池振明， 王致鵬， 徐紅梅

(中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東 青島 266003)

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綜 述

嗜冷酵母菌在低溫下生長和適應(yīng)及可能的機(jī)理

池振明， 王致鵬， 徐紅梅

(中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東 青島 266003)

地球表面的許多地方溫度都低于5℃，如海洋和兩極地區(qū)。嗜冷微生物在這些地區(qū)大量存在。近年來，研究人員從不同的低溫環(huán)境分離到多種嗜冷酵母菌，并且發(fā)現(xiàn)酵母菌比細(xì)菌適應(yīng)低溫環(huán)境的能力更強(qiáng)。嗜冷酵母菌在低溫環(huán)境下的適應(yīng)和生長機(jī)理已經(jīng)成為研究熱點。最新研究情況表明，脂類、酶、海藻糖、熱激蛋白和抗冷凍蛋白等均與嗜冷酵母適應(yīng)低溫的機(jī)制相關(guān)。了解嗜冷酵母菌在低溫下生長和適應(yīng)的機(jī)理有助于發(fā)現(xiàn)低溫環(huán)境的生命新現(xiàn)象和發(fā)現(xiàn)嗜冷酵母的用途。

低溫環(huán)境； 嗜冷酵母； 適應(yīng)； 分子機(jī)理

低溫環(huán)境占地球表面的大部分。海洋的溫度在-1～5℃之間，大洋深處溫度為1～3℃；北極和南極的大部分地方長期處在冷凍狀態(tài)，僅在夏天有數(shù)周時間解凍。這些天然的低溫環(huán)境還包括凍土、高山等。大部分生物無法適應(yīng)低溫環(huán)境,只有嗜冷微生物、耐冷微生物、某些動物和藻類可以在這些環(huán)境中生長[1]。這些低溫生物特別是嗜冷微生物和耐冷微生物適應(yīng)低溫環(huán)境的機(jī)理引起了許多研究者的興趣。研究嗜冷微生物和耐冷微生物適應(yīng)低溫環(huán)境的機(jī)理具有重要的生命科學(xué)意義，且嗜冷微生物和耐冷微生物可以產(chǎn)生許多有價值的酶和活性產(chǎn)物。利用酵母菌研究低溫適應(yīng)機(jī)制具有許多優(yōu)點：酵母菌為真核細(xì)胞，細(xì)胞結(jié)構(gòu)更接近高等生物；酵母菌生長繁殖迅速，遺傳操作體系比較簡單，很容易從分子水平進(jìn)行研究。另外，Turkiewicz等認(rèn)為酵母菌可能比細(xì)菌更適應(yīng)低溫環(huán)境，這正好與高溫環(huán)境中的情況相反[2-3]。近年在南極和其他低溫環(huán)境中發(fā)現(xiàn)了許多嗜冷酵母菌屬，如：Bullera,Candida,Cryptococcus,Cystofilobasidium,Debaryomyces,Kondoa,Leucosporidium,Metschnikowia,Mrakia,Pseudozyma,Rhodotorula,Sakaguchia,Sporopachydermia,Sympodiomyces和Trichosporon等[4-5]。本實驗室從南極分離到許多酵母菌，其中1株可以生產(chǎn)胞外乳糖酶[6-8]。嗜冷酵母菌最低、最適和最高生長溫度分別是0、15和20℃，而耐冷酵母菌的最低、最適和最高生長溫度分別是0,20和30℃。那么嗜冷酵母菌的最適生長溫度為何是15℃？當(dāng)溫度高于15℃或低于15℃細(xì)胞將做出什么反應(yīng)？當(dāng)溫度高于25℃嗜冷酵母菌為何不能生長？中溫酵母菌對溫度的反應(yīng)是否也存在于嗜冷酵母菌？如何在分子和基因水平上解釋嗜冷酵母菌對低溫的反應(yīng)？下面就嗜冷酵母菌在低溫下生長和適應(yīng)的分子機(jī)理的研究情況進(jìn)行簡單介紹。

1 細(xì)胞形態(tài)

嗜冷酵母菌(Leucosporidiumstokesii)生長在23℃(高于最高生長溫度)下會出現(xiàn)以下現(xiàn)象：細(xì)胞變大，細(xì)胞壁無規(guī)則生長，細(xì)胞核消失，芽細(xì)胞處的隔壁消失[9]。這種情況對細(xì)胞沒有致死作用，溫度回到15℃細(xì)胞就恢復(fù)正常形態(tài)。芽細(xì)胞出現(xiàn)無核現(xiàn)象的原因是DNA不能正常合成，細(xì)胞增大的原因是RNA和蛋白質(zhì)的不間斷合成，但出現(xiàn)其他現(xiàn)象的具體機(jī)制仍不清楚[10]。嗜冷酵母菌(Candidanivalis)的細(xì)胞質(zhì)膜在25℃下出現(xiàn)異常，導(dǎo)致細(xì)胞組分泄漏[11]。嗜冷酵母菌(Rhodotorulaaurantiaca)在18℃下培養(yǎng)就會出現(xiàn)細(xì)胞增大和細(xì)胞組分泄漏的現(xiàn)象[12]，如圖1所示。在18℃下培養(yǎng)的細(xì)胞出現(xiàn)泄漏是由于中長鏈酰基CoA硫酯酶失去活力，有毒的C14酰基-CoA大量累積而造成細(xì)胞膜損傷。C14酰基-CoA的累積是嗜冷酵母菌不能在高溫下生長的原因之一[12]。

一些與細(xì)胞壁緊密結(jié)合的水解酶，如幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶，對于維持細(xì)胞壁的可塑性、細(xì)胞壁多糖或糖蛋白之間的交聯(lián)和子細(xì)胞與母細(xì)胞的分離起著非常重要的作用[13]。大部分酵母細(xì)胞均具有上述水解酶活力，但是尚不清楚這些水解酶是否與低溫下子細(xì)胞與母細(xì)胞的分離有關(guān)。

(B圖箭號所示可以看到細(xì)胞出現(xiàn)泄漏。 Leaking cells were pointed at by the arrows.)

圖1 在0℃下生長的正常細(xì)胞(A)和在18℃下生長的非正常細(xì)胞(B)

Fig.1 Normal cells (A) at 0°C and abnormal cells (B) at 18°C

2 細(xì)胞分裂周期

Silver等人觀察到嗜冷酵母菌Leucosporidiumstokesii在20℃以上便停止生長，這是由于細(xì)胞不能完成與細(xì)胞核分裂有關(guān)的反應(yīng)，如DNA合成和正常的細(xì)胞分裂周期等[10]。

3 脂類在嗜冷酵母菌細(xì)胞生長中的作用

細(xì)胞質(zhì)膜要有功能必須處在半流動的液體狀態(tài)。一般情況，生長溫度的降低會導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)膜不飽和脂肪酸含量增加、脂肪酸鏈長度下降、支鏈脂肪酸含量增加，所有這些變化均降低了細(xì)胞質(zhì)膜的流動性。低溫環(huán)境中的微生物的細(xì)胞質(zhì)膜含有較高比例的C18:2脂肪酸(熔點為-5℃)和C18:3脂肪酸(熔點-11℃)，從而維持膜的半流動狀態(tài)而不出現(xiàn)固化，使代謝過程正常進(jìn)行[14-15]。根據(jù)這種情況，嗜冷酵母菌甚至可以生長在-10℃以下。嗜冷酵母菌Leucosporidium.sp和Cryptococcusstatzelliae的細(xì)胞質(zhì)膜中不飽和脂肪酸的含量達(dá)到50%～90%[16-17]。從北極分離的5株不同種的嗜冷酵母菌分別在1、4、15和20℃下培養(yǎng)，隨著溫度的降低細(xì)胞質(zhì)膜中不飽和脂肪酸的含量隨之增加；其中C18:3脂肪酸含量的增加最為明顯，Rhodotorulamucilaginosa的細(xì)胞質(zhì)膜中C18:3脂肪酸的含量由20℃下的8.2%提高到1℃下的25.1%[18]。耐冷酵母菌Guehomycespullulans17-1菌株隨著培養(yǎng)溫度從20℃下降到10℃，細(xì)胞膜中C18:3脂肪酸含量從1.2%升到7.7%，而在25℃下細(xì)胞膜中不含有C18:3脂肪酸(見表1[19])。從不飽和脂肪酸合成途徑來說，菌株的Δ6-脫飽和酶在25℃下應(yīng)該沒有活性或它的基因得不到表達(dá)，當(dāng)培養(yǎng)溫度從20℃下降到10℃，Δ6-脫飽和酶開始有活性或它的基因得到表達(dá)，催化C18:2脂肪酸變成C18:3脂肪酸[20]。所以從嗜冷酵母菌中克隆Δ6-脫飽和酶和其他脫飽和酶基因，研究脫飽和酶在不同溫度下的活性調(diào)控機(jī)制，對于了解嗜冷酵母菌的低溫適應(yīng)機(jī)理具有重要的意義。

表1 不同溫度對耐冷酵母菌(G. pullulans) 17-1 C18:3脂肪酸組成的影響

注：表中數(shù)據(jù)表示平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n=3。

Note:Data are given as means ± SD,n=3.

與中溫酵母菌相比，嗜冷酵母菌的細(xì)胞質(zhì)膜含有更多的PE(Phosphatidyl ethanolamine)，PE上的氨基之間形成的氫鍵和PE的親水性可以在亞零度下阻止冰的形成[15]。細(xì)胞質(zhì)膜中的脂肪酸也分布于磷脂，所以作者認(rèn)為應(yīng)多研究嗜冷酵母菌細(xì)胞質(zhì)膜的磷脂組成和不飽和脂肪酸在各種磷脂中的分布，這對解釋嗜冷酵母菌在低溫下的適應(yīng)機(jī)制也許更有意義。

4 蛋白質(zhì)的柔軟性

嗜冷微生物產(chǎn)生的酶在低溫下活性最高，在中溫下就喪失活力[14]，嗜冷酵母菌Cryptococcusadeliensi的木聚糖酶在4℃下的催化效率(Kcat/Km)比20℃下幾乎高4倍[21]。以下幾種方式對于蛋白質(zhì)適應(yīng)低溫環(huán)境有重要的作用：降低脯氨酰殘基和精氨酰殘基的數(shù)量，增加甘氨酰殘基的數(shù)量，增加蛋白分子與溶劑的相互作用，減弱結(jié)構(gòu)域或亞基之間的相互作用，降低陰離子或陽離子之間的相互作用[22]。嗜冷酵母菌GlaciozymaAntarcticaPI12能產(chǎn)多種低溫胞外酶，如絲氨酸蛋白酶、淀粉酶、幾丁質(zhì)酶和β-甘露聚糖酶等。這些酶的結(jié)構(gòu)和基因均得到了研究，其中β-甘露聚糖酶的三維結(jié)構(gòu)已經(jīng)完成解析[23-26]。與中溫β-甘露聚糖酶和高溫β-甘露聚糖酶相比，該β-甘露聚糖酶中的β-折疊變長，α-螺旋變短，疏水氨基酸的數(shù)目增多，氫鍵和鹽橋的數(shù)目減少[26]。上述變化增大了酶蛋白的柔軟性，使酶與底物的結(jié)合更緊密，提高了低溫下的催化效率[26]。研究發(fā)現(xiàn)耐冷酵母菌Mrakiafrigida2E00797可以產(chǎn)生一種新奇和低溫活性的嗜殺因子，該嗜殺因子在超過25℃的環(huán)境中便失去活力，同時該嗜殺因子沒有常見的水解酶活力[6]。克隆該嗜殺因子的基因有助于研究其氨基酸組成與結(jié)構(gòu)柔軟性之間的關(guān)系。

5 海藻糖

許多生長在極端環(huán)境中的微生物以產(chǎn)生海藻糖作為防御機(jī)制，使得它們可以在這些環(huán)境中生存，并穩(wěn)定細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能。當(dāng)周圍環(huán)境的溫度迅速下降至接近凍結(jié)溫度時，酵母細(xì)胞誘導(dǎo)合成6-磷酸海藻糖合成酶(Tps1)和6-磷酸海藻糖酯酶(Tps2)，產(chǎn)生大量的化學(xué)伴侶海藻糖。由于這種效應(yīng)僅在10℃和低于10℃下才可以觀察到，所以稱之為“接近凍結(jié)溫度的反應(yīng)”(Near-freezing response)。海藻糖的累積對于細(xì)胞在0℃下存活是絕對需要的，但是海藻糖保護(hù)細(xì)胞的具體機(jī)制現(xiàn)在還不清楚。當(dāng)環(huán)境恢復(fù)到正常生長溫度時，細(xì)胞中的海藻糖濃度迅速下降，這可能是中性海藻糖水解酶作用的結(jié)果，該酶基因的表達(dá)也受到冷激的影響[27]。中溫酵母菌在20℃下培養(yǎng)，TPS1和TPS2基因控制合成的mRNA量非常少；當(dāng)培養(yǎng)溫度下降到10、4或0℃2個基因控制合成的mRNA量迅速上升，在0℃下經(jīng)過15～20h處理，TPS1和TPS2基因控制合成的mRNA量增加了20倍。mRNA量增加的原因是TPS1和TPS2基因轉(zhuǎn)錄水平上升，同時TPS1 mRNA和TPS2 mRNA的穩(wěn)定性提高，但穩(wěn)定性提高的原因還不清楚[27]。在0℃下TPS1和TPS2基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)與Msn2,4途徑有密切的關(guān)系。Msn2和Msn4是轉(zhuǎn)錄因子，能與TPS1 和TPS2 基因的啟動子中對逆境能做出反應(yīng)的元件(Stress-response elements)結(jié)合，從而上調(diào)基因的轉(zhuǎn)錄水平。這些是利用中溫酵母菌進(jìn)行研究所獲得的結(jié)果，在嗜冷酵母菌中是否有類似的情況還不清楚。研究發(fā)現(xiàn)耐冷酵母菌Guehomycespullulans17-1在培養(yǎng)溫度高于15℃時海藻糖含量上升，6-磷酸海藻糖合成酶的活性和TPS1 基因的轉(zhuǎn)錄水平也上升；低于15℃時海藻糖含量下降，6-磷酸海藻糖合成酶的活性和TPS1 基因的轉(zhuǎn)錄水平也下降[28]。從嗜冷酵母菌中克隆海藻糖合成相關(guān)酶的基因，在基因水平上研究各種基因的表達(dá)調(diào)控對于了解嗜冷酵母菌在低溫下適應(yīng)和生長的機(jī)理具有重要的意義。

6 熱激蛋白

任何微生物受到熱激后都在細(xì)胞內(nèi)合成熱激蛋白(Heat Shock Proteins, HSPs)和海藻糖。HSPs是一類高度保守的蛋白質(zhì)，根據(jù)它們的分子量可以分為許多家族，如104,100,90,70和60kDa等。它們可以存在于不同的細(xì)胞器中，作為分子伴侶具有許多功能，如蛋白質(zhì)正常折疊和裝配，去除和修復(fù)受損蛋白質(zhì)等。當(dāng)溫度大于20℃，嗜冷酵母菌Mrakiafrigida,Leucosporidiumfellii,Candidapsychrophila和Leucosporidiumscottii便合成熱激蛋白[29-30]，其中C.psychrophila細(xì)胞中的110kDa熱激蛋白受到強(qiáng)烈誘導(dǎo)。這種110kDa熱激蛋白可能與中溫酵母菌中的HSP104一樣在抗熱過程中起重要作用。從嗜冷酵母菌中克隆HSP110熱激蛋白基因，然后進(jìn)行基因敲除和基因表達(dá)對了解嗜冷酵母菌中該蛋白的抗逆作用具有重要意義。

7 抗冷凍蛋白

低溫液體中存在大量的冰核劑，很容易結(jié)冰。雖然小冰晶不會損傷細(xì)胞，但要避免發(fā)生重結(jié)晶造成細(xì)胞損傷。生活在冰山或者海冰等低溫環(huán)境中的生物能產(chǎn)生抗冷凍蛋白(Antifreeze proteins,AFPs)，抗冷凍蛋白具有降低冰點的熱滯活性(Thermal hysteresis)和避免對細(xì)胞產(chǎn)生機(jī)械損傷的重結(jié)晶抑制活性(Ice recrystallization inhibition)。目前已經(jīng)從在低溫環(huán)境中生存的昆蟲、植物、細(xì)菌、硅藻和其他藻類中分離到了抗冷凍蛋白。多種嗜冷酵母菌能產(chǎn)生抗冷凍蛋白，其中一些抗冷凍蛋白的編碼基因已經(jīng)得到了克隆[31-33]。1種新發(fā)現(xiàn)的嗜冷酵母菌Rhodotorulasvalbardensis能產(chǎn)生抗冷凍蛋白從而在-1℃下正常生長，這種抗冷凍蛋白能使細(xì)胞內(nèi)的冰晶呈特殊的六邊形。嗜冷酵母菌GlaciozymaAntarcticaPI12的1個抗冷凍蛋白基因AFP1已經(jīng)得到克隆。菌株分別處于15和-12℃下培養(yǎng)，熱滯活性和重結(jié)晶抑制活性在-12℃下升高，AFP1基因的轉(zhuǎn)錄水平也顯著提高[33]。將AFP1在大腸桿菌中表達(dá)，重組蛋白同樣表現(xiàn)出抗凍活性?？寺『捅磉_(dá)嗜冷酵母菌的抗冷凍蛋白基因?qū)τ诹私馄渚唧w的抗冷凍機(jī)制有重要作用[33]。

8 用于合成相容性物質(zhì)的能量

處在高溫和低溫環(huán)境中的細(xì)胞都要合成相容性物質(zhì)，如海藻糖、甘油、各種氨基酸、甘氨酸膽堿和ectoine等[34]。細(xì)胞合成這些物質(zhì)需要消耗大量的能量，物質(zhì)分子量越大消耗的能量越多。與合成二糖(12個碳)相比，細(xì)胞合成較小分子量的物質(zhì)消耗的能量就少些，如甘油(3個碳)、甘氨酸膽堿(5個碳)或ectoine(6個碳)。甘油的合成在所有相容性物質(zhì)中所需的能量最少，并且甘油在細(xì)胞中溶解度最大,也不影響細(xì)胞內(nèi)各種酶的活力。所以，從生物進(jìn)化角度來看，大部分微生物應(yīng)該選擇甘油作為抗逆物質(zhì),但是只有真核生物特別是酵母菌利用甘油作為細(xì)胞內(nèi)相容性物質(zhì)。至今尚未有嗜冷酵母菌累積甘油來適應(yīng)低溫環(huán)境的報道。

9 結(jié)論

近年來嗜冷酵母菌在低溫下適應(yīng)和生長機(jī)理的研究取得了許多進(jìn)展，但是真正從基因水平上進(jìn)行的研究非常少，并且相當(dāng)部分是利用中溫酵母菌進(jìn)行研究所得到的結(jié)果。要真正了解嗜冷酵母菌在低溫下生長和適應(yīng)的機(jī)理，必須克隆與不飽和脂肪酸、磷脂、嗜冷酶、海藻糖合成酶、熱激蛋白和抗冷凍蛋白等合成有關(guān)的基因，研究這些基因的結(jié)構(gòu)、功能和調(diào)控，研究基因所編碼蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)與活性之間的關(guān)系。

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責(zé)任編輯 朱寶象

The Mechanism Underlining the Adaptation of Psychrophilic Yeasts to Cold Environments

CHI Zhen-Ming, WANG Zhi-Peng, XU Hong-Mei

(College of Marine Life, Ocean University of China, Qingdao 266003,China)

Habitats such as oceans and polar regions with low temperature (below 5°C)represent a large proportion of the surface of our planet. It has been reported that psychrophilic microorganisms play an important role in such habitats. In recent years, many genera of psychrophilic yeasts have been isolated from different cold environments and these yeasts are found to be able to adapt to cold environments better than bacteria. At the same time, many researchers have been interested in understanding the mechanism underlining of the cold-adaptation of psychrophilic yeasts. It has been documented that lipids, enzymes, trehalose, heat shock proteins and antifreeze proteins involve in the cold-adaption of psychrophilic yeasts; Elucidation of the mechanism underlining the cold-adaption of psychrophilic yeasts will be helpful to understanding the life in the cold environments and finding new applications of psychrophilic yeasts.

cold environment； psychrophilic yeast； cold-adaption； molecular mechanism

2014-03-04；

2014-12-18

池振明(1959-)，男，教授，主要從事海洋微生物研究。E-mail: chi@ouc.edu.cn

Q949.32;Q935

A

1672-5174(2015)05-054-05

10.16441/j.cnki.hdxb.20140062