龍 琴綜述，劉靳波審校

（瀘州醫(yī)學(xué)院，四川瀘州 646000）

·綜 述

細(xì)菌分子生物學(xué)分型技術(shù)研究進(jìn)展＊

龍 琴綜述，劉靳波△審校

（瀘州醫(yī)學(xué)院，四川瀘州 646000）

病原菌； 分子分型； 應(yīng)用

細(xì)菌分型主要用于研究各菌株之間的克隆關(guān)系、確定感染源和感染途徑、防止和控制病原菌的流行、預(yù)防交叉感染、明確致病力強(qiáng)的菌株和制定有效的控制措施等［1］。傳統(tǒng)的細(xì)菌分型方法依賴于細(xì)菌表型特征鑒定，如生化反應(yīng)、血清學(xué)特點(diǎn)等，存在分辨率低、重復(fù)性差、操作繁瑣、耗時(shí)費(fèi)力等局限性［2］。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，基因分型技術(shù)已廣泛應(yīng)用于病原菌流行病學(xué)研究、醫(yī)院感染控制、公共衛(wèi)生防治等領(lǐng)域，采用的技術(shù)較多，包括質(zhì)粒指紋圖譜分析、脈沖場(chǎng)凝膠電泳技術(shù)、限制性內(nèi)切酶技術(shù)等。選擇合適的分型方法十分重要。本文就近年來(lái)常用的分子生物學(xué)分型方法的原理、優(yōu)勢(shì)、局限性、應(yīng)用及研究進(jìn)展等綜述如下。

1 質(zhì)粒指紋圖譜分析

質(zhì)粒指紋圖譜分析根據(jù)質(zhì)粒DNA電泳條帶所構(gòu)成的特征性圖譜對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分型，包括質(zhì)粒圖譜分析和質(zhì)粒限制性內(nèi)切酶圖譜分析，主要應(yīng)用于細(xì)菌耐藥基因流行傳播的分析，常用于葡萄球菌屬和腸桿菌屬細(xì)菌［3］。Shahkarami等［4］對(duì)106株金黃色葡萄球菌進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)75株攜帶不同數(shù)量的質(zhì)粒，且與耐藥表型無(wú)關(guān)。該方法優(yōu)點(diǎn)是操作相對(duì)簡(jiǎn)單、耗時(shí)少、費(fèi)用低，缺點(diǎn)在于質(zhì)粒在某些因素作用下不穩(wěn)定，可導(dǎo)致自發(fā)丟失、獲得及轉(zhuǎn)移［5］；其次，質(zhì)粒圖譜分析不能區(qū)分不含質(zhì)粒的細(xì)菌，而質(zhì)粒指紋圖譜區(qū)分細(xì)菌流行株和非流行株的能力有限。

2 限制酶消化技術(shù)

脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE）和限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（PFLP）均利用不同的限制酶切割染色體DNA，產(chǎn)生不同長(zhǎng)度的酶切片段，通過(guò)電泳和Southern雜交技術(shù)將病原菌分型。現(xiàn)以PFGE為例進(jìn)行簡(jiǎn)要介紹。

自1984年Schwartz等［6］首次采用PFGE技術(shù)成功分離釀酒酵母染色體DNA以來(lái)，PFGE以其重復(fù)性好、分辨力強(qiáng)而被認(rèn)為是細(xì)菌分子分型的“金標(biāo)準(zhǔn)”。其基本原理是通過(guò)電場(chǎng)的不斷改變，使包埋在凝膠中的DNA分子的泳動(dòng)方向發(fā)生改變，小分子DNA比大分子DNA泳動(dòng)快，呈現(xiàn)特異的電泳圖譜，DNA條帶的密集度一定程度上反映了細(xì)菌基因組DNA濃度及DNA分子的大小，最終達(dá)到分型的目的。目前，PFGE已成功應(yīng)用于多種病原菌的流行病學(xué)研究。有研究對(duì)30株腸球菌進(jìn)行分析，結(jié)果顯示PFGE在分辨能力及重復(fù)性方面優(yōu)于其他分型方法［7］。然而，該方法耗時(shí)長(zhǎng)、操作復(fù)雜，且電泳圖譜分析易受操作人員技術(shù)水平的影響，給不同實(shí)驗(yàn)室間的比較帶來(lái)一定困難［8］。其次，PFGE分析費(fèi)用高，所需設(shè)備價(jià)格昂貴，難以推廣。再者，PFGE檢測(cè)結(jié)果顯示的是病原菌電泳條帶，而不是其DNA序列，在分析結(jié)果時(shí)必須根據(jù)其他流行病學(xué)資料或其他分子分型資料等進(jìn)行合理的解釋［9－10］。此外，Davis等［9］研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)大小相似的片段分辨力不高。另有研究發(fā)現(xiàn)PFGE不適宜用來(lái)分析有廣泛基因重組現(xiàn)象的細(xì)菌［11］。

3 基于聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）的分型技術(shù)

PCR是一種廣泛應(yīng)用的DNA體外擴(kuò)增合成技術(shù)。在PCR基礎(chǔ)之上已衍生出多種用于細(xì)菌基因分型方法。

3.1 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析技術(shù)（AFLP） AFLP最早應(yīng)用于植物學(xué)方面的研究，現(xiàn)已普遍應(yīng)用于細(xì)菌分型領(lǐng)域［12］。該方法的基本原理是:基因組DNA用可產(chǎn)生粘性末端的限制性內(nèi)切酶消化，產(chǎn)生大小不同的酶切片段，再與具有共同粘性末端的寡核苷酸雙鏈接頭連接成DNA模板，用與接頭互補(bǔ)的帶有選擇性堿基的核苷酸序列為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再將擴(kuò)增的酶切片段進(jìn)行電泳，產(chǎn)生擴(kuò)增片段長(zhǎng)度不同的多態(tài)性帶型，通過(guò)帶型的差異對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分型和鑒定［13］。該方法具有多態(tài)性豐富，不需要知道被測(cè)細(xì)菌的全基因組序列，不受環(huán)境影響，無(wú)復(fù)等位效應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)。有研究利用3種方法對(duì)110株腸炎沙門菌進(jìn)行分子分型，認(rèn)為AFLP與PFGE分型能力相當(dāng)，且更適于沙門菌地區(qū)性疫情調(diào)查［14］。Donnarumma等［15］研究表明，AFLP對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌鑒定和分型的重復(fù)性高于90%。此外，AFLP是針對(duì)細(xì)菌全基因組的限制性酶切，在調(diào)查細(xì)菌流行病學(xué)和監(jiān)控醫(yī)院感染情況方面更權(quán)威［16］。有研究利用AFLP對(duì)1961～1993年的45株霍亂弧菌進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)不同時(shí)期霍亂弧菌的流行病學(xué)特征及1991年非洲東南部和西部地區(qū)的流行疫源明顯不同［17］。但是AFLP已申請(qǐng)專利，試劑盒價(jià)格昂貴；同時(shí)，該方法所用引物取決于接頭，對(duì)接頭技術(shù)要求較高且操作繁瑣。

3.2 隨機(jī)引物擴(kuò)增DNA多態(tài)性分析（RAPD） RAPD基于較短的隨機(jī)序列引物（通常為10 bp），在低退火溫度下與染色體DNA序列有較好的親和力，通過(guò)擴(kuò)增未知序列染色體DNA和比較擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性，在克隆水平上比較DNA的差異，從而對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分型鑒定。Trancassini等［18］用該方法將分離自囊性纖維化患者的57株木糖氧化無(wú)色桿菌分為2型。Sachse等［19］研究表明RAPD可作為肺炎克雷伯菌快速分型篩選方法。該技術(shù)無(wú)需預(yù)知待檢細(xì)菌的基因組核苷酸序列，經(jīng)濟(jì)且簡(jiǎn)便易行，對(duì)樣品DNA的質(zhì)量要求不高，但是檢測(cè)重復(fù)性易受退火溫度、循環(huán)次數(shù)等因素的影響。

3.3 重復(fù)序列PCR（rep－PCR） rep－PCR是通過(guò)擴(kuò)增細(xì)菌基因組中廣泛分布的短重復(fù)序列，即基因外重復(fù)回文序列（REP），獲得菌株特異性圖譜［20］。Percin等［21］應(yīng)用該方法將多粘菌素耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌分為3個(gè)不同的克隆型，發(fā)現(xiàn)多粘菌素與萬(wàn)古霉素在體外存在協(xié)同作用。Gulbudak等［22］將rep－PCR成功應(yīng)用于院內(nèi)鮑曼不動(dòng)桿菌流行病學(xué)研究。另有研究研究表明與其他PCR技術(shù)相比，rep－PCR具有耗時(shí)短，所需DNA量小等優(yōu)點(diǎn)［23］。法國(guó)生物梅里埃公司近年來(lái)開發(fā)的DiversiLab系統(tǒng)亦基于rep－PCR原理。該系統(tǒng)可在4 h之內(nèi)完成樣品同源性自動(dòng)化分析，還可以得到樹狀圖、凝膠圖像、矩陣圖等報(bào)告，具有高效、快速、易操作等特點(diǎn)［24］。但是，rep－PCR的分辨力取決于待檢菌株中存在的重復(fù)序列數(shù)目，且試劑、反應(yīng)條件及凝膠電泳條件都可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果［25］。

4 DNA測(cè)序技術(shù)

隨著DNA測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，細(xì)菌分子分型技術(shù)日益趨向于基于細(xì)菌DNA序列本身的差異。以下介紹2種發(fā)展較快的DNA測(cè)序技術(shù)。

4.1 多位點(diǎn)序列分型（MLST） MLST是由Maiden等研究設(shè)計(jì)，最初用于研究自然變異的腦膜炎奈瑟球菌［26］。該方法通過(guò)PCR擴(kuò)增多個(gè)管家基因內(nèi)部片段并進(jìn)行序列分析，不同的細(xì)菌對(duì)應(yīng)不同的序列型（ST），通過(guò)比較ST而對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分型。該技術(shù)可通過(guò)網(wǎng)絡(luò)實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室間數(shù)據(jù)共享及比較，具有簡(jiǎn)便快捷、實(shí)驗(yàn)室間可比性強(qiáng)、可直接對(duì)臨床標(biāo)本進(jìn)行分析等優(yōu)點(diǎn)［27］。Mezzatesta等［28］研究發(fā)現(xiàn)，PFGE和MLST對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌分型具有同樣的分辨力和可重復(fù)性。Simmonds等［29］將該方法成功應(yīng)用于社區(qū)百日咳桿菌分型。其缺點(diǎn)在于管家基因的變異決定了分辨力，且不適用于同血清型菌株間的比較。此外，該方法依賴基因測(cè)序，成本較高，影響其推廣普及。

4.2 高通量測(cè)序技術(shù) 高通量測(cè)序技術(shù)又稱“下一代”測(cè)序技術(shù)或深度測(cè)序，能同時(shí)對(duì)幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條DNA分子進(jìn)行序列測(cè)定［30］。該技術(shù)具有檢測(cè)速度快，覆蓋度廣及產(chǎn)出巨大等特點(diǎn)［31］。Snyder等［32］的研究表明，該技術(shù)對(duì)醫(yī)院感染暴發(fā)流行的分析優(yōu)勢(shì)較大。但其局限性也不容忽視。首先，雖然測(cè)序速度較高，但錯(cuò)誤率也相應(yīng)較高［33］，對(duì)獲得的大量數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析也難題之一。此外，該技術(shù)不適合小規(guī)模測(cè)序，且測(cè)序儀價(jià)格昂貴。

5 結(jié) 語(yǔ)

綜上所述，不同的分型方法各有優(yōu)劣。選擇何種分型方法，不僅取決于方法的分辨能力、重復(fù)性、經(jīng)濟(jì)及勞動(dòng)成本，還取決于實(shí)驗(yàn)室資源及實(shí)驗(yàn)者本身的操作技能和知識(shí)水平。

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10.3969/j.issn.1673－4130.2015.10.046

A

1673－4130（2015）10－1423－03

2015－01－02）

四川省瀘州市科技局科研項(xiàng)目（2013CDLZ－S15）。 作者簡(jiǎn)介:龍琴，女，主管檢驗(yàn)師，主要從事臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)研究?！?/p>

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