張幫勇，薛玉英，唐萌

(環(huán)境醫(yī)學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇省生物材料與器件重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，東南大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，江蘇 南京 210009)

·綜 述·

納米銀誘導(dǎo)細(xì)胞毒性和遺傳毒性研究進(jìn)展

張幫勇，薛玉英，唐萌

(環(huán)境醫(yī)學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇省生物材料與器件重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，東南大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，江蘇 南京 210009)

伴隨納米銀的廣泛應(yīng)用，人體和環(huán)境暴露于其的機(jī)會(huì)迅速增加，其安全性評(píng)價(jià)越來(lái)越受到關(guān)注。體外細(xì)胞毒性研究表明，納米銀可以穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞器，進(jìn)而影響細(xì)胞活性，誘導(dǎo)DNA損傷和細(xì)胞凋亡。作者就目前納米銀誘導(dǎo)細(xì)胞毒性和遺傳毒性研究進(jìn)展作一綜述，并從納米銀特性和細(xì)胞類型角度討論對(duì)納米銀毒效應(yīng)的影響。

納米銀； 細(xì)胞毒性； 遺傳毒性； 文獻(xiàn)綜述

由于納米銀具有廣譜抗菌性，使其在醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，比如傷口敷料、心血管埋植劑、醫(yī)用導(dǎo)管和藥物載體等[1]。此外，納米銀也應(yīng)用于食品行業(yè)、紡織品、化妝品等領(lǐng)域[2]。伴隨納米銀在醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)和日常生活用品的廣泛應(yīng)用，人體和環(huán)境暴露于納米銀的機(jī)會(huì)迅速增加，而目前關(guān)于納米銀的安全性評(píng)價(jià)體系尚未建立。體內(nèi)研究表明，納米銀經(jīng)口、皮膚、呼吸等途徑暴露，經(jīng)血液或淋巴系統(tǒng)循環(huán)可以分布到肺、肝臟、腎臟、脾臟，甚至大腦[3-4]。說(shuō)明納米銀以其特有屬性可以穿過(guò)生物屏障，對(duì)機(jī)體器官和組織產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)。體外研究表明，納米銀可以穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞器、誘導(dǎo)細(xì)胞形態(tài)改變、細(xì)胞活力下降、線粒體損傷和細(xì)胞凋亡；另一方面納米銀可以誘導(dǎo)細(xì)胞DNA損傷，染色體畸變和細(xì)胞周期抑制[5]。因此，在關(guān)注納米銀的健康效應(yīng)和廣泛使用時(shí)，關(guān)于納米銀的安全性也應(yīng)受到重視。值得注意的是，體外研究多使用不同特性納米銀暴露于不同細(xì)胞，這給納米銀體外安全性評(píng)價(jià)帶來(lái)一定困難。作者就近幾年關(guān)于納米銀體外細(xì)胞毒性和遺傳毒性研究作一綜述，同時(shí)從納米銀特性如尺寸、形狀、表面修飾和細(xì)胞類型角度來(lái)討論影響納米銀毒效應(yīng)的因素。

1 納米銀誘導(dǎo)細(xì)胞毒性

1.1 細(xì)胞攝取和分布

納米銀暴露于細(xì)胞，被細(xì)胞膜受體識(shí)別、內(nèi)在化和轉(zhuǎn)移，最終沉積在細(xì)胞或被細(xì)胞清除。體外研究顯示納米銀可以穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞器如細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、溶酶體、線粒體等[6-8]。但是關(guān)于納米銀如何進(jìn)入細(xì)胞、在細(xì)胞內(nèi)如何轉(zhuǎn)移的相關(guān)報(bào)道還比較少。Singh等[9]使用共聚焦顯微鏡和透射電鏡發(fā)現(xiàn)水合粒徑43.9 nm納米銀染毒小鼠巨噬細(xì)胞質(zhì)中存在納米銀顆粒，進(jìn)一步研究表明巨噬細(xì)胞吞噬納米銀牽涉清道夫受體調(diào)節(jié)。而Asharani等[10]研究發(fā)現(xiàn),6～20 nm納米銀通過(guò)網(wǎng)格蛋白依賴性內(nèi)吞和大胞飲進(jìn)入人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞，并且存在時(shí)間依賴性胞吐，但胞吞速度大于胞吐。

1.2 細(xì)胞活性改變

細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變是細(xì)胞損傷最直觀的體現(xiàn)，研究表明多種細(xì)胞暴露納米銀可以引起細(xì)胞收縮、形態(tài)不規(guī)則，并且具有劑量依賴性[10-12]。除了形態(tài)學(xué)改變，納米銀誘導(dǎo)細(xì)胞活性改變?cè)谠S多研究中也被報(bào)道。細(xì)胞活性可以體現(xiàn)細(xì)胞的存活、死亡和新陳代謝活動(dòng)。體外研究發(fā)現(xiàn)納米銀染毒人皮膚癌細(xì)胞、人纖維肉瘤細(xì)胞、人肺癌上皮細(xì)胞、人白血病細(xì)胞、人肝癌細(xì)胞活性呈現(xiàn)劑量依賴性下降[12-14]。乳酸脫氫酶(LDH)廣泛存在于細(xì)胞質(zhì)中，可以將乳酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸，當(dāng)細(xì)胞質(zhì)膜完整性被破壞，LDH流出。因此，細(xì)胞上清液中LDH活力也可以作為細(xì)胞損傷標(biāo)志。納米銀染毒人白血病細(xì)胞和肝癌細(xì)胞都發(fā)現(xiàn)細(xì)胞上清液中LDH活力增強(qiáng)[14]，表明細(xì)胞膜完整性受損。

1.3 細(xì)胞凋亡及相關(guān)機(jī)制研究

納米銀誘導(dǎo)細(xì)胞損傷，最終引起細(xì)胞凋亡/壞死。Foldbjerg等[13]發(fā)現(xiàn)納米銀[(69±3)nm]染毒人肺癌上皮細(xì)胞壞死/晚期凋亡呈劑量依賴性增加。此外，納米銀誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞和人急性髓性白血病細(xì)胞凋亡率增加也被報(bào)道[9,15]。關(guān)于納米銀誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡機(jī)制，目前還不清楚。體外研究報(bào)道納米銀可以通過(guò)腫瘤壞死因子受體通路、線粒體途徑、DNA損傷通路和活性氧通路等誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[16]。

1.3.1線粒體途徑 線粒體在細(xì)胞存活與死亡中扮演重要的角色，凋亡中多種關(guān)鍵事件涉及線粒體，包括釋放含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)活化劑(如細(xì)胞色素C)、改變電子轉(zhuǎn)移、線粒體膜電位丟失、改變細(xì)胞內(nèi)氧化還原、參與抗凋亡Bcl-2家族蛋白[17]。Piao等[18]發(fā)現(xiàn)5～10 nm納米銀通過(guò)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)人肝細(xì)胞凋亡，通過(guò)調(diào)整Bax和Bcl-2表達(dá)，導(dǎo)致線粒體膜電位下降，進(jìn)而釋放細(xì)胞色素C激活caspases 9和3，引起細(xì)胞凋亡。線粒體膜電位的下降可以作為細(xì)胞應(yīng)激早期指示器，引起線粒體功能紊亂，反過(guò)來(lái)引起細(xì)胞損傷。Guo等[15]發(fā)現(xiàn)人急性髓性白血病細(xì)胞暴露于11 nm聚乙烯吡咯烷酮(PVP)包被納米銀，可以誘導(dǎo)細(xì)胞線粒體膜電位下降。

1.3.2活性氧與細(xì)胞凋亡 體外研究顯示納米銀可以誘導(dǎo)多種細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)增加[6,11,15]。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)自由基生成遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于自身清除能力時(shí)，就會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激。在細(xì)胞水平，氧化應(yīng)激可以誘導(dǎo)細(xì)胞從增殖到生長(zhǎng)抑制、衰老甚至死亡[19]。N乙酰半胱氨酸(NAC)經(jīng)常作為抗氧化劑用于體外研究。Guo等[15]使用11 nm PVP包被納米銀對(duì)人急性髓性白血病細(xì)胞染毒24 h，使用NAC前處理細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)5 mmol·L-1NAC能有效阻止細(xì)胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生、細(xì)胞線粒體膜電位下降、DNA損傷和細(xì)胞凋亡。Kim等[6]發(fā)現(xiàn),10 mmol·L-1NAC前處理人肝癌細(xì)胞可以減少ROS產(chǎn)生，提高細(xì)胞活性，減少DNA損傷。機(jī)體本身具有清除自由基的能力，比如谷胱甘肽(GSH)和維生素C等非酶系物質(zhì)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶和超氧化物歧化酶(SOD)等酶系。Arora等[12]使用7～20 nm納米銀對(duì)人皮膚癌細(xì)胞和人纖維肉瘤細(xì)胞染毒，發(fā)現(xiàn)納米銀可以降低兩株細(xì)胞GSH含量，減少SOD活力，增加脂質(zhì)過(guò)氧化作用，表明納米銀進(jìn)入細(xì)胞后引起細(xì)胞內(nèi)氧化還原體系失衡，過(guò)多的自由基進(jìn)一步引起細(xì)胞損傷。此外，過(guò)多的活性氧持續(xù)存在，將激活細(xì)胞信號(hào)通路，比如促分裂原激活蛋白激酶通路、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶通路、腫瘤抑制蛋白p53信號(hào)、核因子κB信號(hào)，進(jìn)而引起基因表達(dá)改變，誘導(dǎo)細(xì)胞存活或死亡[19]。

2 納米銀誘導(dǎo)遺傳毒性

2.1 DNA損傷和染色體畸變

在研究納米銀遺傳毒性時(shí)，一些經(jīng)典的毒理學(xué)方法如彗星試驗(yàn)、微核試驗(yàn)和染色體畸變分析被應(yīng)用。Asharani等[7]使用彗星試驗(yàn)和微核試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，6～20 nm淀粉包被納米銀誘導(dǎo)正常人肺成纖維細(xì)胞和人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞DNA尾距和微核數(shù)量增加。Mei等[20]使用5 nm未包被納米銀對(duì)鼠淋巴瘤細(xì)胞染毒，發(fā)現(xiàn)在3～6 μg·ml-1染毒濃度下細(xì)胞突變體增加；通過(guò)雜合型丟失分析胸苷激酶突變發(fā)現(xiàn)納米銀誘導(dǎo)染色體改變。Asharani等[10]也發(fā)現(xiàn)6～20 nm納米銀在25 μg·ml-1劑量下能引起正常人肺纖維細(xì)胞和惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞染色體畸變。Sahu等[21]采用細(xì)胞松弛素B阻滯微核試驗(yàn)研究20 nm納米銀對(duì)人肝癌細(xì)胞和結(jié)腸癌細(xì)胞遺傳毒性，結(jié)果顯示兩株細(xì)胞中具雙核的細(xì)胞呈現(xiàn)濃度和時(shí)間依賴性增加。之后Sahu等[22]又使用流式細(xì)胞術(shù)來(lái)評(píng)估20 nm納米銀染毒人肝癌細(xì)胞和結(jié)腸癌細(xì)胞微核率，結(jié)果表明，人肝癌細(xì)胞微核率呈濃度依賴性增加，人結(jié)腸癌細(xì)胞微核率也有增加。

和以上關(guān)于納米銀誘導(dǎo)細(xì)胞微核增加和染色體畸變報(bào)道相比，其他研究還有不同的報(bào)道。Kim等[23]使用小于100 nm納米銀對(duì)鼠淋巴瘤細(xì)胞和人支氣管上皮細(xì)胞染毒，通過(guò)彗星試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)顯著增加細(xì)胞尾距，但沒(méi)有發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)細(xì)胞突變。同樣地，Nymark等[24]研究PVP包被納米銀對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞遺傳毒性，發(fā)現(xiàn)納米銀染毒細(xì)胞尾距顯著增加，但是沒(méi)有發(fā)現(xiàn)微核形成和染色體畸變?？赡茉蚴荘VP包被減少了納米銀和細(xì)胞的直接交互，或者PVP減少了銀離子釋放，或者是納米銀聚集減少了細(xì)胞吸收。由此可見(jiàn)，納米銀特性和細(xì)胞類型對(duì)納米銀誘導(dǎo)遺傳毒性有影響；相比之下，彗星試驗(yàn)在評(píng)估遺傳毒性時(shí)比微核試驗(yàn)和染色體畸變分析更敏感。

DNA損傷類型中最嚴(yán)重的是DNA雙鏈斷裂，如果修復(fù)不及時(shí)，可以引起細(xì)胞死亡，或造成染色體轉(zhuǎn)位及遺傳信息丟失[25]。近些年的研究發(fā)現(xiàn)組蛋白H2AX磷酸化(γ-H2AX)有可能成為衡量DNA損傷程度，特別是DNA雙鏈斷裂的良好指標(biāo)[25]。Ahamed等[26]發(fā)現(xiàn)，25 nm納米銀染毒鼠胚胎干細(xì)胞和鼠胚胎纖維母細(xì)胞中DNA損傷修復(fù)蛋白R(shí)ad51表達(dá)增加，組蛋白H2AX磷酸化。在納米銀染毒人肝癌細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)γ-H2AX存在劑量依賴性增強(qiáng)[6]。除了DNA雙鏈斷裂，一般認(rèn)為DNA加合物形成是多階段致癌作用中的關(guān)鍵起始事件。體外研究發(fā)現(xiàn)，納米銀染毒人肺癌上皮細(xì)胞DNA加合物增加[13]，表明細(xì)胞DNA受損。

2.2 細(xì)胞周期阻滯

細(xì)胞周期是細(xì)胞從一次分裂完成開(kāi)始到下一次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的全過(guò)程。在細(xì)胞增殖過(guò)程中有4個(gè)明顯的階段：DNA合成準(zhǔn)備期(G1期)、DNA合成期(S期)、蛋白質(zhì)合成和有絲分裂準(zhǔn)備期(G2期)和有絲分裂期(M期)。Liu等[27]發(fā)現(xiàn)人肝癌細(xì)胞暴露于5、20、50 nm納米銀，細(xì)胞周期在G1期減少，在S期阻滯。此外，納米銀誘導(dǎo)鼠成纖維細(xì)胞、人肺纖維細(xì)胞和膠質(zhì)瘤細(xì)胞在G2/M期阻滯也被報(bào)道，細(xì)胞在G2/M期阻滯表明DNA損傷并啟動(dòng)修復(fù)，如果修復(fù)不成功，可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡[7-8]。

3 影響毒性效應(yīng)因素

3.1 尺寸

Liu等[27]發(fā)現(xiàn)5 nm納米銀比20 nm和50 nm納米銀更加容易進(jìn)入人肝癌細(xì)胞，誘導(dǎo)更強(qiáng)的細(xì)胞增殖、細(xì)胞膜損傷、活性氧產(chǎn)生、細(xì)胞周期抑制和細(xì)胞凋亡。同樣地，Avalos等[14]使用不同尺寸納米銀染毒人肝癌細(xì)胞和白血病細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)4.7 nm比42 nm納米銀能誘導(dǎo)更大的細(xì)胞增殖抑制和細(xì)胞膜損傷。關(guān)于小尺寸納米銀誘導(dǎo)更強(qiáng)的毒效應(yīng)機(jī)制還不清楚，小尺寸納米銀可能更加容易通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞器，進(jìn)而引起細(xì)胞損傷。此外，小尺寸納米粒子具有更大的比表面積和更高的表面反應(yīng)活性，可能誘導(dǎo)更強(qiáng)的細(xì)胞損傷。

3.2 表面化學(xué)修飾

為改善納米銀分散性和穩(wěn)定性，經(jīng)常對(duì)納米銀進(jìn)行表面修飾，比如淀粉、多糖、碳?xì)浠衔铩⒖s氨酸、PVP和檸檬酸鈉等。不同表面修飾可能影響納米銀與細(xì)胞相互作用，目前體外關(guān)于不同表面修飾納米銀誘導(dǎo)毒效應(yīng)研究較少。Ahamed等[26]使用25 nm多聚糖包被納米銀和未包被納米銀對(duì)鼠胚胎干細(xì)胞和鼠胚胎纖維母細(xì)胞染毒，結(jié)果表明多聚糖包被納米銀比未包被納米銀表現(xiàn)更大的細(xì)胞和遺傳毒性。可能是包被的納米銀比未包被納米銀分散性更好，不容易聚集，因此更加容易進(jìn)入細(xì)胞器，引起生物學(xué)作用。而Nguyen等[28]發(fā)現(xiàn)，未包被納米銀比PVP和檸檬酸鹽包被納米銀對(duì)鼠巨噬細(xì)胞和人結(jié)腸上皮細(xì)胞活性抑制性更大；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，未包被納米銀可能誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激，而包被納米銀可能通過(guò)上調(diào)特定細(xì)胞因子誘導(dǎo)細(xì)胞損傷。

3.3 形狀

納米銀具有優(yōu)越的物理、化學(xué)和生物學(xué)特征，使其廣泛應(yīng)用。而納米銀應(yīng)用性能除了受尺寸、純度等因素影響，還與納米銀形狀密切相關(guān)。因此不同形狀納米銀被制備，比如球形、棒狀、三角形和線型等。目前體外細(xì)胞毒性研究多使用球形納米銀，而不同形狀納米銀體外毒性研究較少。Pal等[29]發(fā)現(xiàn)納米銀抗菌具有形狀依賴性，切去頂端的三角形比球形和棒狀納米銀顯示更強(qiáng)的抗菌性。因?yàn)榍腥ロ敹说娜切渭{米銀包含超過(guò)﹛111﹜晶面，表現(xiàn)更高的反應(yīng)性。Stoehr等[30]研究線型納米銀(長(zhǎng)度1.5～25 μm，直徑100～160 nm)、球形納米銀(30 nm)和微米銀(<45 μm)對(duì)肺上皮細(xì)胞A549毒效應(yīng)的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：線型納米銀誘導(dǎo)顯著的細(xì)胞活性下降、LDH釋放率增加和早期鈣內(nèi)流，而球形納米銀對(duì)細(xì)胞幾乎沒(méi)有影響。差異原因可能是線型納米銀可以和細(xì)胞直接交互作用而不是通過(guò)內(nèi)在化。

3.4 細(xì)胞類型

考慮到隨著納米銀的廣泛應(yīng)用，其可以通過(guò)不同暴露途徑進(jìn)入機(jī)體，進(jìn)而分布到不同組織器官，因此不同的細(xì)胞被用于納米銀體外毒性評(píng)估模型，而不同細(xì)胞暴露納米銀又表現(xiàn)出毒效應(yīng)差異。Faedmaleki等[31]發(fā)現(xiàn)，人肝癌細(xì)胞和小鼠原代肝細(xì)胞暴露于20～40 nm納米銀24 h的IC50分別是2.764 μg·ml-1和121.7 μg·ml-1。Asharani等[10]研究6～20 nm納米銀對(duì)人惡性腦膠質(zhì)瘤和人正常肺成纖維細(xì)胞增值抑制作用，發(fā)現(xiàn)納米銀對(duì)腫瘤細(xì)胞具有較明顯的增殖抑制作用，可能原因是成纖維細(xì)胞可以從細(xì)胞周期阻滯中恢復(fù)，而癌細(xì)胞停止增殖。Mukherjee等[11]研究表明，人宮頸癌上皮細(xì)胞比永生化的人角質(zhì)形成細(xì)胞對(duì)納米銀更加敏感，可能是由于兩株細(xì)胞本身抗氧化能力不同導(dǎo)致。綜上可知，原代細(xì)胞比永生化細(xì)胞株對(duì)納米銀抗毒性效應(yīng)更強(qiáng)，細(xì)胞自身屬性不同對(duì)納米銀反應(yīng)也不同。

4 小結(jié)與展望

伴隨納米銀產(chǎn)品的快速發(fā)展，人暴露納米銀機(jī)會(huì)增加，許多研究已經(jīng)開(kāi)始關(guān)注納米銀毒性效應(yīng)。作者主要集中于論述納米銀體外誘導(dǎo)細(xì)胞毒性和遺傳毒性，并從納米粒子特有屬性和細(xì)胞角度探討其對(duì)毒效應(yīng)影響。雖然納米銀體外毒性研究報(bào)道很多，但大多數(shù)報(bào)道是描述性毒理學(xué)內(nèi)容，而缺少關(guān)于納米銀誘導(dǎo)細(xì)胞和遺傳毒性機(jī)制研究。因此，未來(lái)的研究應(yīng)該更加關(guān)注機(jī)制研究，闡明納米銀誘導(dǎo)毒效應(yīng)機(jī)制，為納米銀更好地應(yīng)用提供保證。值得注意的是，體外實(shí)驗(yàn)多采用獨(dú)立的方法評(píng)估納米銀毒效應(yīng)，而且不同研究使用的納米銀物理化學(xué)特性和細(xì)胞模型也不相同，給納米銀體外毒性評(píng)估帶來(lái)困難。因此，建立一套標(biāo)準(zhǔn)的納米銀體外毒性評(píng)估實(shí)驗(yàn)流程顯得尤為重要。

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2015-04-18

2015-05-25

國(guó)家重大科學(xué)研究計(jì)劃項(xiàng)目(2011CB933404)；國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81172697；81473003)；江蘇省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(BK2011606)

張幫勇(1989-)，男，河南信陽(yáng)人，在讀碩士研究生。E-mail:bangyong2009@163.com

薛玉英 E-mail：yyxue@seu.edu.cn

張幫勇，薛玉英，唐萌.納米銀誘導(dǎo)細(xì)胞毒性和遺傳毒性研究進(jìn)展[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2015，34(5)：836-840．

R114

A

1671-6264(2015)05-0836-05

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.05.035