孟令洋，姜 偉，張培玉，林學(xué)政

(1.青島大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266071；2.國(guó)家海洋局 第一海洋研究所，山東 青島 266061；3.國(guó)家海洋局 海洋生物活性物質(zhì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266061)

廣西欽州灣紅樹(shù)林抗菌活性菌株Erwiniasp.5-8的篩選及發(fā)酵條件的優(yōu)化

孟令洋1,2，姜 偉2,3*，張培玉1，林學(xué)政2,3

(1.青島大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266071；2.國(guó)家海洋局 第一海洋研究所，山東 青島 266061；3.國(guó)家海洋局 海洋生物活性物質(zhì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266061)

以金黃色葡萄球菌為指示菌，采用瓊脂擴(kuò)散法從國(guó)家海洋局海洋生物活性物質(zhì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室廣西欽州灣紅樹(shù)林微生物資源庫(kù)中篩選獲得一株具有明顯抑菌效果的菌株5-8，對(duì)該菌株進(jìn)行了分子鑒定與系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果表明，此菌為歐文氏菌屬(Erwinia)。通過(guò)單因子試驗(yàn)對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化后發(fā)酵條件為：最佳氮源為蛋白胨，最佳碳源為葡萄糖,發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值為8.0，發(fā)酵溫度為25 ℃，鹽度為1.5，搖瓶裝液量30%，接種量為1%(V種子液∶V培養(yǎng)液=1∶100)。

紅樹(shù)林；歐文氏菌；抗菌活性；系統(tǒng)發(fā)育分析；發(fā)酵條件優(yōu)化

隨著陸源微生物資源的日益貧乏，海洋尤其是特殊生境的微生物資源已引起人們的高度重視。處于“海洋——陸地”界面潮間帶濕地生態(tài)系統(tǒng)的微生物資源因其所處生境的獨(dú)特性，激起了科學(xué)家對(duì)之進(jìn)行研究的濃厚興趣。世界各地紅樹(shù)林土壤中新的微生物物種不斷被揭示。如Takenchi和Hatano[1]、Lyimo等[2]、Arunasri等[3]、Tamura和Sakane[4]均相繼從各地紅樹(shù)林土壤中分離出新的細(xì)菌。同時(shí)，由于紅樹(shù)林區(qū)的微生物所處耐鹽、厭氧等特殊生境，遺傳及生理特性與其他生境中的微生物相比具有特異性，具有產(chǎn)生新型活性物質(zhì)的潛力，是開(kāi)發(fā)新藥的重要資源[5-8]。目前，已經(jīng)從紅樹(shù)林土壤微生物中篩選出多種活性物質(zhì)[9-11]。

本研究以金黃色葡萄球菌為指示菌，對(duì)分離自廣西欽州灣紅樹(shù)林根系泥樣品中467株菌株進(jìn)行了抑菌活性篩選，篩選出一株對(duì)金黃色葡萄球菌有明顯抑菌作用的活性菌株5-8，對(duì)其進(jìn)行了抗菌活性的測(cè)定及其系統(tǒng)發(fā)育分析,并對(duì)其發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，研究了溫度、鹽度、初始pH值、裝液量和接種量對(duì)其生長(zhǎng)和抑菌活性的影響,為該活性菌株活性物質(zhì)的開(kāi)發(fā)提供了基礎(chǔ)資料。

1 材料和方法

1.1 指示菌和供試菌

供試菌：來(lái)自國(guó)家海洋局海洋生物活性物質(zhì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室微生物資源庫(kù)，分離自廣西欽州灣紅樹(shù)林根系泥的467株菌株。

指示菌：金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusACCC 01331)，由實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 培養(yǎng)基

指示菌培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化鈉10 g，瓊脂15 g，用蒸餾水定容至1 L，1×105Pa下濕熱滅菌20 min。

測(cè)試菌培養(yǎng)基(Zobell 2216E)：蛋白胨5 g，酵母粉1 g，用過(guò)濾海水和自來(lái)水按2∶1的體積比例配制的溶液定容至1 L，121 ℃下濕熱滅菌20 min。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖5 g，蛋白胨3 g，用蒸餾水定容至1 L，pH調(diào)至7.0，1×105Pa下濕熱滅菌20 min。

1.3 抗菌活性菌株的篩選

接種環(huán)挑取甘油管中保存的菌株，在Zobell 2216E培養(yǎng)基平板上劃線，置于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d；挑取單菌落于裝有5 mL Zobell 2216E培養(yǎng)基的試管(規(guī)格為15 mm×150 mm)中，振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(25 ℃，135 r/min) 4 d；取1 mL發(fā)酵液，12 000 r/min離心15 min，留上清液備用。

以金黃色葡萄球菌為指示菌，用瓊脂擴(kuò)散法篩選抗菌活性菌株。將經(jīng)過(guò)夜培養(yǎng)的指示菌用滅菌生理鹽水稀釋1 000倍，取200 μL加入指示菌培養(yǎng)基平板中，涂布均勻；然后將牛津杯放入平板中，每平板放5個(gè)；取上述上清液150 μL加入牛津杯孔內(nèi)，37 ℃培養(yǎng)15 h后觀察并記錄抑菌圈直徑。將具有抑菌作用的菌株進(jìn)一步復(fù)篩和純化，測(cè)定抑菌圈的直徑，重復(fù)3次，計(jì)算平均值。

1.4 活性菌株5-8抗菌活性研究

分別以金黃色葡萄球菌、尖刀鐮孢菌、辣椒疫霉菌、大麗輪枝菌、瓜亡革菌、大腸桿菌為指示菌，采用瓊脂擴(kuò)散法對(duì)5-8的抗菌活性進(jìn)行測(cè)定，方法同1.3。以金黃色葡萄球菌為指示菌，以慶大霉素(100 mg/L)、氨芐青霉素(100 mg/L)為陽(yáng)性對(duì)照,初始發(fā)酵培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照，根據(jù)抑菌圈直徑大小確定活性強(qiáng)度。

1.5 活性菌株的分子鑒定與系統(tǒng)發(fā)育分析

菌株16S rDNA基因的PCR擴(kuò)增按照文獻(xiàn)[12]進(jìn)行。測(cè)序工作由金斯瑞生物科技有限公司完成，將測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行相似性比較分析，選取與實(shí)驗(yàn)菌株親緣關(guān)系較近者用BioEdit軟件進(jìn)行序列比對(duì)，使用MEGA5.0軟件采用鄰接法(Neighbor-joining Method )進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.6 培養(yǎng)條件對(duì)菌株5-8生長(zhǎng)及抑菌活性影響的測(cè)定

以金黃色葡萄球菌為指示菌，分別測(cè)定了培養(yǎng)基的不同氮源(酵母粉、牛肉膏、豆餅粉、硝酸鉀、硝酸銨、氯化銨、硫酸銨)，不同碳源(蔗糖、麥芽糖、果糖、半乳糖、乳糖、木糖、可溶性淀粉)，不同鹽度(0.0，1.5，3.0，4.5，6.0，9.0),不同培養(yǎng)溫度(15，20，25，30，35，40 ℃)，不同初始pH值(4.0，5.0，7.0，8.0，9.0，11.0)，不同裝液量(100 mL的三角瓶中裝液量為10，20，30，40，50，60，70，80 mL)和不同接種量(0.25%，0.50%，0.75%，1.00%，1.50%，2.00%，4.00%，8.00%)對(duì)菌株5-8的生長(zhǎng)與抑菌活性的影響。

2 結(jié)果與討論

2.1 抗菌活性菌株篩選結(jié)果

以金黃色葡萄球菌為指示菌，采用平板擴(kuò)散法，對(duì)467株紅樹(shù)林菌株發(fā)酵液進(jìn)行了抑菌活性研究，經(jīng)多次篩選、分離純化和活性驗(yàn)證，篩選到了12株抗菌活性菌株，總抗菌活性菌株陽(yáng)性率約為2.6%，其結(jié)果由表1所示。由表1可知，菌株5-8對(duì)金黃色葡萄球菌具有明顯的抑菌活性，該菌具有廣闊的開(kāi)發(fā)前景。

表1 12種活性菌株的抗菌效果

2.2 菌株5-8抗菌活性研究

菌株5-8發(fā)酵上清液對(duì)幾種常見(jiàn)真菌和細(xì)菌的抑制作用,如表2所示,對(duì)金黃色葡萄球菌、尖刀鐮孢菌、辣椒疫霉菌、大麗輪枝菌、瓜亡革菌、大腸桿菌均有較強(qiáng)的抑制作用。

表2 菌株5-8發(fā)酵上清液對(duì)常見(jiàn)真菌和細(xì)菌的抑菌范圍

如圖1所示，菌株5-8的抑菌圈直徑明顯大于慶大霉素(100 mg/L)、氨芐青霉素(100 mg/L)的抑菌圈直徑，因此菌株5-8的抑菌活性強(qiáng)度大于慶大霉素、氨芐青霉素的抑菌活性強(qiáng)度，由此可得，菌株5-8的抑菌活性比較大，具有很好的研究前景。

注：“5-8”為菌株5-8；“對(duì)照”為培養(yǎng)液圖1 抗菌效果Fig.1 Antibacteria effect

2.3 活性菌株的分子鑒定與系統(tǒng)發(fā)育分析

利用細(xì)菌16S rDNA通用引物對(duì)菌株5-8細(xì)菌基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，獲得了長(zhǎng)度約為1.4 kb的16S rDNA序列，經(jīng)比對(duì)分析后將其提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得注冊(cè)號(hào)為JX867759(表3)。本研究中篩選的活性菌株與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已有菌株Erwiniapiriflorinigrans的16S rRNA序列存在著很高的相似性，相似性在98%以上。

表3 抗菌活性物質(zhì)產(chǎn)生菌株的分子鑒定

將菌株5-8的16S rDNA基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中相似性較高的菌株Erwiniapiriflorinigrans的16S rDNA序列進(jìn)行比對(duì)，利用MEGA5.0軟件進(jìn)行了分析并構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，如圖2所示。結(jié)果表明，篩選出的紅樹(shù)林活性菌株5-8為細(xì)菌域(Bacteria)的變型菌門(Proteobacteria)變形菌綱(Gammaproteobacteria)的歐文氏菌屬(Erwinia)。

圖2 抗菌活性菌株 Erwinia sp.5-8的16S rRNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of Erwinia sp.5-8 based on partial 16S rRNA gene sequences

2.4 培養(yǎng)條件對(duì)Erwiniasp.5-8生長(zhǎng)及抑菌活性影響的測(cè)定

2.4.1 最佳氮源篩選

不同氮源對(duì)Erwiniasp.5-8的生長(zhǎng)及發(fā)酵液抑菌活性的影響如圖3所示。結(jié)果表明，菌株Erwiniasp.5-8均能利用所試驗(yàn)的有機(jī)氮源和無(wú)機(jī)氮源生長(zhǎng)并產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)。與對(duì)照氮源(蛋白胨)相比，所選其他氮源菌株生長(zhǎng)量均明顯降低。以蛋白胨為氮源時(shí)，發(fā)酵液的抗菌活性最強(qiáng)，豆餅次之，其余氮源抗菌活性大小依次為牛肉膏>酵母粉>氯化銨>硝酸鉀>硝酸銨>硫酸銨，因此確定蛋白胨為最佳氮源。

圖3 氮源對(duì)Erwinia sp.5-8生長(zhǎng)及抗菌活性的影響Fig.3 Effect of nitrogen sources on the growth and antimicrobial activity of Erwinia sp.5-8

2.4.2 最佳碳源篩選

不同碳源對(duì)Erwiniasp.5-8的生長(zhǎng)及發(fā)酵液抗菌活性的影響如圖4所示。結(jié)果表明，菌株Erwiniasp.5-8對(duì)單糖、雙糖、多糖均能較好地利用并產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)。以葡萄糖為碳源時(shí)，抗菌活性最強(qiáng)，其后抗菌活性大小依次為可溶性淀粉>半乳糖>木糖>蔗糖>乳糖>果糖>半乳糖。

圖4 碳源對(duì)Erwinia sp.5-8生長(zhǎng)及抗菌活性的影響Fig.4 Effect of carbohydrates on the growth and antimicrobial activity of Erwinia sp.5-8

2.4.3 培養(yǎng)溫度對(duì)Erwiniasp.5-8及抑菌活性影響

培養(yǎng)溫度對(duì)Erwiniasp.5-8生長(zhǎng)及抑菌活性的影響如圖5所示。結(jié)果表明，Erwiniasp.5-8在15～40 ℃均能生長(zhǎng)并產(chǎn)活性物質(zhì)。在溫度為15 ℃的條件下,菌體生長(zhǎng)極其緩慢;但能產(chǎn)生微量抑菌物質(zhì)；在25 ℃時(shí),菌株抑菌活性達(dá)到最高。

圖5 不同培養(yǎng)溫度對(duì)Erwinia sp.5-8生長(zhǎng)及抑菌活性的影響Fig.5 Effect of culture temperature on the growth and antimicrobial activity of Erwinia sp.5-8

2.4.4 鹽度對(duì)Erwiniasp.5-8生長(zhǎng)及抑菌活性影響

在25 ℃培養(yǎng)溫度下,不同鹽度對(duì)Erwiniasp.5-8生長(zhǎng)及抑菌活性影響如圖6所示。結(jié)果表明,Erwiniasp.5-8在鹽度為0～9下均能生長(zhǎng)并產(chǎn)活性物質(zhì)；在鹽度為0～3時(shí)，Erwiniasp.5-8生長(zhǎng)和產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)相差不大,但隨著鹽度的繼續(xù)增加菌體生長(zhǎng)量和抑菌活性均呈下降趨勢(shì)。

圖6 不同鹽度對(duì)Erwinia sp.5-8生長(zhǎng)及抑菌活性的影響Fig.6 Effect of salinity on the growth and antimicrobial activity of Erwinia sp.5-8

2.4.5 初始pH值對(duì)Erwiniasp.5-8生長(zhǎng)及抑菌活性影響

25 ℃和無(wú)鹽培養(yǎng)條件下,不同初始pH值對(duì)Erwiniasp.5-8生長(zhǎng)及抑菌活性的影響如圖 7所示。結(jié)果表明,Erwiniasp.5-8在初始pH值為5.0～11.0時(shí)均能生長(zhǎng)并產(chǎn)生活性物質(zhì)；在pH=4.0時(shí)菌體幾乎不能生長(zhǎng)；pH=5.0時(shí)生物量達(dá)最大值；pH=8.0時(shí),抑菌活性達(dá)最大值。由此可見(jiàn)，pH=4.0的偏酸環(huán)境下不適于菌體生長(zhǎng)及抑菌物質(zhì)的產(chǎn)生,pH=11.0的偏堿環(huán)境下菌體生長(zhǎng)緩慢,抑菌活性也較小。

圖7 初始pH值對(duì)Erwinia sp.5-8生長(zhǎng)及抑菌活性的影響Fig.7 Effect of initial pH on the growth and antimicrobial activity of Erwinia sp.5-8

2.4.6 裝液量對(duì)Erwiniasp.5-8生長(zhǎng)及抑菌活性影響

不同裝液量對(duì)菌株Erwiniasp.5-8的生長(zhǎng)和發(fā)酵液抗菌活性的影響如圖8所示。結(jié)果表明，當(dāng)100 mL三角瓶裝液量為30 mL、即裝液量為30%時(shí)，發(fā)酵液的抗菌活性最大，菌株的生長(zhǎng)量也最大。當(dāng)裝液量大于30 mL時(shí)，隨著裝液量的增加，發(fā)酵過(guò)程中溶解氧減少，不利于菌株的生長(zhǎng)，從而影響了抗菌活性物質(zhì)的產(chǎn)生。

圖8 裝液量對(duì)Erwinia sp.5-8生長(zhǎng)及抗菌活性的影響Fig.8 Effect of liquid filling quantity on the growth and antimicrobial activity of Erwinia

2.4.7 接種量對(duì)Erwiniasp.5-8生長(zhǎng)與抑菌活性的影響

不同接種量對(duì)菌株Erwiniasp.5-8的生長(zhǎng)和發(fā)酵液抗菌活性的影響如圖9所示。結(jié)果表明，當(dāng)接種量小于1%時(shí)(V種子液/V培養(yǎng)液)，菌株Erwiniasp.5-8的生長(zhǎng)量和發(fā)酵液抗菌活性隨著接種量的增加而增大；當(dāng)接種量大于1%時(shí)，抗菌活性和菌株生長(zhǎng)量都隨著接種量的增加呈逐漸下降的趨勢(shì)；接種量為1%時(shí)，菌株的生長(zhǎng)量和發(fā)酵液的抗菌活性最大，因此，最佳接種量為1%。

圖9 接種量對(duì)Erwinia sp.5-8生長(zhǎng)及抗菌活性的影響Fig.9 Effect of inoculation amount on the growth and antimicrobial activity of Erwinia

3 討 論

紅樹(shù)林獨(dú)特的地理及氣候特征,賦予了紅樹(shù)林微生物獨(dú)特的分子生物學(xué)機(jī)制與生理生化特性,為從微生物中尋找新的活性物質(zhì)提供了廣闊的前景。目前,紅樹(shù)林微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物的研究和開(kāi)發(fā)仍處于起步階段,大多集中在紅樹(shù)植物葉片的內(nèi)生真菌[14-16]和放線菌[17-19]，對(duì)土壤中細(xì)菌的報(bào)道還很少。隨著國(guó)內(nèi)、外研究的深入,從紅樹(shù)林微生物中獲得結(jié)構(gòu)新穎、功能獨(dú)特的生物活性物質(zhì)和開(kāi)發(fā)次級(jí)代謝產(chǎn)物有待系統(tǒng)地研究。本研究以金黃色葡萄球菌為指示菌，對(duì)分離自廣西欽州灣紅樹(shù)林采集的根系泥中的476株菌株進(jìn)行活性初篩，得到12株具有抗菌活性的菌株，其中Erwiniasp.5-8抑菌作用明顯，具有開(kāi)發(fā)抗菌藥物的潛力。

不同微生物由于遺傳特性的不同以及環(huán)境條件的變化，最佳發(fā)酵條件也會(huì)有所不同，本研究利用單因素試驗(yàn)方法對(duì)Erwiniasp.5-8的發(fā)酵條件進(jìn)行了初步研究，結(jié)果表明Erwiniasp.5-8產(chǎn)活性代謝產(chǎn)物的最佳培養(yǎng)條件為：最佳氮源為蛋白胨，最佳碳源為葡萄糖，最適發(fā)酵溫度為25 ℃，初始發(fā)酵pH值為8.0，最佳鹽度為1.5，最佳接種量1%,最佳裝液量30%。Erwiniasp.5-8具有較廣的適應(yīng)范圍，在20～40 ℃,鹽度0～9，初始pH值在5.0～11.0范圍內(nèi)，均能生長(zhǎng)并產(chǎn)抑菌物質(zhì)。在鹽度為0～4.5時(shí)，隨著鹽度的變化菌體生長(zhǎng)量及抑菌活性均無(wú)明顯變化，但是隨著鹽度的升高，菌體生長(zhǎng)量與抑菌活性均逐漸降低，這可能是培養(yǎng)基滲透壓的逐漸升高影響到菌體的內(nèi)部滲透壓的平衡，從而影響菌體的正常生長(zhǎng)。低鹽需求也可使發(fā)酵設(shè)備免受侵蝕，有利于中試生產(chǎn)。該菌具有很好的研究前景，其活性物質(zhì)的分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定將有待于進(jìn)一步研究，以期為該菌的開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)，為新型抗菌藥物的開(kāi)發(fā)提供資源支持。

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Received: June 13, 2014

Screening the Antimicrobial Bacterium Strain ofErwiniasp.5-8 From Guangxi Mangrove and Optimazing its Fermentation Conditions

MENG Ling-yang1,2, JIANG Wei2,3, ZHANG Pei-yu1, LIN Xue-zheng2,3

(1.EnvironmentalScienceandEngineering,QingdaoUniversity，Qingdao 266071,China;2.TheFirstInstituteofOceanography,SOA, Qingdao 266061,China;3.KeyLaboratoryofMarineBioactiveSubstances,SOA, Qingdao 266061,China)

In this study,an antimicrobial bacterium strain, named 5-8, was screened and isolated from mangrove of Guang Xi by the method of agar diffusion usingStaphylococcusaureuas the indicator strain. The results of molecular identification and phylogenetic analysis showed that this strain belonged to genera ofErwinia. The single factor experiments on the fermentation conditions were conducted and the optimized parameters were as follows：the best nitrogen source is peptone, the best carbon source is glucose ,the starting pH of medium was 8.0,fermentation temperature was 25℃,salinity was 1.5%,liquid volume in erlenmeyer flask was 30% and inoculation amount was 1%(Vseed liquid/Vnutrient solutio=1∶100)．

mangrove;Erwinia; antimicrobial activity; phylogenetic analysis；optimization of fermentation conditions

2014-06-13 資助項(xiàng)目：海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目——海洋微生物小分子化合物資源庫(kù)構(gòu)建及藥源活性物質(zhì)的篩選應(yīng)用(201005022-6) 作者簡(jiǎn)介：孟令洋(1990-)，男，山東泰安人，碩士研究生，主要從事海洋微生物方面研究.E-mail: menglingyang1990@163.com

(王佳實(shí) 編輯)

Q939.9

A

1671-6647(2015)02-0270-09

*通訊作者：姜 偉(1976-)，女，山東平度人，副研究員，博士，主要從事海洋生物方面研究.E-mail：jiangwei@fio.org.cn