張宏萍，周 敏，陸仁飛，李雪梅

（1.南通市疾病預(yù)防控制中心，江蘇南通 226001；2.江蘇省南通市第三人民醫(yī)院，江蘇南通 226001）

南通地區(qū)2014年腸道病毒71型的分子流行病學(xué)研究＊

張宏萍1，周 敏1，陸仁飛2，李雪梅2

（1.南通市疾病預(yù)防控制中心，江蘇南通 226001；2.江蘇省南通市第三人民醫(yī)院，江蘇南通 226001）

目的分析2014年江蘇南通地區(qū)腸道病毒71型（EV71）的分子流行病學(xué)特征。方法采集52例手足口病患兒咽拭子標(biāo)本，提取病毒核酸，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT－PCR）擴(kuò)增病毒的VP1序列。獲得的序列與來(lái)自其他地區(qū)的序列進(jìn)行比對(duì)分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果52份臨床標(biāo)本中分離到12株EV71 VP1序列，12株VP1序列的核苷酸、氨基酸同源性為93.4%～99.1%，進(jìn)化樹分析顯示12株VP1序列全部屬于C4基因型的C4a亞型。結(jié)論2014年南通地區(qū)分離的EV71流行病毒株與近年來(lái)中國(guó)其他地區(qū)的流行株有相同的起源，均屬于EV71 C4基因的C4a亞型。

腸道病毒71型； 基因特征； 分子流行病學(xué)

腸道病毒71型（EV71）屬于小RNA病毒科，腸道病毒屬，其核酸為單股正鏈RNA，是引起嬰幼兒手足口病的主要病原體，還能引起無(wú)菌性腸膜炎，腦干腦炎和骨髓灰質(zhì)炎樣的麻痹與多種神經(jīng)系統(tǒng)的疾?。?］。1969年，美國(guó)加州首次報(bào)道了EV71引起的病例［2］，此后，全球各地均有流行。我國(guó)各地區(qū)對(duì)EV71流行爆發(fā)均有報(bào)道［3－5］，本研究對(duì)2014年江蘇南通地區(qū)手足口病分離的EV71 VP1區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序，旨在了解本地區(qū)近段時(shí)間EV71的流行趨勢(shì)及分子流行病學(xué)特征。

1 材料與方法

1.1 材料 標(biāo)本來(lái)源于2014年南通地區(qū)各醫(yī)院手足口病住院患兒，采集患兒咽拭子標(biāo)本于病毒儲(chǔ)存液中，－80℃保存。1.2 引物設(shè)計(jì) GenBank中下載EV71的基因序列，經(jīng)比對(duì)選取保守序列，設(shè)計(jì)合成EV71 VP1區(qū)的巢式引物:引物F1 5′－CCC AAT ACA GCC TAT AAA－3′，R1 5′－CGA GGC TGT CTT CCC A－3′，擴(kuò)增片段1 100 bp；內(nèi)引物F2 5′－ACT AGC GGC AGC CCA－3′，R2 5′－CCA CTC TAA AGT TGC CCA C－3′，擴(kuò)增片段1 022 bp。引物由上海捷瑞生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 病毒核酸提取 采用北京鑫諾美迪基因檢測(cè)技術(shù)有限公司的病毒DNA/RNA提取試劑盒（磁珠吸附法），提取方法嚴(yán)格按照說(shuō)明書。

1.4 EV71實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT－PCR）鑒定 使用EV71、柯薩奇病毒A組16型（Cox A16）及通用型腸道病毒核酸檢測(cè)試劑盒（默樂(lè)生物）鑒定標(biāo)本的病毒RNA類型。嚴(yán)格按照說(shuō)明書操作，RT－PCR陽(yáng)性標(biāo)本即可確診為EV71感染標(biāo)本。

1.5 EV71 VP1基因的擴(kuò)增 將EV71陽(yáng)性標(biāo)本提取的RNA作為模板，采用one step RT－PCR kit（大連Takara公司）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)。在RT－PCR反應(yīng)體系中加入外引物F1 和R1，取標(biāo)本RNA 4μL，反應(yīng)總體系20μL，反應(yīng)條件:50℃30 min，95℃30 s，50℃30 s，72℃1.5 min，35個(gè)循環(huán)，72℃10 min。第2輪擴(kuò)增:取第1步RT－PCR產(chǎn)物1μL為模板，進(jìn)行第2輪擴(kuò)增。第2輪PCR反應(yīng)中加內(nèi)側(cè)引物F2、R2，反應(yīng)總體系50μL，反應(yīng)條件:95℃2 min，95℃30 s，55℃30 s，72 ℃70 s，30個(gè)循環(huán)，72℃10 min。PCR產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察是否擴(kuò)增到約1.0×103的產(chǎn)物，陽(yáng)性結(jié)果送上海邁浦生物科技有限公司測(cè)序。

1.6 DNA序列分析 獲得的VP1序列，使用MEGA 5.0軟件中提供的Muscle項(xiàng)進(jìn)行比對(duì)，并人工對(duì)序列進(jìn)行校正。使用MEGA V5.0軟件，對(duì)本研究中獲得的序列與國(guó)內(nèi)外EV71代表病毒株進(jìn)行進(jìn)化分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié) 果

2.1 EV71 VP1片段擴(kuò)增結(jié)果 對(duì)12例熒光定量PCR檢測(cè)EV71核酸陽(yáng)性的標(biāo)本進(jìn)行VP1片段擴(kuò)增。電泳檢測(cè)顯示，各陽(yáng)性標(biāo)本均能在1.0×103位置出現(xiàn)明顯目的條帶。將測(cè)序獲得的各標(biāo)本EV71 VP1序列，分別命名為Nantong01_2014，Nantong02_2014…..Nantong12_2014。

2.2 EV71 VP1基因核苷酸、氨基酸序列同源性分析 本實(shí)驗(yàn)共分離到12株南通地區(qū)2014年流行的EV71，根據(jù)測(cè)序的全部12條EV71 VP1基因序列，進(jìn)行同源性比對(duì)。12條序列間具有較高的同源性（93.4%～99.1%）。同源性比對(duì)結(jié)果見(jiàn)圖2（見(jiàn)《國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》網(wǎng)站論文附件）。

2.3 EV71 VP1基因系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建和分析 為了探尋2014年南通市12株EV71病毒株的傳播來(lái)源，Cox A16原型株G－10作為外群序列，搜集中國(guó)其他城市分離的EV71病毒序列和國(guó)外流行的病毒株序列，使用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。根據(jù)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，中國(guó)所有的EV71病毒序列聚集在一起，位于C4亞型參考序列的內(nèi)側(cè)，與國(guó)外流行的其他亞型病毒序列有較遠(yuǎn)的進(jìn)化距離。南通地區(qū)2014年分離的12 株EV71和中國(guó)其他大部分城市分離的EV71序列有更近的進(jìn)化距離，并組成EV71的C4a進(jìn)化簇，而來(lái)自上海2000年分離的3株病毒株則單獨(dú)聚在一起，組成了EV71的C4b進(jìn)化簇。在C4a進(jìn)化簇中，來(lái)自南通2014年采集的12條EV71序列，根據(jù)核酸的進(jìn)化距離，主要形成5個(gè)不同的進(jìn)化分支或進(jìn)化簇，與全國(guó)其他地區(qū)的病毒序列有很近的親緣關(guān)系，顯示南通市流行的EV71是來(lái)源于中國(guó)本地主要流行的病毒株。根據(jù)現(xiàn)有的序列進(jìn)一步分析顯示，12條南通地區(qū)的EV71序列均位于主要由江蘇省病毒株組成的進(jìn)化簇內(nèi)。其中，8條流行于南通地區(qū)的EV71序列與鎮(zhèn)江2010年流行的病毒序列聚集在一起或位于鎮(zhèn)江序列的進(jìn)化簇內(nèi)，表明這些病毒株由鎮(zhèn)江地區(qū)傳入南通地區(qū)。剩余的4條南通EV71序列單獨(dú)聚在一起，但均位于主要由江蘇省序列組成的進(jìn)化簇內(nèi)。綜上所述，南通地區(qū)2014年流行的EV71病毒株序列與江蘇本省流行的EV71病毒株有更近的親緣關(guān)系，表明南通地區(qū)2014年流行的病毒株為江蘇省本省流行的病毒株。另外，南通地區(qū)2009年流行的EV71病毒序列同樣與江蘇省內(nèi)其他城市的病毒序列聚集在一起，表明南通地區(qū)多次流行的EV71病毒株，均來(lái)自江蘇省內(nèi)南通地區(qū)2014年12株EV71病毒株與其他地區(qū)病毒株的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系見(jiàn)圖3（見(jiàn)《國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》網(wǎng)站論文附件）。

3 討 論

手足口病是指手足口腔等部位出現(xiàn)紅色斑丘疹，伴有或不伴有發(fā)熱的一種急性傳染病，可由多種腸道病毒感染引起，如EV71、Cox A、B型或埃可病毒等其他腸道病毒。EV71感染是引起手足口病的主要病原體，且可引起嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，主要的發(fā)病人群集中在1～4歲年齡組［6－7］。VP1蛋白是EV71病毒主要的病毒抗原決定簇，是腸道病毒血清型分型的主要依據(jù)。根據(jù)VP1基因序列的差異，全球的EV71病毒株被劃分為A、B和C三個(gè)基因型。除A基因型僅含有EV71原型株外，B、C基因型又可進(jìn)一步劃分為含有一定數(shù)量的亞型［8－10］。

根據(jù)已分離的EV71病毒株分析顯示，C4亞型為中國(guó)各地區(qū)最主要流行的病毒株［11］。C4亞型的序列又主要形成兩個(gè)進(jìn)化分支，C4a和C4b。其中，C4b病毒株僅在少數(shù)地區(qū)的早期階段流行，如于上海2000年分離的病毒株［12］。來(lái)自近年來(lái)中國(guó)各地區(qū)流行的病毒株序列組成了C4a分支，這是當(dāng)前中國(guó)最主要流行的病毒株。在C4a分子內(nèi)，不同地區(qū)和不同時(shí)間分離的序列有很近的遺傳關(guān)系，表明它們來(lái)自共同的祖先。為了解EV71的亞型分布，本研究收集了2014年南通地區(qū)各醫(yī)院的手足口病患兒標(biāo)本，成功獲取到12份EV71標(biāo)本的VP1基因序列。根據(jù)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，南通地區(qū)2014年分離的病毒株均屬于C4a病毒株，表明當(dāng)前南通地區(qū)流行的EV71病毒株為相同的亞型病毒株。

2008年安徽省阜陽(yáng)市暴發(fā)較大規(guī)模的手足口病流行，隨后山東、江蘇、北京、上海等全國(guó)各地均出現(xiàn)了手足口病疫情。分子流行病學(xué)的分析顯示，來(lái)自江蘇的EV71病毒株與同時(shí)期安徽阜陽(yáng)流行的病毒株聚集在C4a分支，其遺傳距離較小。因此，流行在江蘇相鄰省市（如上海，山東）的EV71病毒應(yīng)該均由阜陽(yáng)傳入。在本研究中，數(shù)據(jù)庫(kù)中南通地區(qū)2009年的EV71病毒序列也被用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，以便鑒定南通地區(qū)EV71病毒的序列差異。然而分析顯示，無(wú)論是2009年分離的病毒序列還是2014年分離的病毒序列，它們相互間的遺傳距離均較近，均屬于C4a，顯示南通地區(qū)流行單一的EV71亞型病毒株。同時(shí)，其他地區(qū)EV71序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，南通地區(qū)不同時(shí)期分離的病毒株均流行于江蘇省內(nèi)其他城市，如鎮(zhèn)江，南通等的病毒序列聚集在一起，表明南通地區(qū)EV71的病毒株主要受流行于江蘇省內(nèi)的病毒株影響。然而，由于樣本數(shù)量的限制，因此本研究的分析結(jié)果尚不能完全代表南通地區(qū)EV71的實(shí)際流行情況。更多樣本的分析將有助于進(jìn)一步了解南通地區(qū)EV71的實(shí)際流行情況。

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Enterovirus 71 molecular epidemiology research in Nantong，2014＊

Zhang Hongping1，Zhou Min1，Lu Renfei2，Li Xuemei2
（1.Nantong Center for Disease Control and Prevention，Nantong，Jiangsu 226001，China；2.Third People′s Hospital of Nantong in Jiangsu Province，Nantong，Jiangsu 226001，China）

ObjectiveTo analyze enterovirus 71（EV71）molecular epidemiology characteristics in Nantong region of Jiangsu，2014.MethodsThe pharyngeal swab samples were selected from 52 children with hand，foot and mouth disease.After extracting the virus nucleic acid，the EV71 VP1 gene of the virus were amplified by RT－PCR amplification.The phylogenetic tree was constructed between isolated and EV71 reference strains from other parts of the country.Results12 strains EV71 VP1 gene were isolated from 52 cases of clinical specimens.The nucleotide and amino acid homology of 12 strains EV71 VP1 gene was 93.4%－99.1%，the phylogenetic tree analysis showed that 12 strains of VP1 gene all belong to C4 genotype C4a subgenotypes.ConclusionThe isolated strains in Nantong in 2014 are all the EV71 C4a subgenotypes of C4 genotype，the same with the most of isolates in recent years.

Enterovirus 71； genetic traits； molecular epidemiology

10.3969/j.issn.1673－4130.2015.10.014

A

1673－4130（2015）10－1354－03

2015－01－02）

南通市科技局資助項(xiàng)目（HS2013028）。 作者簡(jiǎn)介:張宏萍，女，主管檢驗(yàn)師，主要從事微生物學(xué)檢驗(yàn)研究。