魏慶雙 孫忠人 楊添淞 李 佳 郭恒瑞 楊佳鵬

(1 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),哈爾濱,150040; 2 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院,哈爾濱,150040)

PI3K/Akt信號(hào)通路介導(dǎo)電針促進(jìn)血管生成的研究進(jìn)展

魏慶雙1孫忠人2楊添淞2李 佳1郭恒瑞1楊佳鵬1

(1 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),哈爾濱,150040; 2 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院,哈爾濱,150040)

有效的促進(jìn)損傷的愈合是一項(xiàng)有意義且具有挑戰(zhàn)性的工程,許多臨床工作者提出了不同的治療手段,其中,電針傍刺是簡(jiǎn)便易行且行之有效的一種方法,并且電針被認(rèn)為可通過(guò)活化PI3K/AKT信號(hào)通路達(dá)到加速損傷組織愈合目的,本文對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路介導(dǎo)電針促進(jìn)血管生成進(jìn)行了深入的研究。此研究將對(duì)糖尿病性皮膚損害,老年性,難治性潰瘍等的中醫(yī)電針治療提供理論幫助。

電針;PI3K/AKT信號(hào)通路;損傷修復(fù);血管再生

電針刺激已被廣泛應(yīng)用于創(chuàng)傷的修復(fù)[1-2],臨床上也取得了一定的療效,然而其作用的細(xì)胞機(jī)制需要我們進(jìn)一步探索。傷口愈合對(duì)維持多細(xì)胞生物的完整性是至關(guān)重要的。血管再生是損傷修復(fù)中不可缺少的環(huán)節(jié),而這一過(guò)程取決于內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、增殖。在現(xiàn)有的所有研究中,人們已經(jīng)認(rèn)識(shí)到,切斷一個(gè)上皮細(xì)胞層瞬間產(chǎn)生內(nèi)源性電場(chǎng),對(duì)傷口愈合非常重要。此電場(chǎng)不僅影響再上皮化,同時(shí)也促進(jìn)了血管的重建。Zhao M等[3]發(fā)現(xiàn),在75V/m的電場(chǎng)中,人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)向負(fù)極定向遷移,其細(xì)胞的長(zhǎng)軸方向與電場(chǎng)垂直,同時(shí)電場(chǎng)中的創(chuàng)面細(xì)胞發(fā)生了形態(tài)學(xué)改變:細(xì)胞膜向負(fù)極突出,而且胞內(nèi)纖維狀肌動(dòng)蛋白在電場(chǎng)的影響下分布不均勻。電場(chǎng)強(qiáng)度越強(qiáng),這種現(xiàn)象越明顯。Zhao M等[4]發(fā)現(xiàn):電信號(hào)通過(guò)激活PI3K/AKT信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)控制損傷組織血管再生進(jìn)程。PI3激酶/蛋白激酶b在細(xì)胞的定向遷移中起到羅盤(pán)的作用。在無(wú)血清培養(yǎng)基中,電場(chǎng)迅速而且特異性的激活了中性粒細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞的PI3K/AKT信號(hào)通路[4];最顯著的是,在細(xì)胞的遷移方向上,此信號(hào)通路的激活是極性的。電場(chǎng)的極性反轉(zhuǎn)時(shí),細(xì)胞膜突出的方向和細(xì)胞遷移的方向也隨之反轉(zhuǎn)[5-6];PI3K基因缺失或者藥理性抑制都會(huì)廢除損傷修復(fù)中角膜上皮細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞的趨電性,這些結(jié)果表明,電場(chǎng)誘導(dǎo)的PI3K定向激活是細(xì)胞定向遷移的基礎(chǔ)[7];現(xiàn)在將PI3K/Akt信號(hào)通路與損傷修復(fù)血管再生綜述如下。

1 PI3K/AKT信號(hào)通路

1.1 PI3K的結(jié)構(gòu)與作用 PI3-K是由Whitman等[8]于1988年首次發(fā)現(xiàn),是一種脂類(lèi)第二信使,與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)?？杀籊2蛋白耦聯(lián)受體或受體酪氨酸激酶激活,具備脂類(lèi)激酶、蛋白激酶活性,負(fù)責(zé)使磷脂酰肌醇(PI)肌醇環(huán)上3'羥基發(fā)生磷酸化,從而激活其下游靶點(diǎn)?？煞譃?種類(lèi)型:I型、II型、III型,由各自作用底物不同而區(qū)分。I型PI3-k可以磷酸化磷脂酰肌醇(Phosphatidylinositol,PI)，磷脂酰肌醇-4-磷酸(Phos-phatidylinositol-4-bisphosphate,PI4P)和磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(Phospha-tidylinositol-4,5-bisphosphate,PI-4、5-P2)但在細(xì)胞內(nèi)卻主要以PI-4,5-P2為主,此酶的產(chǎn)物主要是磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸(Phosphatidylinositol-3,4,5-bisphosphate,PI-3,4,5-P3)。II型PI3K主要能磷酸化PI及PI4P;III型PI3K僅能磷酸化PI,生成PI3P;上述3種類(lèi)型均由催化亞基P110和調(diào)節(jié)亞基P85構(gòu)成。P110共有P110α、β、γ、δ4種亞構(gòu)體,其中α、β、δ 3種主要存在于哺乳動(dòng)物中,每一種亞基異構(gòu)體均有四個(gè)結(jié)構(gòu)域,分別為催化域、PIK結(jié)構(gòu)域、C2結(jié)構(gòu)域及Ras結(jié)構(gòu)域,并通過(guò)N未端區(qū)與調(diào)節(jié)亞單位結(jié)合。P85有p85a、β、p55α、ε和p50α5種亞構(gòu)體。靜息狀態(tài)下,調(diào)節(jié)亞基抑制催化亞基的活性;其受體的內(nèi)源性酪氨酸激酶活性被胰島素激活，導(dǎo)致自身磷酸化和胰島素受體底物(Insulin-receptor Substrate,IRS)的酪氨酸磷酸化[9],酪氨酸磷酸化的IRS通過(guò)自身SH2結(jié)構(gòu)域招募到PI-3K的P85，從而解除對(duì)P110的抑制作用，使PI-3K活化[10]。

1.2 Akt(PKB)的結(jié)構(gòu)與作用 蛋白激(PKB)是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶,由于該激酶為反轉(zhuǎn)錄病毒Akt-8癌基因V-akt編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物,所以稱(chēng)為Akt[11],分子量為60 kDa,是蛋白激酶A(PKA)及蛋白激酶C(PKC)的高度同源物(PKA為68%,PKC為73%),因此又被命名為A/C相關(guān)激酶(RAC)。它是PI3K的一個(gè)下游靶點(diǎn)，Akt有3種亞型Aktl(PKBα)、Akt2(PKBβ)和Akt3(PKBγ)。PKBα與PKBβ和PKBγ分別有近81%和83%的同源性。Akt主要由3個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成,分別是N端AH/PH結(jié)構(gòu)域(1-147)、中心催化結(jié)構(gòu)域(148-411)及C端尾部區(qū)(412-480)[12]。細(xì)胞受到胞外信號(hào)刺激后,PI3K的產(chǎn)物PIP3與Akt N端的PH結(jié)構(gòu)域結(jié)合,使Akt的Ser124和Thr450位點(diǎn)磷酸化[13],同時(shí)使PIP3依賴(lài)激酶(PIP3-dependent Kinase)PDK1、PDK2分別催化Akt的Thr308和Ser473磷酸化,從而引起級(jí)聯(lián)反應(yīng)。Aktl和Akt2在人體組織中普遍表達(dá);而Akt3的表達(dá)主要在腦、腎、睪丸、骨骼肌等組織中[14]。

1.3 PI3K/Akt的調(diào)控 PI3K/Akt信號(hào)通路主要參與細(xì)胞的增殖,分化和遷移,既有抗凋亡作用又有促凋亡作用。研究表明PI3K/Akt信號(hào)通路與癌癥、孤獨(dú)癥、胰島素抵抗、阿爾茲海默氏病、精神分裂等密切相關(guān)。除此之外,PI3K/Akt信號(hào)通路被證實(shí)還與血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移有著密切的關(guān)系[15]。PI3K/Akt信號(hào)通路主要調(diào)控途徑有:1)通過(guò)抑制FKHR、NF-κB、YAP,促進(jìn)CREB、Mdm2等轉(zhuǎn)錄因子的活性,調(diào)控凋亡;2)抑制Bad和caspase-9磷酸化,抑制凋亡;3)抑制GSK-3活性,抑制凋亡;4)使eNOS的Ser1177位點(diǎn)發(fā)生磷酸化,從而激活eNOS[16]。

2 PI3K/AKT信號(hào)通路與損傷修復(fù)血管再生的關(guān)系

血管生成是傷口愈合的重要環(huán)節(jié),是指血管內(nèi)的成熟分化的內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移,最終以出芽的方式,從已存在的血管床中長(zhǎng)出新的血管,或者由骨髓內(nèi)的內(nèi)皮祖細(xì)胞(Endothelial Progenitor Cell,EPC),經(jīng)過(guò)遷移、增殖、分化形成新的血管。一氧化氮(NO)是一種強(qiáng)大的血管生成遞質(zhì),具有調(diào)節(jié)血管生成因子的作用,能刺激血管生成[17];Akt磷酸化及其下游eNOS的磷酸化是內(nèi)皮細(xì)胞合成NO的重要途徑[18-19],在NOS作用下,以左旋精氨酸(L-Arg)為底物,利用氧生成NO和L-瓜氨酸,以非囊泡形式釋放,NO易通過(guò)彌散出入質(zhì)膜,直接進(jìn)入相鄰的細(xì)胞,在局部發(fā)揮作用,性質(zhì)活潑,半衰期僅為3～6 s。內(nèi)皮細(xì)胞的存活、增殖、遷移均離不開(kāi)NO的調(diào)節(jié)。除此之外NO還被證實(shí)與內(nèi)皮細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)之間的黏附有關(guān)。已有研究表明，NO能促進(jìn)VEGF和MMP的表達(dá)并抑制TIMP-1的表達(dá),加速內(nèi)皮細(xì)胞的增殖及細(xì)胞基質(zhì)的降解。

有研究表明,在eNOS基因敲除或被抑制表達(dá)的鼠中,損傷愈合過(guò)程明顯延長(zhǎng),在皮膚的損傷愈合過(guò)程的早期可有大量NOS的表達(dá),活性明顯增高,傷后10 d持續(xù)性產(chǎn)生,傷后14-35dNOS活性基本趨于緩和[20]。艾明等[21]通過(guò)western blot技術(shù)在體外模型中研究明確,PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與COX-2對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)負(fù)向調(diào)控,這種調(diào)控可被選擇性的COX-2抑制劑所抑制,并且這種抑制作用涉及到PI3K/Akt表達(dá)的變化。AKT抑制劑也已進(jìn)入臨床試驗(yàn)，哌立福辛和米替福辛在多發(fā)性骨髓瘤和體外培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞血管的形成中有明顯的抗血管生成作用[22-24]。

胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)在新生血管的形成和發(fā)展過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用。IGF-1具有廣闊的生物學(xué)功能,它是一種結(jié)構(gòu)和功能都類(lèi)似于胰島素的多肽類(lèi)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子,是可以使得細(xì)胞提前進(jìn)入細(xì)胞復(fù)制前期的一種感受肽促進(jìn)因子。研究表明其具體通路可能為,激活的IGF-1將進(jìn)一步激活PI3K,增加磷脂酰肌醇-3,-4,-5三磷酸化水平,然后三磷酸化的磷脂酰肌醇-3,-4,-5結(jié)合到磷脂酰肌醇依賴(lài)激酶-1和Akt的血小板-白細(xì)胞C激酶底物同源性區(qū)域。從而開(kāi)始Akt和一些其他信號(hào)分子如蛋白激酶C和A的磷酸化,再引起下游的反應(yīng)[25]。Yoshitomi等[26]報(bào)道PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)于eNOS的磷酸化與激活關(guān)系密切。Liu等[27]報(bào)道在MCAO模型中使用氯沙坦,通過(guò)PI3 K/Akt信號(hào)通路磷酸化eNOS而改善缺血再灌注損傷。Dmitriy等[28]研究表明,腦缺血后1 h內(nèi)內(nèi)皮細(xì)胞釋放eNOS增加,8 h內(nèi)達(dá)高峰。

3 小結(jié)與展望

皮膚損傷后瞬間產(chǎn)生內(nèi)源性電場(chǎng),對(duì)傷口愈合非常重要。此電場(chǎng)不僅影響再上皮化,同時(shí)也促進(jìn)了血管的重建。在此電場(chǎng)的作用下，PI3K/Akt信號(hào)通路發(fā)揮作用,內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生增殖、遷移,參與損傷修復(fù)過(guò)程中的血管再生。同時(shí),我們課題組近期研究觀察到,在特定的電流條件下,電針傍刺對(duì)皮膚創(chuàng)傷后的血管重建有促進(jìn)作用。這提示我們?cè)谝恍┞?難治性創(chuàng)面上,通過(guò)涉及PI3K/Akt信號(hào)通路的藥物干預(yù)或者外加電刺激成為了加速其愈合的新的方式。而電針激活PI3K/Akt信號(hào)通路的細(xì)胞機(jī)制,目前尚待進(jìn)一步深入研究。

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(2015-01-12收稿 責(zé)任編輯：王明)

Research Progress of PI3K/Akt Signal Transduction Pathway on Angiogenesis

Wei Qingshuang1, Sun Zhongren2, Yang Tiansong2, Li Jia1, Guo Hengrui1,Yang Jiapeng1

(1HeilongjianguniversityofChinesemedicine,Harbin150040,China; 2TheFirstAffiliatedHospitalofHeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040，China)

Effective wound healing has been a lasting and challenging topic in health care. Various strategies have been used to accelerate and perfect the healing process. One such strategy has involved the application of an exogenous electrical stimulus to chronic wounds with the aim of stimulating healing responses. The biology of electric stimulation to instigate healing, however, is very poorly understood. This study provides theoretical support to the treatment of diabetic skin lesions, senile and refractory ulcer with electric stimulation.

Electric field; PI3K/AKT signaling pathway; Injury repair; Angiogenesis

黑龍江省自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(編號(hào):ZD201315)

魏慶雙(1985—),男,2012級(jí)針灸推拿專(zhuān)業(yè)博士研究生

孫忠人(1960—),男,教授,主任醫(yī)師,博士研究生導(dǎo)師,主要從事針刺防治腦與脊髓神經(jīng)疾病的研究，E-mail:258079427@qq.com

R245.31+9

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.03.040