姚學(xué)良，徐曉麗，張振奎，丁子元，宋昀鵬，崔寬寬

(天津市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，天津 300221)

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豹紋鰓棘鱸病原鰻利斯頓氏菌的分離鑒定及生物學(xué)特性研究*

姚學(xué)良，徐曉麗，張振奎，丁子元，宋昀鵬，崔寬寬

(天津市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，天津 300221)

從患病的豹紋鰓棘鱸(Plectropomusleopardus)的腎臟中分離到1株優(yōu)勢菌33002，人工感染試驗(yàn)證實(shí)其對豹紋鰓棘鱸有較強(qiáng)的致病性；采用形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特性分析及16S rRNA和gyrB基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹分析對菌株33002進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示，菌株33002為革蘭氏陰性弧菌，生化特性與利斯頓氏菌屬的鰻利斯頓氏菌(Listonellaanguillarum)相近，基于gyrB基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析,菌株33002與鰻利斯頓氏菌聚為一支。對48種抗生素的藥敏結(jié)果顯示，菌株33002對紅霉素、阿奇霉素等25種藥物敏感，對恩諾沙星、桿菌肽等22種藥物不敏感。

豹紋鰓棘鱸；鰻利斯頓氏菌；生理生化特性；16S rRNA；gyrB

豹紋鰓棘鱸(Plectropomusleopardus)俗稱東星斑、花斑刺鰓鮨、豹鲙，隸屬鱸形目(Perciformes)、鮨科(Serranidae)、鰓棘鱸屬(Plectropomus)，主要分布于西太平洋至印度洋海區(qū)，北自日本南部，南至澳洲，東自斐濟(jì)，西到非洲東岸、紅海等地。豹紋鰓棘鱸肉質(zhì)鮮美，含有二十幾種人體所需微量元素及維生素，營養(yǎng)價值高，價格昂貴，在國際市場上深受歡迎，市場前景廣闊。隨著豹紋鰓棘鱸人工繁殖技術(shù)的突破，該魚已成為南方沿海特別是海南沿海的后備養(yǎng)殖品種，并由南向北擴(kuò)展。由于豹紋鰓棘鱸養(yǎng)殖歷史短，針對該魚的研究報(bào)道較少，多集中于對其人工繁育及胚胎發(fā)育、環(huán)境因子對幼魚的生長影響等研究[1-3]，在疾病方面鮮有報(bào)道。

鰻利斯頓氏菌(Listonellaanguillarum)是水產(chǎn)養(yǎng)殖動物中常見且重要的病原菌，已知能夠感染50多種海淡水養(yǎng)殖動物，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴(yán)重危害[4-5]。本研究從患病豹紋鰓棘鱸腎臟分離到病原菌，經(jīng)鑒定為鰻利斯頓氏菌，對其進(jìn)行理化特性、致病性、抗菌藥物敏感性及16S rRNA基因與gyrB基因系統(tǒng)發(fā)育分析，豐富了鰻利斯頓氏菌的相關(guān)研究資料，并為豹紋鰓棘鱸細(xì)菌性疾病的檢測及防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

患病豹紋鰓棘鱸取自天津盛億水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司，體質(zhì)量25～35g，人工感染用健康豹紋鰓棘鱸購自天津市海發(fā)海珍品股份有限公司，體質(zhì)量(27±3)g，暫養(yǎng)1周后用于人工感染實(shí)驗(yàn)，飼養(yǎng)期間采用充氣泵增氧，每日投餌2次，吸污1次，換水1/2，保持實(shí)驗(yàn)期間水溫20℃，鹽度25。2216E瓊脂、胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)培養(yǎng)基、細(xì)菌微量生化反應(yīng)管及細(xì)菌藥敏紙片等均購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.2 細(xì)菌分離

無菌條件抽取有明顯癥狀的豹紋鰓棘鱸腹水滴片進(jìn)行革蘭氏染色，觀察細(xì)菌典型形態(tài)，從病魚腎臟中分離細(xì)菌，分別劃線接種于2216E瓊脂、TCBS培養(yǎng)基上，于28℃培養(yǎng)24h，挑取形態(tài)一致的優(yōu)勢菌落進(jìn)一步純化，獲得純培養(yǎng)的菌株，轉(zhuǎn)接于TSB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，加15%甘油于-80℃冰箱中保存。

1.3 人工感染實(shí)驗(yàn)

將純培養(yǎng)菌接種于TSB培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)過夜，0.85%NaCl洗滌3次，菌懸液濃度調(diào)至3×107cfu/mL做為供試菌液，待用。感染實(shí)驗(yàn)分2組，每組6尾豹紋鰓棘鱸。試驗(yàn)組腹腔接種供試菌液，每尾0.2mL；對照組注射等量0.85% NaCl；每天觀察記錄實(shí)驗(yàn)魚感染后的發(fā)病及死亡情況，期間每天正常飼養(yǎng)并換水，并取癥狀典型的實(shí)驗(yàn)魚再次進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定。以引起試驗(yàn)魚發(fā)病死亡并能重新分離到感染菌作為分離菌致病與否的判定指標(biāo)。

1.4 細(xì)菌鑒定

1.4.1 形態(tài)與菌落特征觀察及理化特性檢查 取純培養(yǎng)菌接種于2216E瓊脂于28℃培養(yǎng)20h，制備涂片標(biāo)本進(jìn)行革蘭氏染色觀察細(xì)菌形態(tài)特征；參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》和《人及動物病原細(xì)菌學(xué)》[6-7]進(jìn)行細(xì)菌氧化酶、糖(醇及苷)類代謝、H2S、吲哚、甲基紅、V-P試驗(yàn)、硝酸鹽還原、枸櫞酸鹽利用等理化特性測定。

1.4.2 16S rRNA和gyrB基因序列測定與系統(tǒng)發(fā)育分析

PCR模板的制備 取1mL菌液12000r/min離心1min，棄上清，沉淀重懸于100μL無菌蒸餾水中，煮沸5min后迅速冰浴10min，12000r/min離心5min，取上清作為PCR反應(yīng)模板。

16S rRNA基因序列的PCR擴(kuò)增 采用通用引物B27F：5′-AGA GTT TGA TCM (C) TGG CTC AG-3′與1492R:5′-ACG GY(C)TAC CTT GTT ACG ACT T-3′擴(kuò)增細(xì)菌的16S rRNA[8]，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3min，94℃變性1min、55℃退火1min、72℃延伸2min，30個循環(huán)后72℃延伸10min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生物工程技術(shù)公司進(jìn)行基因序列測定。

gyrB基因序列的PCR擴(kuò)增與測序gyrB基因擴(kuò)增的引物為：UP1(正向引物)，5′-GAA GTC ATC ATG ACC GTT CTG CAY GCN GGN GGN AAR TTY GA-3′；UP2r(反向引物)，5′-AGC AGG GTA CGG ATG TGC GAG CCR TCN ACR TCN GCR TCN GTCAT-3′[9]。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min，94℃變性1min、57℃退火1min、72℃延伸2min，30個循環(huán)后72℃延伸7min。PCR產(chǎn)物送至上海生物工程技術(shù)公司進(jìn)行基因序列測定。

16S rRNA和gyrB基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 將分離細(xì)菌的16S rRNA基因和gyrB基因序列通過NCBI的Blast檢索系統(tǒng)(http://www. ncbi. nlm.nih. gov/Blast/)進(jìn)行序列同源性分析，并從中選取相關(guān)的16S rRNA基因和gyrB基因序列，采用Clustal X軟件進(jìn)行多序列匹配排列(Multiple Alignments)，分別以16S rRNA基因和gyrB基因序列為遺傳標(biāo)記，用MEGA5.1采用鄰接法(Neighbor joining method)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，通過自舉分析檢測置信度(1000次重復(fù))。

1.5 藥物敏感性測定

所分離菌株的藥敏實(shí)驗(yàn)采用常規(guī)瓊脂擴(kuò)散(K-B)法進(jìn)行，調(diào)整菌液濃度為1.5×108cfu/mL均勻涂布于平板，將選定的48種抗生素藥敏紙片貼于平板上，于28℃培養(yǎng)24h觀察，記錄各抑菌圈直徑(mm)，按照藥敏紙片使用說明中的抑菌范圍解釋標(biāo)準(zhǔn)判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 病魚癥狀及病原菌分離

病魚體表鱗片脫落、潰爛，腹部膨大，有腹水，肝貧血，腎潰爛呈乳白色小米粒狀(見圖1)。在患病豹紋鰓棘鱸腹水中，存在大量革蘭氏陰性弧菌，細(xì)菌散在或成雙排列，兩端鈍圓(見圖1)。從病魚腎臟中也分離到了同種形態(tài)細(xì)菌，在2216E上培養(yǎng)24h后形成圓形光滑、不透明、隆起、乳白色、邊緣整齊的菌落，在TCBS上形成黃色菌落。在TSB培養(yǎng)基中呈均勻混濁生長，管底有點(diǎn)狀菌體沉淀，且有菌膜形成。取單菌落做純培養(yǎng)，編號33002。

圖1 人工感染發(fā)病魚癥狀圖及鰻利斯頓氏菌菌落形態(tài)圖Fig.1 The symptom of diseased fish with virulence test and colony morphology diagram of L.anguillarum

2.2 分離菌的致病性

試驗(yàn)組的豹紋鰓棘鱸于感染4d后陸續(xù)死亡，并出現(xiàn)明顯的體色變淺、體表潰爛、輕度腹水、肝臟貧血等癥狀，10d后試驗(yàn)組魚全部死亡。對照組豹紋鰓棘鱸在14d觀察期內(nèi)不表現(xiàn)出任何癥狀，無一死亡；從感染死亡魚的腎臟分離細(xì)菌，純培養(yǎng)后進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示再次分離的菌株與原感染菌的形態(tài)特征、理化特性及16S rRNA基因序列均一致，證明所分離菌株33002為本次引起豹紋鰓棘鱸死亡的病原菌，且具有較強(qiáng)的致病性。

2.3 理化性狀

菌株33002的生理生化結(jié)果見表1，與鰻利斯頓氏菌的生理生化特征基本一致，初步判定菌株33002為利斯頓氏菌屬(Listonella)的鰻利斯頓氏菌(L.anguillarum)。

表1 菌株33002和鰻利斯頓氏菌的生理生化特征的比較Table 1 Comparison of physiological and chemical characteristics of strain 33002 and L. anguillarum

2.4 16S rRNA和gyrB基因序列與系統(tǒng)發(fā)育分析

對菌株33002進(jìn)行16S rRNA和gyrB基因序列的擴(kuò)增，經(jīng)序列測定和同源比對，菌株33002與鰻利斯頓氏菌(L.anguillarum)、病海魚弧菌(V.ordalii)、創(chuàng)傷弧菌(V.vulnificus)及河口弧菌(V.aestuarianus) 16S rRNA基因序列相似性均在97%以上。選擇乳房鏈球菌16S rRNA基因序列(登錄號：U41048)作為外圍菌將分離菌與檢索出的部分弧菌菌株的16S rRNA基因序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果顯示菌株33002與鰻利斯頓氏菌、病海魚弧菌聚為一支，置信度為99%(見圖2)；菌株33002的gyrB基因序列與鰻利斯頓氏菌(L.anguillarum)的相似性為99%，遠(yuǎn)高于與擬態(tài)弧菌(V.mimicus)、霍亂弧菌(V.cholerae)、河口弧菌(V.aestuarianus)等的相似性(86%以下)，選擇乳房鏈球菌gyrB基因序列(登錄號：AB238638)作為外圍菌構(gòu)建的基于gyrB基因的系統(tǒng)發(fā)育樹將菌株33002與鰻利斯頓氏菌聚為一支(見圖3)。結(jié)合形態(tài)觀察、生理生化特征、16S rRNA和gyrB的分子鑒定結(jié)果，判定分離菌33002為鰻利斯頓氏菌。

2.5 藥物敏感性

分離菌對供試的48種抗菌藥物中的恩諾沙星、制霉菌素、苯唑青霉素、桿菌肽等22種藥物耐藥，對復(fù)方新諾明中度敏感；對紅霉素、阿奇霉素、諾氟沙星、氟苯尼考等25種藥物敏感(見表2)。

圖2 以16S rRNA基因構(gòu)建的L. anguillarum系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of L. anguillarum based on 16S rRNA genes

抗菌藥物Drug 劑量/μg·片-1Disccontent敏感性Sensitivity抗菌藥物Drug 劑量/μg·片-1Disccontent敏感性Sensitivity復(fù)方新諾明SMZ+TMP75I苯唑青霉素Oxacillin1R紅霉素Erythromycin15S多黏霉素BPolymyxinB300UR阿奇霉素Azithromycin15S羅紅霉素Roxithromycin15R鏈霉素Streptomycin10S呋喃唑酮Furazolidone30R恩諾沙星Enrofloxacin5R左氟沙星Levofloxacin5S四環(huán)素Tetracycline30S制霉菌素Nystatin100R奧復(fù)星Ofloxacin5S鏈霉素Streptomycin300S丁胺卡那霉素Amikacin30R新生霉素Novobiocin30R桿菌肽Bacitracin0.04UR強(qiáng)力霉素Doxycycline30S阿洛西林Azlocillin75S麥迪霉素Midecamycin30R吉他霉素Kitasamycin15R克拉霉素Clarithromycin15R

續(xù)表2

抗菌藥物Drug 劑量/μg·片-1Disccontent敏感性Sensitivity抗菌藥物Drug 劑量/μg·片-1Disccontent敏感性Sensitivity慶大霉素Gentamicinum10R慶大霉素Gentamicinum120S阿莫西林Amoxicillin10R潔霉素Jiemycin2R克林霉素Clindamycin2R甲氧芐啶Trimethoprim5S環(huán)丙沙星Ciprofloxacin5S氯霉素Chloromycetin30S頭孢氨芐Cephalexin30R哌拉西林Piperacillin100S哌拉西林Piperacillin10S痢特靈Furazolidone300R磺胺異噁唑Sulfafurazole300S氟苯尼考Florfenicol75S淋必治Spectinomycin100S諾氟沙星Norfloxacin10S氨芐西林Ampicillin10R頭孢呋辛Cefuroxime30R頭孢克洛Cefaclor30S萬古霉素Vancomycin30R頭孢曲松Rocephin30S先鋒霉素ⅤCephalosporinⅤ30R頭孢哌酮Cefoperazone75S利福平Rifampicine5SO/12910SO/129150S

注：R： 耐藥；I：中度敏感；S：敏感；U：酶活力單位。Note：R:Denotes low or no sensitivity;I:Denotes moderate sensitivity;S:Denotes high sensitivity;U:Unit of enzyme activity.

3 討論

鰻利斯頓氏菌對水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的危害由來已久，是歐洲文獻(xiàn)記載中最早的魚類病原菌(Bonaveri 1761)，在1718年就有對鰻鱺“紅疫(red-pest)”的詳細(xì)記錄，1893年意大利學(xué)者Canestrini首次從患“紅疫”病的鰻鱺體內(nèi)分離到該菌，1909年Bergeman從瑞典暴發(fā)“紅疫”病的鰻鱺中分離到該菌并首次命名為鰻弧菌，1985年MacDonell和Colwell等建議將該菌由弧菌屬(VibrioPacini 1954)歸入利斯頓氏菌屬(Listonella)，命名鰻利斯頓氏菌。鰻利斯頓氏菌呈世界性分布，已有報(bào)導(dǎo)能夠引起大麻哈魚、硬頭鱒、大菱鲆、鰻魚、太平洋鮭、香魚、鰤魚、竹莢魚、真鯛、鱸魚、鰈魚、鱈魚、許氏平鲉、鮐魚以及蝦、蟹、牡蠣等多種水產(chǎn)養(yǎng)殖動物發(fā)生“弧菌病”[5，10-17]。隨著人工養(yǎng)殖水產(chǎn)動物種類的增加，養(yǎng)殖密度的增加及漁藥濫用導(dǎo)致的鰻利斯頓氏菌耐藥性和遺傳變異的加劇，該菌的宿主范圍不斷在擴(kuò)大，致病性及環(huán)境耐受力也在逐漸增強(qiáng)，可能引起更嚴(yán)重的病害。本次從豹紋鰓棘鱸體內(nèi)分離到鰻利斯頓氏菌，并經(jīng)人工感染試驗(yàn)證實(shí)其為本次疾病的致病菌，進(jìn)一步表明該菌在水體中的廣泛分布及在水產(chǎn)動物的強(qiáng)致病性。

16S rRNA基因序列分析是目前最常用的細(xì)菌鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分子遺傳標(biāo)記，但研究表明16S rRNA基因的水平轉(zhuǎn)移及同一基因在不同進(jìn)化分支中進(jìn)化速度有差異，適合屬以上分類階元的親緣關(guān)系研究，對屬以下的分類單位分辨率不足[15]。gyrB基因存在于大多數(shù)細(xì)菌中不同的蛋白及蛋白的不同位點(diǎn)，其氨基酸替代率也不相同，并且不會發(fā)生頻繁的水平轉(zhuǎn)移[18]，在近緣種和菌株的區(qū)分及鑒定方面與16S rRNA相比更具優(yōu)越性。本研究對分離菌33002分別進(jìn)行了16S rRNA和gyrB兩種基因的分子鑒定，比較了16S rRNA和gyrB兩種基因?qū)犂诡D氏菌的鑒別能力。分離菌33002 16S rRNA基因序列通過blast檢索，序列相似性較高的為鰻利斯頓氏菌、病海魚弧菌、創(chuàng)傷弧菌及河口弧菌等，相似性均在97%以上，在系統(tǒng)發(fā)育樹中33002與上述鰻利斯頓氏菌和病海魚弧菌聚為一個類群，未能將分離菌鑒定到種。分離菌33002gyrB基因序列通過blast檢索，與鰻利斯頓氏菌的gyrB基因序列相似性達(dá)99%，與其他弧菌的gyrB基因序列的相似性均在86%以下，且在系統(tǒng)發(fā)育樹中33002與鰻利斯頓氏菌聚為一個類群，gyrB基因序列能將分離菌鑒定到種。本研究結(jié)果表明，在弧菌屬相似細(xì)菌的鑒別方面，gyrB比16S rRNA基因更具優(yōu)越性。該項(xiàng)研究結(jié)果與張曉君等[16，19]的研究結(jié)論一致，對于細(xì)菌分離鑒定研究具有一定的指導(dǎo)意義。

在對鰻利斯頓氏菌的藥物敏感性研究方面，郭睿[20]從斜帶髭鯛上分離的鰻利斯頓氏菌對17種抗生素的敏感性顯示，對新生霉素、羅紅霉素等7種藥物敏感；對利福平、氨芐西林等8種抗生素耐藥。王庚申等[21]以25種抗菌類藥物對從許氏平鲉上分離的鰻利斯頓氏菌進(jìn)行藥物敏感性測定，發(fā)現(xiàn)其對新生霉素、克拉霉素等9種抗生素藥物高度敏感；對慶大霉素、復(fù)方新諾明等4種藥物中度敏感；對青霉素、氨芐青霉素等12種藥物具有抗性。本研究測定了分離菌對48種常用抗菌類藥物的敏感性，結(jié)果表明菌株33002對恩諾沙星、制霉菌素、苯唑青霉素、桿菌肽等22種藥物耐藥；對復(fù)方新諾明中度敏感；對紅霉素、阿奇霉素、諾氟沙星、氟苯尼考等25種藥物敏感。而張曉君等[22]測定了從同批次大菱鲆分離的20株鰻利斯頓氏菌對37種常用抗菌類藥物的敏感性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)供試菌株對其中27種抗菌藥物具有基本一致的敏感或耐藥性；對另外10種抗菌藥物表現(xiàn)出了或?yàn)楦叨让舾?、或?yàn)槊舾?、或?yàn)槟退幍木觊g差異。這一結(jié)果顯示了鰻利斯頓氏菌不同分離株在對某些抗菌類藥物敏感性方面存在不一致性。本研究結(jié)果可作為鰻利斯頓氏菌感染時選擇用藥及對鰻利斯頓氏菌耐藥規(guī)律研究的參考，但由于其株間差異性的存在，建議有效用藥應(yīng)是對每次發(fā)病病原菌進(jìn)行藥物敏感性測定后再選擇敏感藥物為宜。

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責(zé)任編輯 朱寶象

IIsolation of Pathogenic Listonella anguillarum from Plectropomus leopardus and its Biological Characterization

YAO Xue-Liang, XU Xiao-Li, ZHANG Zhen-Kui, DING Zi-Yuan, SONG Yun-Peng, CUI Kuan-Kuan

(Tianjin Fishery Technical Extension Station, Tianjin 300221, China)

A dominant bacterium nominated as 33002 was isolated from the kidney of diseasedPlectropomusleopardus. It was strongly pathogenic toP.leopardusby artificial challenge. The bacterium was characterized according to its morphological, physiological and biochemical characteristics, and 16S rRNA andgyrB gene sequences. In phylogenetic tree based ongyrBgene, 33002 was clustered withL.anguillarum. Antimicrobial susceptibility assay to 48 antimicrobial agents showed that 33002 was susceptible to 25 agents including erythromycin, azithromycin and florfenicol, but highly resistant to 22 agents including fnrofloxacin, bacitracin and furazolidone. These findings supported our identification of 33002 as a strain ofListonellaanguillarum.

Plectropomusleopardus;Listonellaanguillarum; physiological and biological characteristics; 16S rRNA gene;gyrB gene

天津市科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(12ZCZDNC00900)資助

2014-03-02；

2014-09-12

姚學(xué)良(1982-)，女，碩士，工程師，主要從事水產(chǎn)動物病害防治及水產(chǎn)養(yǎng)殖技術(shù)的研究和推廣工作。E-mail：tjyaoxueliang@126.com

S941.42+9

A

1672-5174(2015)05-039-07

10.16441/j.cnki.hdxb.20140040