黃 會，趙香依，吳多榮，姚 敏

(1.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院檢驗科，海南 ?？?570208；2.樂東縣人民醫(yī)院檢驗科，海南 樂東 572500)

熒光定量PCR檢測女性生殖道解脲脲原體原體的應(yīng)用評價

黃 會1，趙香依2，吳多榮1，姚 敏1

(1.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院檢驗科，海南 ?？?570208；2.樂東縣人民醫(yī)院檢驗科，海南 樂東 572500)

目的 了解熒光定量PCR檢測解脲脲原體（Uu）敏感性、特異性及其臨床應(yīng)用價值。方法收集海口人民市醫(yī)院2013年3～5月婦產(chǎn)科門診泌尿生殖道感染患者生殖道標(biāo)本共154例，同時進(jìn)行熒光定量PCR和液-固體培養(yǎng)法檢測Uu，以液-固體培養(yǎng)法作為金標(biāo)準(zhǔn)，對熒光定量PCR診斷試驗進(jìn)行方法學(xué)評價。結(jié)果154例標(biāo)本中，液-固體培養(yǎng)法即金標(biāo)準(zhǔn)檢測陽性64例，熒光定量PCR檢測陽性69例，兩者同時陽性63例，同時陰性84例，熒光定量PCR檢測Uu敏感性是98.44%(63/64)，特異性是93.33%(84/90)，假陽性率是6.67%(6/84)，假陰性率是1.56%(1/64)，陽性預(yù)測值是91.30%(63/69)，陰性預(yù)測值是98.82%(84/85)，總符合率是95.45% (147/154)。χ2檢驗顯示，兩種方法檢測結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，計算Kappa>0.75，表明兩種方法檢測結(jié)果的一致性程度較好。結(jié)論熒光定量PCR方法具有靈敏度高、特異好、檢測快速的優(yōu)點，且與培養(yǎng)法一致性也較高，具有一定的臨床應(yīng)用價值。

熒光定量PCR；解脲脲原體；應(yīng)用

解脲脲原體(Uu)是1954年Shepard首先從非淋球性菌尿道炎患者的尿道分泌物中分離獲得，是人類泌尿生殖道最常見的寄生菌之一，在特定的環(huán)境下可以治病，主要引起生殖道和泌尿道炎癥，臨床上女性表現(xiàn)為尿道炎、陰道炎、輸卵管炎、子宮內(nèi)膜炎、不孕、異位妊娠等[1-2]。近年來Uu引起的泌尿生殖道感染有增多趨勢，相關(guān)的耐藥性報道不斷增加[3-6]，因此檢測方法逐漸引起人們的重視。液-固體培養(yǎng)法靈敏度強、特異性高，準(zhǔn)確性好，被公認(rèn)為檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”[7]，但檢測時限長，檢驗要求高，操作步驟繁瑣，故不被臨床廣泛應(yīng)用，多數(shù)應(yīng)用于科研。熒光定量PCR是近幾年發(fā)展起來的分子生物學(xué)技術(shù)，因其靈敏度好，檢測時間短而越來越受到青睞。本研究以液-固體培養(yǎng)作為檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，考察熒光定量PCR的敏感性及特異性，探討熒光定量PCR的應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來源 本試驗標(biāo)本來源于?？谑腥嗣襻t(yī)院2013年3～5月154例泌尿生殖道感染的婦產(chǎn)科門診患者。由門診醫(yī)生采集女性生殖道標(biāo)本，采集后的標(biāo)本立即送檢，熒光定量PCR檢測的送往PCR室，培養(yǎng)檢測的送往微生物室進(jìn)行培養(yǎng)。

1.1.2 熒光定量PCR試劑、儀器 熒光定量PCR試劑盒為中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司，儀器采用Line gene熒光定量PCR儀，試劑均在有效期內(nèi)使用，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.1.3 培養(yǎng)基 10B肉湯和A8瓊脂平板由法國生物梅里埃公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 液-固體培養(yǎng)法 將標(biāo)本分別接種于10B肉湯和A8瓊脂平板。肉湯培養(yǎng)溫度35℃，大氣環(huán)境，瓊脂平板置于5%CO2的環(huán)境。接種后的肉湯每天兩次觀察顏色改變，1～4 d出現(xiàn)由黃變紅產(chǎn)堿改變時，檢查原種的瓊脂平板是否有菌落生長，如果沒有，迅速轉(zhuǎn)接種變色的肉湯至瓊脂平板，每天檢查原種和轉(zhuǎn)種的瓊脂平板，A8瓊脂平板在接種后1～3 d出現(xiàn)的圓形棕色菌落，直徑在10～100 μm，判斷為解脲脲原體[8]。

1.2.2 熒光定量PCR方法 將送檢標(biāo)本插入裝有1.5 ml滅菌生理鹽水的離心管中，充分震蕩混勻，擠干，12 000 rpm離心5 min；去上清，沉淀加滅菌生理鹽水1 ml混勻，12 000 r/min離心5 min；去上清，沉淀加入50 μlDNA提取液充分混勻，100℃恒溫處理10 min；12 000 r/min離心5 min，備用；陰性質(zhì)控品、陽性質(zhì)控品管各加入等量DNA提取液充分混勻，100℃恒溫處理10 min，離心備用。取PCR反應(yīng)管若干，分別加入處理后的標(biāo)本(陰性、陽性質(zhì)控品)上清液2μl，8 000 r/min離心數(shù)秒，放入儀器樣品槽，待分析結(jié)果。陽性結(jié)果：增長曲線程S型曲線；陰性結(jié)果：如果增長曲線不呈S型曲線則實驗結(jié)果判為樣品的DNA含量＜5.0×102基因拷貝。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 以培養(yǎng)法為金標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行配對設(shè)計的McNemer χ2檢驗，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義，計算Kappa值，評價兩種方法一致性程度。

2 結(jié)果

2.1 熒光定量PCR與液-固培養(yǎng)法檢測結(jié)果比較 熒光定量PCR與培養(yǎng)法同時檢測154例標(biāo)本，其中熒光定量PCR檢出Uu陽性69例，陰性85例；培養(yǎng)法檢出陽性64例，陰性90例：兩者同時陽性63例，同時陰性84例，有6例經(jīng)培養(yǎng)法檢出陰性而PCR檢出陽性，有1例經(jīng)培養(yǎng)檢出陽性而PCR檢出陰性。兩種方法檢測結(jié)果經(jīng)χ2檢驗，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P> 0.05)。計算Kappa=0.907>0.75，表明兩種方法檢測結(jié)果的一致性較好。

2.2 熒光定量PCR檢測Uu的診斷試驗評價結(jié)果 敏感性(Sen)=63/(63+1)×100%=98.44%；特異性(Spe)=84/(84+6)×100%=93.33%；假陽性率(FPR)=6/ (6+84)×100%=6.67%；假陰性率(FNR)=1/(1+63)× 100%=1.56%；陽性預(yù)測值PV+=63/(63+6)×100%=91.30%；陰性預(yù)測值PV-=84/(84+1)×100%=98.82%；總符合率=(63+84)/(63+6+1+84)×100%=95.45%。

3 討論

熒光定量PCR技術(shù)是近年來興起的檢測技術(shù)，該方法操作相對簡單，時間較短，能夠?qū)χгw進(jìn)行定量，逐漸被大型綜合性醫(yī)院廣為應(yīng)用[9-11]，但其檢測效果尚需進(jìn)一步的臨床評價。本研究以液-固體培養(yǎng)法為標(biāo)準(zhǔn)對熒光定量PCR診斷試驗進(jìn)行評價。PCR與培養(yǎng)檢測陽性分別69例和64例，同時陽性63例，同時陰性84例，其中有6例經(jīng)培養(yǎng)法檢出陰性而PCR檢出陽性，有1例經(jīng)培養(yǎng)檢出陽性而PCR檢出陰性，經(jīng)χ2檢驗，P>0.05，表明熒光定量PCR與培養(yǎng)法檢測結(jié)果之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，與周才麗等[12]和王玉珍等[13]的報道一致。對于評價兩種方法的一致性，Kappa=0.907>0.75，說明兩種檢測方法檢測結(jié)果一致性較好。熒光定量PCR敏感性為98.44%，特異性為93.33%，說明其敏感性高，特異性好?？偡下蕿?5.45%，總符合率又稱為總的正確率，總正確率越大，說明其靈敏度和特異度之和越高，假陽性與假陰性之和越小。陽性預(yù)測值為91.30%，陰性預(yù)測值為98.82%，假陽性率既誤診率6.67%，可能原因：一是PCR擴(kuò)增引物特異性不強，擴(kuò)增出無關(guān)的相似核苷酸序列；二是標(biāo)本污染了目標(biāo)DNA序列；三是6例假陽性患者可能是經(jīng)治療后培養(yǎng)顯示已轉(zhuǎn)陰性，而PCR方法能檢測出死的病原菌。假陰性率既漏診率為1.56%，可能原因：一是標(biāo)本中含有DNA擴(kuò)增的抑制劑；二是裂解液中蛋白酶K濃度低；三是標(biāo)本處理或模板制備過程導(dǎo)致模板丟失。

臨床診斷Uu多數(shù)采用液體培養(yǎng)基結(jié)合藥敏試驗判斷結(jié)果，這種方法易出現(xiàn)假陽性，且存在較為嚴(yán)重的污染問題[14]，確切的診斷需要接種于固體培養(yǎng)基并見到UU菌落，該方法是被公認(rèn)為檢測Uu的“金標(biāo)準(zhǔn)”。試驗中經(jīng)液體培養(yǎng)變紅色的86例，轉(zhuǎn)種固體培養(yǎng)后僅有82例出現(xiàn)Uu菌落，這提示我們培養(yǎng)物顏色的改變也不一定都是支原體，可能是其他微生物如變形桿菌、腸桿菌、克雷伯氏菌和酵母菌等污染所致假陽性結(jié)果，在平時的工作應(yīng)注意標(biāo)本污染導(dǎo)致的假陽。

綜上所述，熒光定量PCR具有靈敏度高、特異性好、檢測快速的優(yōu)點，同時避免了傳統(tǒng)PCR需后處理的問題，減少了污染，且與液-固體培養(yǎng)法一致性較好，能對臨床快速診斷Uu提供很大幫助，在臨床工作中具有一定的應(yīng)用價值。

[1]呂時銘.檢驗與臨床診斷婦產(chǎn)科學(xué)分冊[M].北京:人民軍醫(yī)出版社,2007:17-20.

[2]張帝開,楊冬梓.性傳播疾病病原體與女性生殖道感染[J].中國實用婦科與產(chǎn)科雜志,2005,21(3):140-142.

[3]Takahashi S,Takeyama K,Kunishima Y,et al.Analysis of clinical manifestations of male patients with urethritis[J].Infect Chemother,2006,12:283-286.

[4]王 薇,肖敬川,黃 會,等.非淋球菌性尿道炎患者支原體和衣原體感染及耐藥性分析[J].海南醫(yī)學(xué),2011,22(23):36-37.

[5]范和發(fā),盧家愷,林明珠,等.三亞地區(qū)230例解脲支原體和人型支原體的培養(yǎng)與藥敏分析[J].海南醫(yī)學(xué),2013,24(10):1531-1532.

[6]鄭文愛,閆薇臣,王芳乾,等.772例支原體患者衣原體檢測及支原體感染藥敏結(jié)果分析[J].海南醫(yī)學(xué),2014,25(2):216-217.

[7]Misteil.T Protein dynamicsimplications for nuclear architecture and gene expression[J].Science,2001,291:843-847.

[8]倪安平.支原體與衣原體的實驗室診斷[J].中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志, 2009,32(9):1076-1080.

[9]高正琴,邢 進(jìn).TaqMan MGB探針法實時熒光定量PCR快速檢測支原體的研究[J].藥物分析雜志,2011,31(9):1170-1175.

[10]劉 璐,季育華,趙 縝,等.parC檢測在解脲支原體基因分型中的臨床應(yīng)用[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志,2011,30(9): 843-845.

[11]張華黎,王 威.熒光定量PCR動態(tài)檢測女性生殖道UU及其臨床意義[J].中國麻風(fēng)皮膚病雜志,2007,23(2):165-166.

[12]周才麗,胡燕玲.熒光定量PCR法與培養(yǎng)法在檢測解脲支原體中的比較[J].現(xiàn)代診斷與治療,2011,22(2):107-108.

[13]王玉珍,盧 偉.培養(yǎng)法及PCR法用于解脲支原體檢測結(jié)果的分析[J].現(xiàn)代保健雜志,2006,3(8):108-109.

[14]陳春英,楊舒盈,朱根海.女性生殖道感染治療前后解脲支原體熒光定量PCR檢測的假陽性分析[J].中國優(yōu)生與遺傳雜志,2007, 15(3):32-33.

Application of fluorescence quantitative PCR for detection of Ureaplasma urealyticum in female genital tract.

HUANG Hui1,ZHAO Xiang-yi2,WU Duo-rong1,YAO Ming1.1.Department of Clinical Laboratory,Haikou Hospital Affiliated to Xiangya School of Medicine,Central South University,Haikou 570208,Hainan,CHINA;2.Department of Clinical Laboratory,People's Hospital of Ledong County,Ledong 572500,Hainan,CHINA

ObjectiveTo evaluate the sensitivity,specificity,and application of fluorescence quantitative PCR(FQ-PCR)for detection of Ureaplasma urealyticum(Uu)in female genital tract.MethodsA total of 154 specimens of patients with genital tract infections were detected by FQ-PCR and liquid-solid culture at the same time.All specimens were collected in Haikou People's Hospital from March 2013 to May 2013.ResultsIn the 154 specimens, 64 and 69 samples were revealed as positive according to the golden standard method and FQ-PCR method respectively,with 63 samples positive and 84 negative for both the golden standard method and FQ-PCR method.For FQ-PCR, the sensitivity rate was 98.44%(63/64),and the specificity rate was 93.33%(84/90),with the false positive rate of 6.67%(6/84),the false negative rate of 1.56%(1/64),positive predictive value of 91.30%(63/69),negative predictive value of 98.82%(84/85),and the total coincidence rate of 95.45%(147/154).χ2test results showed that there was nostatistical significant difference between the results of the two methods(P>0.05),and the consistency was good(Kappa>0.75).ConclusionFQ-PCR has the advantages of high sensitivity,good specificity,rapid detection,and high consistency with culture,and thus has certain clinical application value.

Fluorescence quantitative PCR(FQ-PCR);Ureaplasma urealyticum;Application

R711.3

A

1003—6350（2015）18—2720—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.18.0987

2015-01-28)

黃 會。E-mail：19599948@qq.com