孫文利 張曉旭 黃志英 陳 暢 康 琛 高 健 段飛鵬田朋朋 陳 坤 李德鳳 劉玉欣 李韶菁

(1 河北大學(xué)藥學(xué)院，保定，071002； 2 中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京，100700；3 中國藥科大學(xué)藥學(xué)院，南京，211198； 4 北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京，100102)

去氫木香內(nèi)酯對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠肝損傷的保護(hù)作用

孫文利1，2張曉旭1，2黃志英2，3陳 暢2康 琛2高 健2段飛鵬4田朋朋1，2陳 坤4李德鳳2劉玉欣1李韶菁2

(1 河北大學(xué)藥學(xué)院，保定，071002； 2 中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京，100700；3 中國藥科大學(xué)藥學(xué)院，南京，211198； 4 北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京，100102)

目的：研究去氫木香內(nèi)酯對(duì)大鼠肝損傷模型的保護(hù)作用。方法：以氨基半乳糖、四氯化碳建立大鼠肝損傷模型，分別設(shè)正常對(duì)照組、模型組、陽性藥對(duì)照組(0.2 mg/kg)、去氫木香內(nèi)酯高、中、低劑量組(45 mg/kg，15 mg/kg，5 mg/kg)，測(cè)定各組大鼠血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Alanine Aminotransferase，ALT)、天門冬酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Aspartate Aminotransferase，AST)活性及肝組織中丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量。另以HE、Masson染色，對(duì)各組大鼠肝臟作病理檢查。結(jié)果：與模型組相比，去氫木香內(nèi)酯可顯著降低大鼠血清ALT、AST的活性及MDA的含量(P<0.05)，減輕大鼠肝臟壞死性病理改變。結(jié)論：去氫木香內(nèi)酯對(duì)大鼠肝臟損傷有較好的保護(hù)作用。

去氫木香內(nèi)酯；肝損傷；氨基半乳糖；四氯化碳

肝臟疾病是人類最常見的疾病之一，其中肝損傷、肝纖維化、肝硬化是臨床常見病和多發(fā)病。肝損傷是肝炎、飲酒、寄生蟲導(dǎo)致的常見癥狀，肝硬化是肝損傷遷延或反復(fù)的結(jié)果，肝纖維化是肝損傷和肝硬化的橋梁[1]。

去氫木香內(nèi)酯(Dehydrocostus Lactone)(結(jié)構(gòu)見圖1)是菊科云木香屬植物木香干燥根的主要活性成分。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，其具有很好的抗癌[2]、抗菌[3-4]、抗高血酯[5]、抑制胃潰瘍[6]、增加胃腸蠕動(dòng)等作用[7]。本試驗(yàn)首次研究了去氫木香內(nèi)酯對(duì)氨基半乳糖和四氯化碳肝損傷大鼠動(dòng)物模型的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 雄性Wistar大鼠120只，SPF級(jí)，體重220～260 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，合格證號(hào)SCXK(京)2012-0001。

圖1 去氫木香內(nèi)酯結(jié)構(gòu)，分子式C15H18O2，分子量230.1307

1.2 藥品及試劑 去氫木香內(nèi)酯(純度98%)，購自百靈威科技有限公司；陽性對(duì)照藥：雙環(huán)醇，北京協(xié)和藥廠；秋水仙堿，北京嘉林藥業(yè)股份有限公司；氨基半乳糖，北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司；CCl4為分析級(jí)，中國北京化工廠；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Alanine Aminotransferase，ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Aspartate Aminotransferase，AST)、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所(批號(hào)20100505)；水合氯醛，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 儀器 高速低溫冷凍離心機(jī)(J2-21，美國Beckman Coulter公司)；酶標(biāo)儀(Spectra Max M5，美國Molecular Devices公司)；全自動(dòng)生化儀(7180型，日立公司)；75 mm組織勻漿器(涿州市琦瑞玻璃制品廠)。

1.4 動(dòng)物分組及給藥 將Wistar大鼠隨機(jī)分為氨基半乳糖肝損傷組和四氯化碳肝損傷組，每組60只，每組又分為6小組，即正常對(duì)照組(Nor組，等量溶媒)、模型組(Mod組，等量溶媒)；雙環(huán)醇組(0.2 mg/kg/d)，去氫木香內(nèi)酯高、中、低劑量組(45，15，5 mg/kg/d)，每組10只。

1.5 模型的制備

1.5.1 氨基半乳糖肝損傷模型 除Nor組外，各組以氨基半乳糖溶液造模，8.5%腹腔注射，1 mL/100 g，同時(shí)50%乙醇灌胃，5 mL/kg，每周2次。造模后次日給藥，連續(xù)7 d。

1.5.2 CCl4肝損傷模型 除Nor組外，各組以50% CCl4花生油灌胃造模，2 mL/kg，同時(shí)10%乙醇灌胃，5 mL/kg，每周2次，造模4周后給藥。

1.6 指標(biāo)檢測(cè) 給藥4周后，以水合氯醛腹腔麻醉取材，拍攝肝臟外觀；腹主動(dòng)脈采血后，3 000 r/min離心10 min，采用全自動(dòng)生化儀測(cè)定血清ALT、AST活性。同時(shí)取肝右葉，用冰生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干，稱取0.5 g，加生理鹽水4.5 mL，轉(zhuǎn)入預(yù)冷了的勻漿器中制成肝勻漿，用于測(cè)定肝組織中MDA含量。取左下葉肝臟，用10%中性甲醛固定，石蠟包埋、切片，HE、Masson染色觀察病理變化。

2 結(jié)果

2.1 去氫木香內(nèi)酯對(duì)氨基半乳糖肝損傷模型的影響 結(jié)果表明，與正常組相比，模型組ALT、AST、MDA含量顯著上升(P<0.05)；與模型組相比，陽性藥和去氫木香內(nèi)酯可顯著降低大鼠血清ALT、AST及肝組織中MDA的含量(P<0.05)，高劑量組效果最明顯，以上作用有劑量依賴性。表明去氫木香內(nèi)酯對(duì)氨基半乳糖肝損傷大鼠有保護(hù)作用，結(jié)果見表1。如圖2所示，模型組肝臟顏色灰黃、表面顆粒密布，而給藥組肝臟顏色發(fā)紅，表面光滑，色澤發(fā)亮，高劑量組最明顯。病理結(jié)果可見(圖3)，模型組肝硬化明顯，膠原纖維明顯增生，出現(xiàn)假小葉，腹水現(xiàn)象嚴(yán)重，去氫木香內(nèi)酯組大鼠肝纖維化程度明顯改善，無肝萎縮和腹水現(xiàn)象，表明去氫木香內(nèi)酯具有抗損傷、抗肝硬化，逆轉(zhuǎn)肝纖維化作用。

組別劑量/mg/kgALT(U/L)AST(U/L)MDA(nmol.mg/g.pro)正常組-68.9±20.973.5±8.38.9±1.1模型組-345.7±56△△395.3±63△△11.9±2.8△△雙環(huán)醇0.2197.8±70**291.4±76**10.1±1.1*去氫木香內(nèi)酯5266.8±65*321.5±74*9.5±1.7*15212.6±83**293.6±80**9.4±1.4**45190.7±56**269.6±75**9.1±1.9**

注：△P<0.05，△△P<0.01 vs normal group，*P<0.05，**P<0.01 vs model group

2.2 去氫木香內(nèi)酯對(duì)四氯化碳肝損傷和肝硬化模型的影響 結(jié)果表明，與正常組相比，模型組ALT、AST、MDA含量顯著上升(P<0.05)；與模型組相比，陽性藥和去氫木香內(nèi)酯可顯著降低大鼠血清ALT、AST、MDA的含量(P<0.05)，去氫木香內(nèi)酯組大鼠肝纖維化程度明顯改善，肝纖維化計(jì)分明顯降低，以上作用有劑量依賴性。提示去氫木香內(nèi)酯對(duì)肝臟纖維化和硬化大鼠有保護(hù)作用，結(jié)果見表2。模型組肝臟顏色灰黃、表面顆粒密布，而給藥組肝臟顏色發(fā)紅，表面光滑，色澤發(fā)亮，高劑量組最明顯。病理結(jié)果可見(圖4)，模型組肝硬化明顯，膠原纖維明顯增生，出現(xiàn)假小葉，有肝萎縮和腹水現(xiàn)象，去氫木香內(nèi)酯組大鼠肝纖維化程度明顯改善。

表2 去氫木香內(nèi)酯對(duì)四氯化碳肝損傷和肝硬化模型的影響

注：△P<0.05，△△P<0.01 vs normal group，*P<0.05，**P<0.01 vs model group

圖2 去氫木香內(nèi)酯對(duì)肝損傷大鼠肝臟的影響

注：A.正常組；B.模型組；C.陽性藥組；D.去氫木香內(nèi)酯(5 mg/kg)組；E.去氫木香內(nèi)酯(15 mg/kg)組；F.去氫木香內(nèi)酯(45 mg/kg)組

圖3去氫木香內(nèi)酯對(duì)氨基半乳糖肝損傷大鼠的病理學(xué)影響

注：A.正常組；B.模型組；C.雙環(huán)醇組；D.去氫木香內(nèi)酯(5 mg/kg)組；E.去氫木香內(nèi)酯(15 mg/kg)組；F.去氫木香內(nèi)酯(45 mg/kg)組

3 討論

氨基半乳糖(GaIN)肝損傷模型是經(jīng)典的動(dòng)物模型之一。是目前公認(rèn)的比較好的研究病毒性肝炎的發(fā)病機(jī)制及有效治療藥物的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。GaIN是一種肝細(xì)胞磷酸尿嘧啶核苷干擾劑，可造成肝彌漫性壞死和炎癥，其引起的肝臟病理變化與臨床病毒性肝炎相似。GaIN可以引起質(zhì)膜損害，在肝細(xì)胞內(nèi)形成尿苷二磷酸一半乳糖胺復(fù)合物，耗竭尿苷三磷酸，致使質(zhì)膜結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)合成減少，膜出現(xiàn)損傷；GalN也可改變細(xì)胞內(nèi)離子濃度，引起肝細(xì)胞內(nèi)Ca2+增多，Mg2+減少。Ca2+增多使線粒體功能受到抑制，激活磷脂酶，加速氧化自由基產(chǎn)生，加劇肝細(xì)胞損傷[8]。另外GaIN還可引起肝細(xì)胞的代謝紊亂而導(dǎo)致肝損傷[9]。

圖4 去氫木香內(nèi)酯對(duì)四氯化碳肝損傷大鼠的病理學(xué)影響

注：A.正常組；B.模型組；C.秋水仙堿組；D.去氫木香內(nèi)酯(5 mg/kg)組；E.去氫木香內(nèi)酯(15 mg/kg)組；F.去氫木香內(nèi)酯(45 mg/kg)組

CCl4在肝臟細(xì)胞微粒體內(nèi)的細(xì)胞色素P450的作用下，產(chǎn)生自由基(三氯甲基自由基、三氯甲基過氧自由基和氯自由基)及一系列氧活性物，使細(xì)胞膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜等發(fā)生氯烷基化和脂質(zhì)過氧化，損傷膜的結(jié)構(gòu)和功能，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞死亡[10]。CCl4致肝損傷主要表現(xiàn)為血清中AST、ALT量增加和肝上皮細(xì)胞脂質(zhì)過氧化或壞死，在病理上主要表現(xiàn)為上皮細(xì)胞腫脹、脂肪變性，繼而破裂壞死，大量枯氏細(xì)胞聚集吞噬，隨著損傷程度加深，肝細(xì)胞增殖減弱，膠原纖維大量堆積，形成條索狀增生。

在肝組織中，ALT主要分布于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，AST主要分布于細(xì)胞質(zhì)和線粒體中[11]。正常情況下，血清中ALT、AST甚少，當(dāng)肝臟出現(xiàn)任何原因?qū)е碌母谓M織損傷或細(xì)胞破壞、壞死時(shí)，酶從細(xì)胞內(nèi)逸出進(jìn)入血液，血清中ALT、AST含量將明顯升高[12]。因此，血清ALT、AST的升高是肝損傷的重要標(biāo)志，轉(zhuǎn)氨酶在一定程度上反映了肝細(xì)胞損害和壞死程度[13]。與正常組比較，模型組大鼠血清中AST和ALT含量升高，肝細(xì)胞受到明顯損傷；而經(jīng)去氫木香內(nèi)酯治療后，各劑量組均可不同程度的降低肝損傷大鼠血清AST、ALT的升高，以上結(jié)果提示去氫木香內(nèi)酯對(duì)大鼠免疫性肝損傷具有較好的保護(hù)作用。

脂質(zhì)過氧化在肝損傷的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。MDA脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物自由基可誘發(fā)和增強(qiáng)機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化作用，導(dǎo)致細(xì)胞膜系統(tǒng)損傷及其功能喪失[14]。本研究表明去氫木香內(nèi)酯對(duì)肝損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抑制機(jī)體脂質(zhì)過氧化功能有關(guān)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，去氫木香內(nèi)酯在降酶、抗自由基及脂質(zhì)過氧化方面有明顯的作用，從病理結(jié)果來看，去氫木香內(nèi)酯改善了大鼠肝纖維化程度。本文首次證明了去氫木香內(nèi)酯對(duì)肝損傷有一定的保護(hù)作用。

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(2014-11-15收稿 責(zé)任編輯：張文婷)

The Protective Effect of Dehydrocostus Lactone on Liver Injury in Laboratory Rats

Sun Wenli1, 2, Zhang Xiaoxu1,2, Huang Zhiying2,3, Chen Chang2,Kang Chen2, Gao Jian2, Duan Feipeng4,Tian Pengpeng1,2, Chen Kun4, Li Defeng2, Liu Yuxin1, Li Shaojing2

(1CollegeofPharmacy,HebeiUniversity,HebeiBaoding071002,China; 2ChinaInstituteofChineseMateriaMedica,ChinaAcademyofChineseMedicalSciences,Beijing100700,China; 3CollegeofPharmacy,ChinaPharmaceuticalUniversity,JiangsuNanjing211198,China; 4BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100102,China)

Objective:To investigate the protective effect of Dehydrocostus lactone on liver injury in experimental rats. Methods: Rats were injected with galactosamine and carbon tetrachloride to induce liver injury. The model rats were randomly divided into normal group, vehicle control, positive control group (0.2 mg·kg-1), high, middle, and low Dehydrocostus lactone dose groups (45, 15 and 5 mg·kg). The changes of activity of ALT, AST in serum and MDA content in liver tissue were measured. The pathologic change of liver tissue was examined under light microscope by HE and Masson staining. Results: Compared with the vehicle group, Dehydrocostus lactone remarkably decreased (P< 0.05) the activities of ALT, AST in serum and MDA content in liver tissue. It was observed that Dehydrocostus lactone could significantly alleviate the necrotic pathologic change of liver tissue. Conclusion: Dehydrocostus lactone has protective effects on liver injury in labortary rats.

Dehydrocostus lactone; Liver injury; Galactosamine; Carbon tetrachloride

重大新藥創(chuàng)制國家科技重大專項(xiàng)(編號(hào)：2012ZX09103201-055)；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：81274133，81303261)；中國中醫(yī)科學(xué)院自主選題項(xiàng)目(編號(hào)：ZZ2014005，ZZ2014060)

孫文利(1989.12—)，女，漢，碩士研究生，藥物分析專業(yè)，研究方向：藥物代謝和分子藥理學(xué)，E-mail：sunwenli1215@163.com

李韶菁(1974.3—)，女，漢，博士，副研究員，研究方向：中藥組效關(guān)系和分子藥理學(xué)研究，E-mail：shaojingli2004@126.com；劉玉欣(1956.12—)，男，漢，博士，教授，研究方向：細(xì)胞及分子藥理學(xué)研究，E-mail：yuxinliu@hbu.edu.cn

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.03.025