每次20 mL；合并三氯甲烷提取液，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取連翹苷對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。吸取供試品溶液10 μL～15 μL和對(duì)照品溶液10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-甲酸(9∶1∶0.1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸試液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照無干擾[8]。(見圖3)

圖2 小兒感冒顆粒菊花的TLC鑒別圖譜

注：1.陰性對(duì)照(缺菊花)2 μL；2.樣品(云南白藥集團(tuán)，批號(hào)：20120206)1 μL；3.樣品(云南白藥集團(tuán)，批號(hào)：20120207)1 μL；4.樣品(云南白藥集團(tuán)，批號(hào)：20120208)1 μL；5.菊花對(duì)照藥材3 μL

圖3 小兒感冒顆粒連翹的TLC鑒別圖譜

注：1.陰性對(duì)照(缺連翹)；2.樣品(云南白藥集團(tuán)，批號(hào)：20120206)；3.樣品(云南白藥集團(tuán)，批號(hào)：20120207)；4.樣品(云南白藥集團(tuán)，批號(hào)：20120208)；5.連翹苷對(duì)照品

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 藥味的選擇 按處方中君臣藥味的要求，我們先對(duì)方中廣藿香[9-10](百秋李醇計(jì))的GC含量測(cè)定[11]方法進(jìn)行了研究，其含量太低，無測(cè)定意義，故對(duì)連翹[12](以連翹苷計(jì))含量測(cè)定方法進(jìn)行了研究，通過試驗(yàn)考察，建立了HPLC含量測(cè)定方法。

2.2.2 色譜條件[13]色譜柱：用十八烷基硅烷鍵和硅膠為填充劑；流動(dòng)相：乙腈-水(24∶76)；檢測(cè)波長(zhǎng)：202 nm；柱溫30 ℃；流速：1.0 mL/min；理論塔板數(shù)：按連翹苷峰計(jì)應(yīng)不低于3 000。

2.2.3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取在110 ℃干燥至恒重的連翹苷對(duì)照品適量，加50%甲醇制成每1 mL含20 μg的溶液，即得。

2.2.4 供試品溶液的制備[14-15]取裝量差異項(xiàng)下的本品，研細(xì)，取約6 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率500 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液10 mL，蒸干，殘?jiān)舆m量70%乙醇使溶解，加在中性氧化鋁柱(100～200目，5 g，內(nèi)徑1.5 cm)上，用70%乙醇溶液100 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)?0%甲醇適量使溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。精密量取10 μL，進(jìn)樣，記錄色譜圖[6-9]。

2.2.5 陰性對(duì)照試驗(yàn) 取缺連翹的陰性對(duì)照約6 g，同供試品溶液的制備方法制成陰性對(duì)照溶液，注入液相色譜儀，結(jié)果在連翹苷對(duì)照品出峰時(shí)間處無對(duì)應(yīng)色譜峰出現(xiàn)，表明陰性對(duì)照無干擾。(見圖4)

圖4 小兒感冒顆粒HPLC圖

注：1.連翹苷對(duì)照品；2.小兒感冒顆粒樣品；3.陰性對(duì)照(缺連翹)

2.2.6 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 我們用二級(jí)管陣列檢測(cè)器分別對(duì)連翹苷對(duì)照品、小兒感冒顆粒樣品進(jìn)行光譜分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)202 nm為連翹苷最大吸收，且其他成分峰在此處吸收值很小，故選用202 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.2.7 線性范圍 分別精密吸取連翹苷對(duì)照品溶液(濃度0.023 62 mg/mL)1 μL、5 μL、10 μL、15 μL、20 μL、25 μL，注入液相色譜儀測(cè)定峰面積，結(jié)果見表1。

表1 線性關(guān)系試驗(yàn)結(jié)果

以連翹苷峰面積(A)為縱坐標(biāo)，連翹苷對(duì)照品進(jìn)樣量(g)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：y=9692.2x+17.929r=1。

上述結(jié)果表明，連翹苷對(duì)照品進(jìn)樣量在0.023 62 μg～0.590 5 μg的范圍內(nèi)，與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2.8 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取連翹苷對(duì)照品溶液(濃度0.023 62 mg/mL)10 μL，重復(fù)進(jìn)樣5次，按上述色譜條件測(cè)定峰面積，結(jié)果見下表。試驗(yàn)結(jié)果表明，儀器精密度良好。

表2 儀器精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別吸取常溫下放置的同一供試品溶液10 μL，于0、2、4、8、12 h進(jìn)樣，測(cè)定，結(jié)果見下表。試驗(yàn)結(jié)果表明，供試品溶液至少在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

表3 供試品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.2.10 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)樣品(批號(hào)20120207)，按含量測(cè)定項(xiàng)下供試品制備方法平行制備5份供試品溶液，并測(cè)定含量，結(jié)果見下表。試驗(yàn)結(jié)果表明，方法重復(fù)性良好。

表4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.2.11 回收率試驗(yàn) 取本品(批號(hào)20120207，已測(cè)定連翹苷含量為0.046 0 mg/g)3 g，共6份，精密稱定，分別精密加入連翹苷對(duì)照品溶液(5.905 μg/mL)25 mL，稱定重量，同供試品溶液的制備方法制備，并按擬訂的色譜條件測(cè)定連翹苷含量，按下式計(jì)算回收率，結(jié)果見表5。試驗(yàn)結(jié)果表明，加樣回收率均在95%～105%間，符合有關(guān)的技術(shù)要求。

表5 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

2.2.12 方法耐用性試驗(yàn) 按正文擬訂的含量測(cè)定方法，分別對(duì)樣品2采用不同牌號(hào)的色譜柱，分別測(cè)定連翹苷的含量，計(jì)算，結(jié)果見表6。試驗(yàn)結(jié)果表明，方法耐用性試驗(yàn)良好。

表6 方法耐用性試驗(yàn)結(jié)果

2.2.13 樣品測(cè)定 取樣品3批，按上述色譜條件和方法測(cè)定連翹苷的含量，測(cè)定結(jié)果見表7。

表7 小兒感冒顆粒中連翹苷的含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

在連翹的TLC鑒別方法中，若采用含量測(cè)定的方法處理樣品，所得樣品中連翹苷的斑點(diǎn)顯色不理想，整個(gè)樣品斑點(diǎn)底色較重，故采用的是正文中樣品處理辦法，結(jié)果很好。我們?cè)x用連翹同法制備對(duì)照藥材溶液，結(jié)果顯示：其在與樣品相應(yīng)位置上的斑點(diǎn)顯色不清晰，較小，且陰性對(duì)照有個(gè)別斑點(diǎn)干擾，故放棄。

樣品含量測(cè)定的處理方法參照文獻(xiàn)經(jīng)過試驗(yàn)摸索，曾對(duì)連翹苷的提取方法考察了:TLC法中樣品處理方法；直接甲醇超聲提取進(jìn)樣；和甲醇超聲提取蒸干后，水溶解再用三氯甲烷提取等方法。所得樣品存在雜質(zhì)峰較多，主峰與雜質(zhì)峰不能分離，重現(xiàn)性不好和回收率低等問題。同時(shí)我們考察了正文方法中甲醇超聲時(shí)間，過柱用中性氧化鋁用量，洗脫溶劑的濃度和用量，最終確定的正文方法能將樣品中所含的連翹苷提取完全，回收率平均在100%上，且樣品溶液色譜圖中連翹苷色譜峰分離度好、峰形尖銳、對(duì)稱性好，理論板數(shù)大于3 000，各項(xiàng)參數(shù)能滿足HPLC的相關(guān)要求。

小兒感冒顆粒為兒科常用藥，有有糖型和無糖型兩種劑型；且生產(chǎn)廠家眾多，包裝規(guī)格也不同，我們當(dāng)時(shí)選取市面上上述兩種劑型和不同廠家規(guī)格的共18批次進(jìn)行試驗(yàn)，按此質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，均能檢出；此標(biāo)準(zhǔn)可行。

[1]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典(一部)[S].北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2010:500-501.

[2]韓桂茹，董占軍.小兒感冒顆粒的薄層鑒別和定量測(cè)定研究[J].中成藥，2004，26(11):445-446.

[3]田雅琴.HPLC法測(cè)定小兒感冒顆粒中綠原酸及連翹苷含量[J].中成藥，2009,31(12):484-485.

[4]范磊.小兒感冒顆粒的質(zhì)量控制方法研究[J].中國醫(yī)藥指南，2013,11(35):661-663.

[5]國家中醫(yī)藥管理局.國家中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編—外科婦科分冊(cè)[S]，483-484.

[6]國家中醫(yī)藥管理局.國家中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編—口腔腫瘤兒科分冊(cè)[S]，49-50.

[7]孫武強(qiáng)，李海峰.小兒感冒顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].河南中醫(yī)，2004,24(8):223-224.

[8]國家中醫(yī)藥管理局.桑菊感冒合劑[M].國家中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編—內(nèi)科—肺系(一)，2002.

[9]張穎梅.HPLC法同時(shí)測(cè)定廣藿香中雷杜辛黃酮醇及廣藿香酮的含量[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013,19(16):254-456.

[10]張小龍，孫曉，馬新飛.氣相色譜法同時(shí)測(cè)定小兒感冒顆粒中百秋李醇、薄荷腦、α-蒎烯、β-蒎烯的含量[J].首都醫(yī)藥，2014(22):311-312.

[11]王春燕.氣相色譜法測(cè)定小兒感冒顆粒中百秋李醇的含量[J].首都醫(yī)藥，2011(4):187-188.

[12]吳平平，李桂龍.小兒感冒顆粒中綠原酸測(cè)定方法的改進(jìn)[J].中草藥，2011,42(6):212-214.

[13]張偉，張漢明，等.HPLC法測(cè)定連翹藥材及感冒退熱顆粒中連翹苷的含量[J].中成藥，1999，21(9):329-330.

[14]《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》.新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)第二冊(cè)[S].1993，7.

[15]劉杰，陳卓，馬開.薄層掃描法測(cè)定雙黃連制劑中連翹苷的含量[J].中成藥，1999，21(8):314-316.

(2014-04-26收稿 責(zé)任編輯：張文婷)

Study of Quality Standard of Xiao’er Ganmao Granules

Yang Kun

(ChongqingInstituteforFoodandDrugControl，ChongqingEngineeringresearchCenterforPharmaceuticalProcessandQualityControl401121,China)

Objective:To establish the quality standards for Xiao’er Ganmao Granules. Methods: Pogostemonis herba, chrysanthemi flos, and forsythiae fructus were identified with TLC. Phillyrin was meatured by HPLC. DiamonsilTMC18(5 μm，4.6 mm×250 mm) column was used. The column temperature was at 30 ℃. Acetonitrile-water (24∶76) was used as a mobile phase. The detection wavelength was at 202 nm. The flow rate was 1.0 mL/min. Results: Patchouli alcohol, chrysanthemi flos, and forsythiae could be detected by TLC, with the feature spot obvious, negative interference-free. Phillyrin showed a good linear relationship at the range of 0.02362～0.5905μg，r=0.99999 (n=6)，The average recovery rate was 99.06% and RSD was 1.5%. Conclusion: TLC method proves to be simple, accurate and with good reproducibility, thus can be used for quality control of Xiao，er Ganmao Granule.

Xiao’er Ganmao Granules; Quality standards; TLC; HPLC; Phillyrin

楊堃，重慶市食品藥品檢驗(yàn)所中藥室，E-mail:yk418@tom.com

R284.1

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.03.032