劉 楊 綜述，彭道榮 審校

（西京醫(yī)院檢驗科，陜西西安710032）

由乙型肝炎病毒（HBV）感染引起的乙型肝炎（以下簡稱“乙肝”）現(xiàn)已成為潛在威脅人類生命的全球性疾病，據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）2014年6月更新的數(shù)據(jù)顯示，全球已有2.4億人患慢性肝炎傳染病，其中每年就有78 萬人死于由HBV 感染所致的肝衰竭、肝硬化及原發(fā)性肝癌等肝臟疾?。?］。1992年，我國正式將乙肝疫苗納入免疫規(guī)劃管理，有效降低了易感人群的數(shù)量，但由于我國是一個乙肝大國，乙肝病毒攜帶者的基數(shù)過大，防治工作仍然面臨著嚴峻的挑戰(zhàn)。目前，針對HBV感染的實驗室檢測方法多樣，因而選擇高效率、高質量的檢測方法成為乙肝防治工作的重要前提。

乙肝表面抗原（HBsAg）是臨床上應用最多的HBV 感染血清檢測標志物，它是WHO 公認的判斷HBV 感染的關鍵指標［2］。自1972年第一批HBsAg 檢測試劑盒問世至今，HBsAg的實驗室檢測經(jīng)歷了從定性、半定量到高定量的發(fā)展過程，本文就HBsAg的實驗室檢測和研究進展作以下綜述。

1 HBsAg的形成

HBV 屬嗜肝DNA 病毒科，為部分雙鏈環(huán)狀DNA。當HBV 侵入人體后，經(jīng)過黏附、脫殼，HBV－DNA 可從肝細胞漿內進入細胞核，在此進一步發(fā)育完善，使部分雙鏈環(huán)狀DNA形成共價閉合環(huán)狀DNA（cccDNA），并以其為模板轉錄成不同長度的mRNA，mRNA 進一步進行翻譯。HBsAg是HBV 病毒的糖化外膜蛋白，由包膜蛋白基因S編碼，包括大蛋白（LHBs）、中蛋白（MHBs）以及主蛋白（SHBs）三種類型。HBsAg具有抗原多型性，“a”為共同抗原決定簇，亞型決定簇“d”和“y”，“w”和“r”因互相排斥而組合成不同的亞型。乙肝患者血清中出現(xiàn)的HBsAg除了來自具有感染性的成熟的乙肝病毒顆粒外，還來自非感染性的病毒顆粒：球狀及桿狀。雖然非感染顆粒不含DNA，但其分泌量遠大于前者。由于HBsAg不僅可來自cccDNA 的轉錄翻譯，也可來自整合入宿主細胞的HBVDNA，因此它能更好地反映HBV 的轉錄活性和患者的感染狀態(tài)［3－4］。

2 HBsAg的實驗室檢測

HBsAg在人體感染HBV 1周后，大多數(shù)為6周后即可在體內出現(xiàn)［5］。目前，我國針對乙型肝炎開展的實驗室檢查項目繁多，包括蛋白質水平的免疫學檢測和核酸水平的分子生物學檢測。臨床上常用于HBsAg的免疫學檢測方法有膠體金免疫層析法（GICA）、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）、微粒子酶免疫分析法（MEIA）、化學發(fā)光免疫分析法（CLIA）等。

2.1 GICA 免疫層析法是九十年代興起的一種基于免疫膠體金技術的快速診斷技術，GICA 亦稱金標法，是利用膠體金顯色的特點結合免疫層析法，診斷特異性的待測物而發(fā)展起來的［6］。由于該方法簡便快捷，實驗僅需一步即可完成，而被各大小醫(yī)院廣泛應用。但是，由于金標法檢測HBsAg還沒有一個衛(wèi)生行業(yè)標準，臨床上對該方法的評價參差不齊。

目前，大量報道顯示金標法檢測HBsAg特異性高，有一定的檢出率，但該方法檢測的靈敏度低于臨床上常用的其他方法。根據(jù)上海市臨檢中心2009年10月第二次室間評估匯報結果分析，采用金標法檢測HBsAg 的實驗室不合格率非常高，全市6家室間質評未通過的實驗室均是采用了金標法。再進一步對該方法進行性能評估發(fā)現(xiàn)，其檢測靈敏度僅為4IU／mL，而非市面上大多數(shù)試劑說明書中描述的2IU／mL（1IU＝0.5ng）［7］，這與孫宗立等［8］的報道一致。但也有報道顯示該方法檢測靈敏度可達2IU／mL［9］。此外，金標法對灰區(qū)標本的檢測存在較大缺陷，謝云等［10］在其研究中指出，經(jīng)過金標法初篩后的血液樣本，分別用進口、國產兩種HBsAg ELISA 法試劑盒檢測，對在灰區(qū)（S／CO 值大于或等于0.5）且確定為陽性的152份標本，再次用金標法檢測，陽性結果僅為35份，符合率為23%，其檢測結果與兩種ELISA 試劑檢測結果比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

2.2 ELISA ELISA 是在放射免疫分析的基礎上發(fā)展起來的固相酶聯(lián)免疫測定方法，它先通過化學反應將待測物與酶連接，再通過免疫反應使待測物可與固相載體上的相應抗原（抗體）結合，加入底物后，酶與底物產生顏色反應，根據(jù)其顏色深淺來判讀欲測的抗原（抗體）水平。常用于定性或半定量檢測。該方法靈敏度高，特異性強，無放射性污染，檢測成本較低，是目前臨床實驗室檢測HBsAg最常用的方法，但該方法操作繁瑣，耗時長，不確定因素較多，易造成孔間的交叉污染。

ELISA 已是臨床上運用較成熟的檢測方法。我國市面上主要存在進口和國產兩類HBsAg ELISA 法試劑盒，國內試劑盒的檢測品質雖越來越高，但與進口試劑相比仍有差距，而且國產廠家試劑間比較也存在差異［11］。在孫文利等［12］的報道中，將國產與進口的HBsAg ELISA 法試劑盒質量進行比較，國產與進口ELISA 試劑的靈敏度分別為86%和100%，特異度分別為100%和96%，約登指數(shù)分別為0.86和0.96，兩試劑的重復符合率均為100%，試劑的靈敏度以進口試劑盒較好，但特異性比國產試劑差。此外，實際工作中，當HBsAg濃度低或基因變異時，可出現(xiàn)檢測灰區(qū)。據(jù)陳善華等［13］報道，用電化學發(fā)光法和熒光定量PCR 法，對兩種國產HBsAg ELISA試劑盒檢測結果為灰區(qū)組的106 例標本（0.6≤S／CO＜1）及100份陰性組樣本（S／CO＜0.3）進行復檢發(fā)現(xiàn)，灰區(qū)組中電化學發(fā)光法檢測陽性12例，HBV－DNA 檢測陽性16例，與HBsAg陰性組差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），說明ELISA 法檢測HBsAg“灰區(qū)”標本時存在一定數(shù)量的陽性結果，對這類樣本有研究認為應進一步做抗體中和確認試驗以確保檢測結果的準確性和真實性［14］。

2.3 CLIA CLIA 是將化學發(fā)光測定技術與免疫反應相結合的一種分析方法，它既有化學發(fā)光測定技術的高靈敏度，又兼具免疫反應的高特異性，因此臨床上應用廣泛。與上述兩種方法不同的是，由于該方法線性范圍寬，臨床上常用作HBsAg的全定量檢測，為監(jiān)測乙肝患者抗病毒治療療效提供幫助。自1990年，發(fā)現(xiàn)HBsAg“a”表位G145R 突變株以來，各種有臨床意義的“a”表位變異的HBsAg變異株屢見不鮮，這樣使得當前的HBsAg試劑檢測能力下降，對檢測試劑的靈敏度提出了更高要求［15］。目前，CLIA 由于其較高的檢測靈敏度和廣譜性，現(xiàn)已成為國際上主流的HBsAg全定量的檢測方法。它包括兩代試劑：第一代為美國雅培公司的化學發(fā)光微粒子免疫檢測（CMIA）試劑盒，第二代為德國羅氏診斷公司推出的電化學發(fā)光免疫檢測（ECLI）試劑盒。這兩種試劑盒均可溯源至WHO標準品，定量檢測結果以國際單位IU／mL 的形式表示，1IU／mL約等于1～10ng／mL 的HBsAg，兩者之間也有很好相關性［16］。

2.3.1 化學發(fā)光微粒子免疫分析法 ARCHITECT HBsAg是利用CMIA 技術的彈性檢測，通過兩步免疫測定法，定量檢測人血清或血漿中的HBsAg。第一步，將標本和Anti－HBs包被的順磁微粒子合并。標本中存在的HBsAg便結合到Anti－HBs包被的順磁微粒子。洗滌后，在第二步加入吖啶酯標記Anti－HBs的結合物。再次洗滌之后，加入預觸發(fā)液和觸發(fā)液，復合物中的吖啶酯被氧化發(fā)光，發(fā)光強度用相對發(fā)光值（RLU）表示，標本中的HBsAg 含量與光學系統(tǒng)所檢測到的RLU 呈正比。

化學發(fā)光微粒子免疫分析法因其具有很好的特異性、較高的靈敏度和重復性被認為是免疫檢測的金標準［17］。在馬連學等［18］的報道中，CMIA 法所測得的113例陽性標本中，經(jīng)確認試驗陽性數(shù)為103例，確認陽性率91.2%，ELISA 法陽性率為83.2%，兩種方法檢測結果差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。CMIA 法假陽性標本表面抗原定量值在0.05～0.12IU／mL之間，提示對于弱陽性結果需要做確認試驗以保證試驗正確性。李美忠等［19］也就CMIA 法測定HBsAg的臨床應用做了評價，Architect iR2000免疫發(fā)光系統(tǒng)及配套試劑檢測靈敏度可達0.2μg／L，而ELISA 法僅能達到0.5μg／L。重復性試驗HBsAg低值和高值質控品變異系數(shù)（CV）分別為5.22%及5.46%，線性試驗在0～250IU／mL 范圍內結果可靠。ARCHITECT 化學發(fā)光微粒子免疫分析法作為第一代HBsAg化學發(fā)光檢測試劑盒，其原倍的檢測范圍最高為250IU／mL，不能滿足大部分乙肝患者的需求，若進行高值標本的檢測需要進一步手工稀釋，因此大大降低了實驗室檢測效率。

2.3.2 電化學發(fā)光免疫分析法 Roche Elecsys是采用單克隆和多克隆HBs抗體（小鼠和羊）測定HBsAg。兩種生物素化的抗HBsAg單克隆抗與釕復合物標記的一種抗HBsAg單克隆抗體和多克隆抗體混合物與待測抗原反應，形成抗原－抗體復合物，復合物可進一步與加入的鏈霉親和素包被的微粒結合，微粒通過電磁吸附在電極板上，在電壓的作用下，使復合物化學發(fā)光，光學系統(tǒng)檢測的發(fā)光值強度與待測抗原濃度呈正比。

與第一代CLIA 檢測HBsAg試劑盒比較，較多報道都顯示兩者檢測結果的相關性較好［21］，但Roche Elecsys具有更多優(yōu)越性，首先表現(xiàn)在對突變株的檢出率上。俞瑩卿［21］在對第二代化學發(fā)光試劑檢測HBsAg進行多中心評估時，分別用一代、二代化學發(fā)光檢測試劑盒及其他酶聯(lián)免疫試劑盒對13株重組乙肝病毒血清突變株和3株天然變異株進行檢測，結果顯示羅氏ECL試劑的檢出率為98.1%，雅培的CLMI檢出率為87.6%，而科華的ELISA 試劑盒檢出率僅為19.3%，表示羅氏的二代試劑對突變株敏感性優(yōu)于一代的雅培試劑，且兩代化學發(fā)光檢測試劑盒對突變株的檢出能力大大優(yōu)于ELISA 試劑，提高了實驗室的檢出率，降低假陰性樣本。其次，羅氏ECL 試劑檢測線性寬，上機強制400 倍稀釋情況下檢測范圍可達52 000IU／mL，可滿足臨床大部分患者的檢測需求，提高實驗室檢測效率。此外，何宗忠等［22］在電化學發(fā)光測定低濃度HBsAg的研究中報道，與ELISA 相比，兩方法檢測高濃度HBsAg的總符合率高達98.88%，一致性很好，但對低濃度HBsAg樣本的檢測符合率僅72.49%，說明兩種方法對低濃度HBsAg檢測一致性較差，差異有統(tǒng)計學意義（χ2＝7.592，P＝0.008）。

3 小結與展望

當HBV 感染人體后，機體免疫力會不同程度的對病毒做出免疫應答及清除，使得病毒的感染出現(xiàn)不同的結果，如急性乙型肝炎、慢性乙型肝炎、乙肝病毒攜帶者等。HBsAg不僅是判斷HBV 感染的指標，也是臨床上檢測抗病毒治療療效的工具。近些年由于乙肝疫苗及抗病毒藥物的廣泛應用，加速了HBsAg變異株的出現(xiàn)。如研究已證實的G145R、131I、C138Y等表位的突變，可能會導致目前已有的HBsAg試劑檢測能力下降，從而對臨床診斷和血液篩查帶來威脅［23－24］，因此，高靈敏度、高特異度的HBsAg 檢測試劑的應用在臨床上至關重要。實驗室應對各檢測方法的性能進行評估和比對，根據(jù)檢測目的選擇最優(yōu)方法，從而對臨床HBV 感染者的篩查、診斷及治療提供最有效的幫助。

［1］World Health Organization.Hepatitis B［EB／OL］.［2014－12－20］.http：／／www.who.int／mediacentre／factsheets／fs204／en／.

［2］Seeger C，Mason WS.Hepatitis B virus biology［J］.Microbiol Mol Biol Rev，2000，64（1）：51－68.

［3］田曉晨，聞玉梅.剖析乙肝病毒的包膜——乙肝表面抗原的生物學功能及其致病機制［J］.自然雜志，2010，32（6）：314－318.

［4］胡晨波，陸培瑜，陳曉蓉.HBsAg定量在慢性乙型肝炎自然史及干擾素治療中的臨床意義［J］.肝臟，2014，19（1）：74－76.

［5］馬明，劉新鈺，張漢榮，等.YMDD 變異后繼續(xù)使用及停用拉米夫定的臨床轉歸分析［J］.中華傳染病雜志，2005，23（2）：132－134.

［6］Valkirs GE，Barton R.ImmunoConcentration－a new format for solid－phase immunoassays［J］.Clin Chem，1985，31（9）：1427－1431.

［7］朱宇清.乙型肝炎表面抗原膠體金免疫層析法血清快速測定的性能評估［D］.上海：復旦大學，2012.

［8］孫宗立，任利群，谷雷，等.膠體金免疫層析法檢測乙型肝炎病毒表面抗原的應用評估［J］.醫(yī)藥論壇雜志，2007，28（15）：46－47.

［9］周迎春，陳輝，關平，等.3種方法測定低濃度乙型肝炎病毒表面抗原效果評價［J］.檢驗醫(yī)學與臨床，2007，4（11）：1070－1071.

［10］謝云，馮惟萍，李國英，等.膠體金法、ELISA 法檢測HBsAg在獻血者初篩中的作用［J］.甘肅醫(yī)藥，2014，33（2）：103－104.

［11］賈志遠.ELISA 檢測試劑的評價方法［D］.北京：中國協(xié)和醫(yī)科大學，2007.

［12］孫文利，張獻清，穆士杰，等.國產與進口HBsAg ELISA 試劑盒的質量比較［J］.中國生物制品學雜志，2006，19（1）：71－72.

［13］陳善華，朱麗莉，李浩，等.ELISA 方法檢測HBsAg設置灰區(qū)的必要性探討［J］.中國輸血雜志，2013，26（10）：1013－1014.

［14］王強，李文郎，黃國清，等.確認試驗在乙肝表面抗原弱陽性樣本判定中的應用［J］.國際檢驗醫(yī)學雜志，2013，34（5）：619－620.

［15］肖勤，林金明.化學發(fā)光免疫分析新進展［J］.分析試驗室，2011，30（1）：111－122.

［16］Wursthorn K，Jaroszewicz J，Zacher BJ，et al.Correlation between the Elecsys HBsAg II assay and the Architect assay for the quantification of hepatitis B surface antigen（HBsAg）in the serum［J］.J Clin Virol，2011，50（4）：292－296.

［17］劉冀瓏，喬惠理，鄧澤沛.化學發(fā)光免疫技術［J］.化學通報，2000（7）：49－53.

［18］馬連學，李艷菊，魏巍.化學發(fā)光微粒免疫法和酶聯(lián)免疫吸附法檢測乙肝表面抗原的結果對比分析［J］.中國實用醫(yī)藥，2014，3（9）：89－90.

［19］李美忠，姜慶波.化學發(fā)光微粒子免疫法測定乙型肝炎表面抗原的臨床應用評價［J］.實用醫(yī)技雜志，2010，17（4）：343－344.

［20］Sonneveld MJ，Rijckborst V，Boucher CA，et al.A comparison of two assays for quantification of Hepatitis B surface Antigen in patients with chronic hepatitis B［J］.J Clin Virol，2011，51（3）：175－178.

［21］俞瑩卿.第二代化學發(fā)光試劑檢測乙肝表面抗原的多中心評估［D］.上海：復旦大學，2011.

［22］何宗忠，裘宇容，魏東，等.電化學發(fā)光測定低濃度乙肝病毒表面抗原的臨床意義［J］.中國實驗診斷學，2013，17（11）：2056－2058.

［23］Hsu HY，Chang MH，Ni YH，et al.Survey of hepatitis B surface variant infection in children 15years after a nationwide vaccination programme in Taiwan［J］.Gut，2004，53（10）：1499－1503.

［24］Hollinger FB.Hepatitis B virus genetic diversity and its impact on diagnostic assays［J］.J Viral Hepat，2007，14（Suppl 1）：11－15.