程帥帥,張紅

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 眼科醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150000)

·綜 述·

miR126對角膜新生血管的影響

程帥帥,張紅

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 眼科醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150000)

角膜新生血管是導(dǎo)致視力減退的主要原因之一，多種生長因子可能與其存在著密切的關(guān)系，微小RNA(miRNA)可能調(diào)控這些生長因子的表達。miRNA126(miR126)被證明與角膜新生血管關(guān)系密切，通過影響相應(yīng)靶基因的表達調(diào)控血管新生。作者對此進行綜述。

角膜新生血管； 血管內(nèi)皮生長因子； 微小RNA； 微小RNA126； 文獻綜述

角膜新生血管可能會導(dǎo)致視力的嚴(yán)重減退，主要與其阻礙光線，導(dǎo)致角膜瘢痕，引起角膜的炎癥反應(yīng)和水腫，進而損害視力有關(guān)。角膜的無血管狀態(tài)是一個積極主動的過程，角膜能夠維持透明性，是由于血管生長因子和抗血管生成長因子的精確平衡。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor VEGF)是最重要的調(diào)控介質(zhì)之一，其上調(diào)可以誘發(fā)血管生成[1]。在一系列的臨床和實驗觀察中，血管生成過程極有可能涉及VEGF信號。一些微小RNA(microRNA，miRNA)通過調(diào)控VEGF等血管新生因子的表達來調(diào)節(jié)角膜新生血管，對其相關(guān)機制的理解將促進抗角膜新生血管方法的改進。作者綜述近年來有關(guān)miRNA及miRNA126(miR126)調(diào)節(jié)角膜新生血管的研究進展。

miRNAs是一系列非編碼RNA，通過抑制翻譯和降解mRNA調(diào)控著基因表達。研究表明，miRNA涉及很多重要的生物過程，包括組織的分化、發(fā)展，一些miRNA被證明是細胞內(nèi)程序的關(guān)鍵調(diào)控者。miR126是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一的內(nèi)皮細胞特異性表達的miRNA，它在血管生成、腫瘤生長和侵襲、血管炎癥過程中發(fā)揮重要作用，被認為是一種多功能miRNA。miRNA與小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)、與piwi蛋白相作用的RNA(piwi-interacting RNA,piRNA)以及短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA,shRNA)都屬于小分子非編碼RNA。miRNA來源于內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄片段[2]，它們具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)。miR126通過調(diào)控細胞增殖、分化、凋亡、應(yīng)激等反應(yīng)在血管內(nèi)皮細胞和血管平滑肌細胞特異性表達，并在血管新生的過程中發(fā)揮了重要作用。作者著重介紹miR126和血管新生關(guān)系的研究現(xiàn)狀。

內(nèi)皮細胞走行于血管結(jié)構(gòu)的內(nèi)表面，并且在血管發(fā)育、功能和疾病方面發(fā)揮著重要作用。在血管形成過程中，內(nèi)皮細胞增值、遷移，形成初級血管網(wǎng)并作為支架來募集平滑肌細胞[3-4]。眾多肽類生長因子通過促進內(nèi)皮細胞的遷移、增值、存活和細胞間相互作用促進血管生成。VEGF和成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)是最強有力的生長因子。它們結(jié)合在細胞表面，激活促分裂素原活化蛋白激酶(MAP激酶)信號途徑，促進血管的新生和成熟。相反，抑制MAP激酶途徑減少了血管生成，并且已經(jīng)被作為抗血管生成治療劑[2]。miRNA是一系列約22個核苷酸組成的非編碼RNA，能夠靶向切割mRNAs或者抑制翻譯，調(diào)控著基因的表達。多于500種miRNA已經(jīng)在人體和其他真核生物中被發(fā)現(xiàn)，其中有三分之一由蛋白質(zhì)基因的內(nèi)含子編碼。miRNAs最初轉(zhuǎn)錄成為前體miRNAs，隨后經(jīng)幾步加工成為一個異源雙鏈。異源雙鏈形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RISC)，它能通過3′非翻譯區(qū)結(jié)合特異性的mRNAs。異源雙鏈中的另外一條，也就是稱為星號鏈的序列隨之降解[5]。它們在活體調(diào)控血管生成，靶向敲除鼠miR126導(dǎo)致了血管的滲漏、出血和胚胎致死。存活下來的突變動物的后代更容易發(fā)生心臟破裂和致命性的血管阻塞后心梗。miR126的促血管生成作用和抑制出芽相關(guān)蛋白(sprouty-related protein 1，Spred-1)的作用一致。Spred-1和磷酸肌醇3激酶調(diào)節(jié)亞基2(phosphoinositol-3 kinase regulatory subunit 2，PIK3R2)負向調(diào)控MAP激酶途徑。當(dāng)miR126缺失時，Spred-1的增加減少了細胞內(nèi)VEGF和FGF的信號，因此miR126是血管生成信號的內(nèi)皮特異性調(diào)控者[6]。

1 miRNA的生物合成和對基因表達的調(diào)節(jié)

特異性非編碼小RNA調(diào)控基因表達的關(guān)鍵步驟是轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)，miRNA靶向生長因子和分化因子的mRNA“復(fù)合物”編碼網(wǎng)絡(luò)，它們是含量相對豐富的一系列基因表達的“微小調(diào)控者”。這些小非編碼RNAs(18～25個核苷酸)通過轉(zhuǎn)錄后抑制翻譯或者降解mRNAs負向調(diào)控基因的表達。它們可能是一些刪除mRNA的開關(guān)，這些mRNA往往不該在一些細胞型中表達或者不該在某一時間表達。MiRNAs也能精細地微調(diào)mRNA的豐富度，并且根據(jù)環(huán)境的變化在生理范圍調(diào)整它們的靶標(biāo)mRNA水平。單獨一個miRNA能夠靶向多種mRNAs，而一種mRNA能被許多miRNA調(diào)控。迄今為止，1 186種鼠miRNA和1 872種人miRNA序列已經(jīng)存儲于miRNA數(shù)據(jù)庫，這一數(shù)據(jù)庫至少包含所有蛋白質(zhì)編碼基因的30%[7]。

自發(fā)現(xiàn)miRNA以來，研究人員將它的生物學(xué)合成徹底地研究?，F(xiàn)已知miRNA和siRNA具有相同的細胞內(nèi)機制[8]。多數(shù)miRNA通過RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄，RNA聚合酶Ⅱ通常負責(zé)蛋白質(zhì)編碼基因的轉(zhuǎn)錄，能夠生產(chǎn)出含有幾千個堿基的前體miRNA(pri-miRNA)。pri-miRNAs具有特征性的環(huán)路(也就是發(fā)夾)結(jié)構(gòu)，并且在環(huán)路內(nèi)或緊挨著環(huán)路內(nèi)包含成熟miRNA的序列，含有核酸內(nèi)切酶的Drosha的微處理器切割pri-miRNA形成短小的pri-miRNA,并且通過轉(zhuǎn)運蛋白5運送到細胞質(zhì)中。到達細胞質(zhì)后，pri-miRNA經(jīng)過最后的步驟邁向成熟。首先是通過另一種內(nèi)切酶(Dicer和轉(zhuǎn)錄反應(yīng)RNA結(jié)合蛋白TRBP)“切割”環(huán)路部分，釋放出一個未解開的miRNA-miRNA雙鏈，含有單鏈成熟的miRNA；后者緊接著傳遞到Argonaute進而功能上成熟，近似于22個核苷酸的miRNA。miRNA的2～8 bp的“種子序列”和5′末端結(jié)合mRNA的R3′UTR序列，當(dāng)配對不精確時抑制翻譯，當(dāng)配對精確時能使mRNA降解[9]。

2 miR126對血管完整性的調(diào)控

miR126是迄今為止唯一發(fā)現(xiàn)的內(nèi)皮特異性表達的miRNA，也是首個在小鼠試驗中敲除的血管miRNA。缺失miR126的鼠和斑馬魚研究顯示出miR126的重要功能，也就是維持血管的完整性以及對血管新生的調(diào)控[10-11]。由于血管完整性的缺失和缺陷血管的形成，靶向敲除小鼠的miR126導(dǎo)致血管的滲漏、出血和部分胚胎的死亡。miR126敲除鼠還顯示出嚴(yán)重的顱血管生成延遲和視網(wǎng)膜發(fā)育的延遲，并且miR126敲除的內(nèi)皮細胞顯示出對血管生長因子反應(yīng)的缺失[12-14]，敲除斑馬魚的miR126導(dǎo)致出血、主動脈和主要血管的的破裂[15]，顯示出miR126基因的保守特性。

3 miRNA對血管新生的調(diào)控

3.1 miR126在 Spred-1、VCAM-1、PIK3R2轉(zhuǎn)錄后起抑制作用

鑒別出miRNA所調(diào)節(jié)的靶向miRNA對研究miRNA的功能起著重要的作用。雖然miRNA靶點預(yù)測軟件已被開發(fā)出很多種，很多的靶點被檢測出，但是在體外實驗研究中發(fā)現(xiàn)有相當(dāng)大一部分靶點為假陽性靶點，所以必須經(jīng)過反復(fù)的實驗驗證才能確認預(yù)測的miRNA結(jié)合位點的真實性。通過對可能的靶標(biāo)miRNA預(yù)測，研究人員將幾個可能的miRNA靶標(biāo)潛在的3′UTR序列克隆并用熒光素酶標(biāo)記，并在海拉細胞中檢測miR126影響熒光素酶的能力，海拉細胞是一種通常不表達miR126的細胞。通過序列的互補發(fā)現(xiàn)了6個潛在的結(jié)合位點以及在內(nèi)皮細胞信號和血管功能中的作用。這些位點包括G蛋白信號3(RGS3)、Spred-1、pik3r2、整合素α-6(ITGA-6)；以及血管細胞黏附因子-1(VCAM-1)。miR126顯著地影響了Spred-1、VCAM-1、pik3r2的3′UTR。在內(nèi)皮細胞中熒光素酶試驗同樣證明了反義序列能夠降低內(nèi)源性miR126水平。在miR126下調(diào)時，熒光素酶標(biāo)記區(qū)包括潛在的Spred-1、VCAM-1和pik3r2的3′UTR表達水平增高[16]。

3.2 miR126通過靶標(biāo)Spred-1和pik3r2調(diào)控VEGF信號

Spred-1和pik3r2各自通過獨立的機制負向調(diào)控生長因子信號[17]。Spred-1通過抑制MAP激酶途徑活性從而抑制生長因子活性[18]，而pik3r2通過負向調(diào)控P13激酶途徑[19]。生長因子激活的MAP和P13激酶途徑能夠通過測量和評估細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)及蛋白激酶B(AKT)的活性來衡量，它們是這兩個信號途徑各自的靶標(biāo)。VEGF引起的磷酸化的ERK和AKT在miR126敲除細胞中衰減，miR126敲除的細胞EGF和bFGF刺激的激活的ERK和AKT也有所減少[20]。

3.3 microRNA信號和血管新新生的關(guān)系

miR126由EGF樣結(jié)構(gòu)物7的內(nèi)含子7編碼。由于miR126通過直接靶向Spred-1和pik3r2從而增強了VEGF信號通路，因此miR126通過靶向血管新生的負向調(diào)節(jié)劑，增強了血管生成信號。miR126在體外影響細胞的遷移和細胞骨架的重建、毛細血管網(wǎng)的穩(wěn)定性，以及細胞的體外存活[21-23]，它也改變了血管的生成和血管完整性。但在內(nèi)皮細胞中Pik3r2抑制PI3K-AKT信號在癌細胞中增強PI3K-AKT信號途徑的原因并不清楚[24]。一系列研究證明，miR126是一種多功能miRNA，不但在血管新生方面有重要作用，也在腫瘤生長、侵襲、炎癥反應(yīng)中有重要作用[25]。

4 miRNA對新生血管性疾病的診斷治療作用

miRNA通過3種可能的方式從細胞分泌：(1) 通過從損傷、炎癥、凋亡或壞死的細胞中被動漏出；(2) 通過外泌體、凋亡小泡和凋亡小體在膜結(jié)合囊泡主動分泌；(3) 通過蛋白質(zhì)-miRNA復(fù)合體主動分泌[26]。進一步了解外泌體miRNA的形成和流通可能不但能幫助判斷緩慢發(fā)展的眼部新生血管疾病的預(yù)后，也能幫助建立活體的miRNA傳遞系統(tǒng)。

治療和調(diào)控血管新生疾病主要依賴藥物治療和外科手術(shù)。然而，這些治療往往伴隨不能預(yù)期的副作用和不可逆的并發(fā)癥。特異性的miRNA靶向血管生成因子的基因也許是一種可行的替代方案?，F(xiàn)在有許多正在進行的臨床試驗致力于治療這類疾病，初步的成果令人鼓舞[11-13]。

MiRNAs也作為一種強有力的疾病分期診斷標(biāo)志物。實際上，miRNAs已經(jīng)在多種體外細胞液比如唾液、血清、血漿、乳液以及尿液中被發(fā)現(xiàn)。這些體外循環(huán)的miRNAs能夠在細胞間傳遞信息并且能判斷細胞的生理狀態(tài)或疾病進展[27-32]。

隨著我們對miRNA的調(diào)控和分子機制的認識，新生血管性疾病包括眼部新生血管性疾病將有可能使用這種辦法治療。病理性新生血管導(dǎo)致各種疾病，比如缺血和癌癥。前面敘述了miRNAs對內(nèi)皮細胞功能特別是血管生成功能的重要作用，特異性的miRNAs能夠在活體調(diào)控血管的完整性和血管生成，為調(diào)控血管生成疾病開辟了新篇章。血管性小RNA治療提供了一種新的辦法，使疾病基因正?；?。通過開/關(guān)單個的靶標(biāo)強有力地抑制毒性或藥物的耐藥性。前體血管性小RNA的類似物或者其拮抗劑可能對病理性新生血管比如腫瘤血管生成和視網(wǎng)膜疾病有效。因為miR126對血管生成性疾病是必須的，miR126類似物可能用于加強缺血后血管生成。許多因素成為血管性小RNA治療的障礙，比如藥物傳遞系統(tǒng)以及對單個miRNA作用的理解不健全等。

5 血管新生原因及過程

血管內(nèi)皮細胞生存環(huán)境中充滿各種血管生成因子和抑制因子，正常情況下它們處于平衡狀態(tài)，這種復(fù)雜而精確的平衡使得眼部的血管處于非增殖狀態(tài)，眼部新生血管性疾病多是因為這種平衡被破壞而導(dǎo)致的。有3種方式能導(dǎo)致血管生成：套迭性微血管生長、出芽生長以及原始干細胞的募集和分化。套迭性微血管生長是由于促進血管生長因子激活后，內(nèi)皮細胞開始向血管腔內(nèi)生長，而同細胞外基質(zhì)柱形成隔膜將血管腔分為兩部分，進而形成兩個血管腔，并在促血管生成因子的作用下形成分支，血管網(wǎng)路不斷擴大。局部釋放血管形成促進因子導(dǎo)致了出芽性血管生成。促血管生長因子激活周圍小靜脈血管的內(nèi)皮細胞，產(chǎn)生纖溶酶原激活劑等酶類，能夠溶解基底膜，于是內(nèi)皮細胞開始向血管形成刺激劑的方向進行增殖和遷移，新生血管芽形成并連接成血管環(huán)；而后不斷募集血管平滑肌細胞和血管周細胞，進而建立新生血管[32]。缺氧誘導(dǎo)產(chǎn)生血管形成促進因子使原始干細胞募集并分化——周圍血循環(huán)中的血管生長因子刺激原始干細胞向缺氧的位置聚集并分化成為活性的血管內(nèi)皮細胞，遷移、增殖形成新生血管。

6 未來方向

角膜新生血管的生成是一個多步驟、多基因協(xié)同完成的復(fù)雜過程。多種基因共同控制血管內(nèi)皮細胞的增生、遷移、分化，所以研究各個基因的調(diào)控機制及各機制之間的關(guān)系變得越來越重要。未來的研究方向?qū)⒅铝τ陉U明血管性小RNA家族成員在活體的應(yīng)用，特別是miRNA靶標(biāo)的確立、miRNAs細胞型的特異性功能以及相關(guān)miRNAs的共同作用；同時，miRNA對不同血管疾病模型的特性作用仍有待研究。這些研究有助于對大量的血管性疾病進行血管性小RNA治療。

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2015-04-28

2015-06-09

國家青年科學(xué)基金資助項目(81201184)

程帥帥(1989-)，男，山東濱州人，在讀碩士研究生。E-mail：victorcs 0211@126.com

張紅 E-mail:Dr.hzhang2007@hotmail.com

程帥帥,張紅.miR126對角膜新生血管的影響[J].東南大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2015，34(5)：828-831．

R77

1671-6264(2015)05-0828-04

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.05.033