潘圓未 平 鍵 張 晶 陳高峰 徐列明，3.上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院肝病研究所 (上海，20203) 2.上海市中醫(yī)臨床重點實驗室 3.上海中醫(yī)藥大學肝腎疾病病證教育部重點實驗室

安琺特是復方牛胎肝提取物，臨床上可用于急、慢性肝病、脂肪肝及肝纖維化的輔助治療。文獻報道顯示其可以改善肝纖維化患者的肝功能、纖維化血清學指標［1］，目前尚無安琺特對于改善DMN 所致肝纖維化的實驗研究報道。本研究采用DMN 腹腔注射構建慢性肝纖維化模型，觀察安琺特對該模型的干預作用，為臨床應用安琺特提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與藥物 Wistar 雄性大鼠29 只，體重(184 ±9)g，SPF 級，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，合格證號為SCXK(滬)2007-0005，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心SPF 級動物房。實驗藥物安琺特，批號121009，黑龍江江世藥業(yè)有限公司。

1.2 主要試劑與儀器 二甲基亞硝胺(dimethylnitrosamine，DMN)，Cat.No.MAL05，為東京化成工業(yè)株式會社產(chǎn)品;羧甲基纖維素鈉，Sigma 公司產(chǎn)品，購自北京鼎國生物技術有限公司。二甲苯，甲醛，無水乙醇，分析純;中性樹膠，均購自中國醫(yī)藥集團上海化學試劑公司。蘇木素伊紅染料，羥脯氨酸測定試劑盒，均購自南京建成生物制品研究所。全自動生化儀AU2700，為BECKMAN COULTER 公司產(chǎn)品。輪轉(zhuǎn)切片機(RM2035)、冰凍切片機(CM1850)、HI1210 恒溫水浴、HI1220 烤片機、LEICA ASP300 自動脫水機、LEICA EG1160 石蠟包埋機，購自德國Leica 公司。Olympus BX40 光學顯微鏡，日本Olympus 公司產(chǎn)品。連續(xù)波長酶標儀，美國BIO-TEK 公司產(chǎn)品。

1.3 造模與用藥方法 大鼠適應性飼養(yǎng)2周后，采用分層隨機方法分為正常組9 只、模型組10 只、安琺特組10 只。后兩組大鼠用0.5%DMN 按2ml/kg 體重腹腔注射，首次注射全劑量的2/3，1次/d，連續(xù)注射3d 后休息4d，共4w。正常組大鼠在相同的時間和部位行腹腔注射等劑量的生理鹽水，共4w。

造模4w 后。安琺特組大鼠按照成人用藥量的8 倍劑量灌胃，1次/d，正常組和模型組大鼠灌胃等劑量的0.5%CMC，均4w。

1.4 樣本收集及指標檢測 大鼠用藥4周后，禁食12h，20%烏來坦麻醉，下腔靜脈采血。血液4℃下靜置2h 后，3000rpm，15min 離心，取上清液分裝于1.5ml 離心管，-70℃低溫保存。動物取血處死后，取下肝臟和脾臟稱重，然后取約1.0cm×0.8cm×0.3cm 大小肝組織2 塊，于10%中性甲醛溶液中固定，24h 后逐級酒精脫水，二甲苯透明，56℃石蠟包埋，4μm 切片，-70℃保留2 管肝組織用于羥脯氨酸(Hyp)測定。采用全自動生化儀檢測血清ALT、AST、TBiL、γ-GT 和Alb。對肝組織切片進行常規(guī)HE 染色及天狼猩紅染色，觀察其病理變化。肝組織Hyp 采用南京建成生物制品研究所強堿分解法試劑盒測定。

肝纖維化分級參照相關文獻［2］的半定量標準。膠原纖維增生程度的Ⅰ級:膠原纖維增生，中央靜脈和門靜脈區(qū)有少量星狀膠原纖維束放散，但無間隔形成。Ⅱ級:膠原纖維增生，中央靜脈和門靜脈區(qū)結(jié)締組織變厚，由此向四周形成纖維索，形成不完全間隔。Ⅲ級:膠原纖維大量增生，有個別菲薄的完全間隔形成，或較厚的不完全間隔即將形成假小葉。Ⅳ級:完全間隔較厚，假小葉大量形成。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腹水發(fā)生情況 造模4周結(jié)束時無大鼠死亡。部分大鼠明顯可見腹部膨大，有腹水形成，在模型組和安琺特組隨機解剖1 只大鼠，可見腹腔大量腹水，肝臟縮小，質(zhì)地變硬，提示造模成功。至實驗結(jié)束，處死大鼠時，各組大鼠腹水發(fā)生情況見表1。

表1 各組大鼠腹水發(fā)生情況

2.2 各組大鼠肝重、脾重、肝體比及脾體比情況 見表2。

2.3 各組大鼠血清生化指標檢測結(jié)果 見表3。

表2 各組大鼠體重、肝重、脾重情況比較()

表2 各組大鼠體重、肝重、脾重情況比較()

與正常組比較，* P＜0.05;與模型組比較，##P＜0.01

表3 各組大鼠血清生化指標檢測結(jié)果比較()

表3 各組大鼠血清生化指標檢測結(jié)果比較()

與正常組比較，* P＜0.05;與模型組比較，# P＜0.05

2.4 各組大鼠肝組織病理學變化 正常組大鼠肝小葉結(jié)構清晰，肝細胞由中央靜脈向四周呈放射狀排列，無變性壞死，肝竇未見狹窄或擴張;模型組大鼠肝臟內(nèi)有大量炎性細胞浸潤，肝竇狹窄，匯管區(qū)擴大，肝細胞排列紊亂，出現(xiàn)腫脹、變性壞死，肝組織內(nèi)有明顯出血現(xiàn)象;與模型組相比，安琺特組大鼠的肝細胞變性壞死、出血、炎癥細胞浸潤等病理變化有不同程度的改善(見插頁圖1)。

天狼猩紅染色觀察:正常組大鼠肝臟僅在匯管區(qū)和中央靜脈壁見少量膠原纖維;模型組大鼠肝臟膠原增生明顯，大量纖維間隔向肝小葉伸展，分割包繞肝組織，形成假小葉;安琺特組大鼠肝臟纖維化程度較模型組明顯改善(見插頁圖2)。

2.5 各組大鼠肝組織纖維化及羥脯氨酸栓測結(jié)果 見表4。

表4 各組大鼠肝纖維化分級及羥脯氨酸檢測結(jié)果比較(，n)

表4 各組大鼠肝纖維化分級及羥脯氨酸檢測結(jié)果比較(，n)

與正常組比較，* P＜0.05;與模型組比較，# P＜0.05

表4 所示為肝纖維化等級評分情況，Ridit 分析可見，安琺特組較模型組肝纖維化明顯好轉(zhuǎn)，有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。肝組織羥脯氨酸含量測定結(jié)果與天狼猩紅染色結(jié)果一致。

3 討論

安琺特是復方牛胎肝提取物，含有小分子多肽、維生素、肌醇等多種物質(zhì)。人體內(nèi)的細胞因子是一組功能信號肽，它們都具有各自的生物學活性，彼此之間在誘生、受體調(diào)節(jié)和生物學效應3個水平上相互作用，構成一個內(nèi)含豐富、關系復雜的細胞因子網(wǎng)絡。在肝纖維化早期，細胞因子網(wǎng)絡的調(diào)節(jié)可能是重要的，若調(diào)節(jié)失常則引致肝纖維化的發(fā)生與發(fā)展。牛胎肝提取物中含有多種肝纖維化抑制因子相關多肽，可在人肝細胞中表達強大的生物學活性，通過細胞因子的多效性和協(xié)同性充分發(fā)揮細胞因子的網(wǎng)絡調(diào)控作用，完成其拮抗肝纖維化發(fā)生的調(diào)節(jié)功能［2］。本實驗中，觀察到安琺特在DMN 所致的大鼠肝纖維化模型中發(fā)揮了良好的抗肝纖維化作用。安琺特能降低肝纖維化大鼠的腹水發(fā)生率，改善肝功能，降低肝組織膠原含量，組織病理學可見安琺特組大鼠肝組織纖維化程度明顯減輕。而安琺特是如何通過調(diào)節(jié)自身的肝纖維化抑制因子從而發(fā)揮抗肝纖維化的具體機制尚需進一步深入研究。

目前，安琺特在臨床上可用于多種慢性肝病、肝纖維化的輔助治療，文獻報道顯示其有良好的抑制肝纖維化作用。張力等采用干擾素聯(lián)合安琺特用于乙型肝炎的治療，36周療程結(jié)束后，患者血清肝纖維化指標改善方面明顯優(yōu)于單用干擾素的對照組，肝組織病理亦證實聯(lián)合用藥可使肝組織炎癥活動度和纖維化程度明顯好轉(zhuǎn)，提示聯(lián)合用藥可顯著提高抗肝纖維化療效［3］。安琺特不僅能輔助抗病毒藥物治療乙型肝炎肝硬化，與其他抗肝纖維化中藥制劑聯(lián)合使用，也能取得好療效，孟勝喜等應用軟肝丸聯(lián)合安琺特用于乙型肝炎肝纖維化的治療，結(jié)果顯示兩藥聯(lián)合可明顯緩解患者的臨床癥狀，改善肝功能，降低血清肝纖維化指標［4］。

也有研究人員針對該藥進行動物實驗。蔡衛(wèi)民等復制四氯化碳大鼠肝纖維化模型，應用安琺特進行干預，結(jié)果顯示安琺特可明顯降低大鼠死亡率、改善肝臟功能和降低肝纖維化程度［5］。而本課題利用DMN 復制大鼠肝纖維化模型，DMN 模型的特點是造模時間短，肝纖維化形成穩(wěn)定，與人類肝纖維化早期改變及膠原纖維沉積特點相似，停止染毒后不易自行吸收恢復［6］。本實驗成功地復制了穩(wěn)定可靠的肝纖維化模型，實驗結(jié)果也表明安琺特可明顯降低肝纖維化大鼠的肝組織膠原含量，組織病理學可見安琺特組大鼠肝組織纖維化程度明顯減輕，同時可減少肝纖維化大鼠的腹水發(fā)生率。

本實驗結(jié)果表明:安琺特對DMN 所致的慢性實驗性肝纖維化具有良好的干預作用，為臨床應用安琺特治療慢性肝病肝纖維化提供了有益的實驗依據(jù)。其機制有待于進一步深入研究。

［1］崔建軍，范平，王松，等.安琺特與軟肝片抗肝纖維化的比較觀察［J］.中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志，2006，16(3):177 -178.

［2］王憲波，劉平，唐志鵬，等.蟲草菌絲提取物干預與治療二甲基亞硝胺誘導大鼠肝硬化的實驗研究［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2008，28(07):617 -622.

［3］張力，任曉華，李敏然，等.干擾素-α1b 聯(lián)合安琺特治療慢性乙型肝炎肝纖維化的臨床研究［J］.河北醫(yī)藥，2008，30(10):1560.

［4］孟勝喜.軟肝丸聯(lián)合復方牛胎肝提取物片治療慢性乙型肝炎肝纖維化療效觀察［J］.光明中醫(yī)，2009，24(7):1343 -1344.

［5］蔡衛(wèi)民，陶君，張彬彬，等.復方牛胎肝提取物片抗肝纖維化的實驗研究［J］.中華肝臟病雜志，2004，12(8):499.

［6］鄺勝利，胡兵.肝纖維化大鼠模型研究進展［J］.實驗動物與比較醫(yī)學，2008，28(1):62 -66.