沈麗燕，申衛(wèi)紅，朱 嵐

（南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院生殖與遺傳中心，江蘇蘇州 215001）

肺結(jié)核患者NO和FOXP3表達(dá)水平變化及意義

沈麗燕，申衛(wèi)紅，朱 嵐

（南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院生殖與遺傳中心，江蘇蘇州 215001）

目的探討肺結(jié)核患者一氧化氮（NO）和叉頭蛋白3（FOXP3）表達(dá)水平的變化及臨床意義。方法選擇肺結(jié)核患者與健康者各40例，采用Griess比色法檢測血清NO水平，采用流式細(xì)胞儀檢測外周血CD4＋CD25＋T淋巴細(xì)胞百分比；采用實時定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測FOXP3 mRNA水平。結(jié)果肺結(jié)核患者血清NO濃度為（15.71±1.26）μmol/L，高于健康者的（5.45± 0.98）μmol/L（P＜0.05）；肺結(jié)核患者外周血CD4＋CD25＋T淋巴細(xì)胞約占CD4＋T淋巴細(xì)胞的（4.57±0.85）%，高于健康者的（1.83±0.49）%（P＜0.05）；肺結(jié)核患者外周血CD4＋CD25＋T淋巴細(xì)胞高表達(dá)FOXP3。結(jié)論肺結(jié)核患者NO、FOXP3表達(dá)水平均升高，在肺結(jié)核免疫調(diào)節(jié)機制中起著重要作用；動態(tài)監(jiān)測二者表達(dá)水平的變化有利于肺結(jié)核患者的診治。

一氧化氮； 叉頭蛋白3； 肺結(jié)核

肺結(jié)核是由結(jié)核分枝桿菌引發(fā)的肺部感染性疾病，與T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)密切相關(guān)，其中調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞（Treg）在其中占重要作用［1］。Treg是一類具有免疫抑制功能的T淋巴細(xì)胞，在維持機體免疫自穩(wěn)、調(diào)控免疫應(yīng)答方面起重要作用，特征性表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子叉頭蛋白3（FOXP3）［2－3］。一氧化氮（NO）由具有多種生物學(xué)活性，由NO合成酶（NOS）催化合成。NOS可分為基礎(chǔ)型（c NOS）及誘導(dǎo)型（iNOS）。研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌感染巨噬細(xì)胞后，能誘導(dǎo)NO的產(chǎn)生，從而發(fā)揮炎癥介質(zhì)和細(xì)胞毒作用，殺傷結(jié)核分枝桿菌［4－5］。為了解NO和FOXP3在肺結(jié)核發(fā)病機制中的作用，本研究檢測了肺結(jié)核患者NO、FOXP3水平，探討二者與肺結(jié)核免疫功能紊亂的關(guān)系，以期為肺結(jié)核的免疫治療提供新的方向。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2012年6月至2013年3月在無錫市第三人民醫(yī)院呼吸科住院治療的結(jié)核病患者40例（實驗組），診斷標(biāo)準(zhǔn)符合《肺結(jié)核診斷和治療指南》［6］；男26例、女14例，年齡20～75歲，平均（40.5±11.2）歲。與研究組性別、年齡相匹配的體檢健康者40例納入對照組。所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 NO檢測 采集受試者晨起空腹靜脈血4 m L，3 000 r/min離心10 min，分離血清標(biāo)本，采用上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司Griess比色法NO檢測試劑盒檢測血清NO水平。

1.2.2 CD4＋CD25＋T淋巴細(xì)胞亞群檢測 采集受試者枸櫞酸鈉抗凝靜脈血2 mL，取全血標(biāo)本100μL，加入PE標(biāo)記的CD4抗體、FITC標(biāo)記的CD25抗體（美國BD公司）各10μL，室溫避光孵育30 min；加入紅細(xì)胞裂解液（美國BD公司），振蕩混勻；離心后棄上清液，磷酸鹽緩沖液洗滌后混勻，采用FACS Calibur流式細(xì)胞儀（美國BD公司）計數(shù)細(xì)胞，以Cellquest軟件分析數(shù)據(jù)，計算CD4＋CD25＋T淋巴細(xì)胞百分比。

1.2.3 FOXP3 m RNA表達(dá)的檢測 按照實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT－PCR）試劑盒（德國QIAGEN公司）說明書的要求，提取全血RNA，采用RT－PCR檢測FOXP3 mRNA水平，以磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）作為內(nèi)參基因。FOXP3擴增上游引物:5′－GAA CGC CAT CCG CCA CAA CCT GA－3′，下游引物:5′－CCC TGC CCC CAC CAC CTC TGC－3′。聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）循環(huán)條件:95℃5 min，94℃30 s、69℃30 s、72℃1 min循環(huán)30次。反應(yīng)結(jié)束后設(shè)定最佳閾值，根據(jù)儀器給出的標(biāo)準(zhǔn)曲線和斜率，計算FOXP3相對表達(dá)指數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS18.0軟件進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 NO濃度檢測 實驗組、對照組血清NO濃度分別為（15.71±1.26）、（5.45±0.98）μmol/L，實驗組血清NO濃度高于對照組（P＜0.05）。

2.2 CD4＋CD25＋T淋巴細(xì)胞亞群檢測 實驗組、對照組外周血CD4＋CD25＋T淋巴細(xì)胞在CD4＋T淋巴細(xì)胞中所占比例分別為（4.57±0.85）%、（1.83±0.49）%，實驗組高于對照組（P＜0.05）。

2.3 FOXP3 mRNA表達(dá)水平檢測 實驗組、對照組FOXP3 m RNA相對表達(dá)指數(shù)分別為4.42±0.31、2.08±0.26，實驗組FOXP3 mRNA表達(dá)水平高于對照組（P＜0.05）。

3 討 論

肺結(jié)核是較為常見的一類傳染病，T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)和遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)對結(jié)核病發(fā)病、演變及轉(zhuǎn)歸產(chǎn)生決定性影響。近年來，調(diào)控免疫反應(yīng)的CD4＋CD25＋Treg細(xì)胞成為免疫抑制治療的研究焦點。Treg特征性表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子FOXP3，后者對CD4＋CD25＋Treg細(xì)胞發(fā)育及功能具有調(diào)控作用［7］。本研究結(jié)果表明，肺結(jié)核患者CD4＋CD25＋T淋巴細(xì)胞的數(shù)量明顯高于健康者，提示結(jié)核分枝桿菌進入機體后，可在宿主細(xì)胞內(nèi)大量寄生和繁殖，從而誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)。NO是在NO合成酶（NOS）作用下由L－精氨酸轉(zhuǎn)化而來。NOS是生成NO的關(guān)鍵酶。一方面，在c NOS的作用下，參與血管張力生理性調(diào)節(jié)過程；另一方面，iNOS激活后可介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，產(chǎn)生大量的NO，從而參與免疫病理反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，肺結(jié)核患者血清NO水平高于健康者，表明NO水平的變化與肺結(jié)核的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，參與肺結(jié)核的免疫炎性反應(yīng)［8－9］。

綜上所述，肺結(jié)核患者CD4＋CD25＋T淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯升高，而CD4＋CD25＋T淋巴細(xì)胞又高表達(dá)FOXP3，說明FOXP3的高表達(dá)可能在肺結(jié)核發(fā)病機制中起重要作用。同時，肺結(jié)核患者血清NO水平也明顯升高，表明NO的高表達(dá)也參與肺結(jié)核的免疫炎性反應(yīng)。因此，在肺結(jié)核的治療中，對NO和FOXP3介導(dǎo)的免疫耐受進行干預(yù)十分必要。動態(tài)監(jiān)測NO、FOXP3表達(dá)水平的變化，有利于肺結(jié)核患者的診治。這為進一步研究NO和FOXP3在肺結(jié)核發(fā)生、發(fā)展機制中的作用奠定了基礎(chǔ)。

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Study of NO and FOXP3 in patients with pulmonary tuberculosis

Shen Liyan，Shen Weihong，Zhu Lan
（Nanjing Medical University Affiliated Suzhou Hospital/Suzhou Municipal Hospital，Suzhou，Jiangsu 215001，China）

ObjectiveTo Study the expressions and significance of nitric oxide（NO）and forkhead box protein 3（FOXP3）in patients with pulmonary tuberculosis.MethodsSerum NO levels were measured by Griess colorimetric reaction.Flow cytometry was used to determine the number of CD4＋CD25＋T cells in peripheral blood.The expression of FOXP3 m RNA was measured by real－time polymerase chain reaction.ResultsSerum NO level in patients was（15.71±1.26）μmol/L，higher than the（5.45± 0.98）μmol/L of healthy controls（P＜0.05）.CD4＋CD25＋T cells comprised（4.57±0.85）%of CD4＋T cells in patients，higher than the（1.83±0.49）%in healthy controls（P＜0.05）.CD4＋CD25＋T cells in the peripheral blood of patients with pulmonary tuberculosis highly expressed FOXP3.ConclusionPatients with pulmonary tuberculosis could be with an increased level of NO and FOXP3，which might have important role in the pathogenesis of pulmonary tuberculosis.

nitric oxide； forkhead box protein 3； pulmonary tuberculosis

10.3969/j.issn.1673－4130.2015.10.019

A

1673－4130（2015）10－1364－02

2015－02－08）

沈麗燕，女，檢驗師，主要從事臨床免疫學(xué)檢驗研究。