朱鵬飛，李 壹,2，王宗靈，曲凌云*

(1.國家海洋局 第一海洋研究所，山東 青島 266061；2.中國海洋大學(xué) 海洋生命學(xué)院，山東 青島 266003)

基于四種水產(chǎn)病原弧菌的簡型芯片檢測體系的優(yōu)化

朱鵬飛1，李 壹1,2，王宗靈1，曲凌云1*

(1.國家海洋局 第一海洋研究所，山東 青島 266061；2.中國海洋大學(xué) 海洋生命學(xué)院，山東 青島 266003)

基因芯片技術(shù)在病原菌檢測領(lǐng)域展現(xiàn)出良好的前景，本文依托水產(chǎn)病原菌基因檢測芯片的檢測體系，以水產(chǎn)常見病原弧菌的hsp60、toxR基因檢測探針為研究對象，系統(tǒng)研究不同點樣液配方、寡核苷酸探針濃度、熒光標(biāo)記物質(zhì)濃度、雜交溫度、雜交時長對芯片雜交效果的影響，并進行相應(yīng)優(yōu)化。結(jié)果表明，雜交溫度為60 ℃、雜交時長為 2 h、探針濃度為1 μmol/L、Cy3標(biāo)記的隨機引物的用量為150 pmol時，芯片的經(jīng)濟性、靈敏度、檢測效率達(dá)到均衡；以0.1 mol/L 磷酸氫二鈉和25% 二甲基亞砜混合溶液作為點樣液，效果較好。優(yōu)化后的芯片對4種弧菌的檢測沒有出現(xiàn)交叉雜交現(xiàn)象，探針特異性達(dá)到100%；對溶藻弧菌全基因組DNA檢測靈敏度為10 fg，高出PCR方法約2個數(shù)量級。

弧菌；基因芯片；點樣液；優(yōu)化

基因芯片(DNA microarray)檢測技術(shù)自20世紀(jì)80年代開創(chuàng)以來以其靈敏度高、檢測周期短、自動化水平高、可擴展性強的特點被廣泛應(yīng)用于多個領(lǐng)域。在水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)和食品微生物檢測領(lǐng)域，由于微生物檢測種類復(fù)雜多樣，故利用基因芯片技術(shù)進行微生物檢測的研究也越來越多。2004年，Panicker等[1]構(gòu)建了可同時檢測扇貝中的霍亂弧菌、副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌的基因芯片；2012年，Shi等[2]根據(jù)16S rRNA基因和gyrB基因構(gòu)建了8種水產(chǎn)病原菌的種特異基因的檢測芯片。然而，由于基因芯片的一些技術(shù)特點導(dǎo)致基因芯片目前仍停留在實驗室研究階段，要達(dá)到應(yīng)用的目標(biāo)仍有很多問題需要解決[3]:首先，基因芯片檢測需要專門的點制、掃描設(shè)備，且需要經(jīng)過修飾的探針和熒光標(biāo)記物質(zhì)，這使得整個檢測流程步驟復(fù)雜，經(jīng)濟性、簡捷性成為制約其實際運用的一大瓶頸；其次，探針和目的基因片段的雜交動力學(xué)過程復(fù)雜，雜交效果受探針的長度和結(jié)構(gòu)、雜交空間位阻、雜交溫度和時長等條件的影響[4]，且由于點制在同一芯片上的不同探針的退火溫度(Tm)、探針長度等參數(shù)彼此不同，因此需要根據(jù)芯片類型和探針特點摸索最佳的雜交條件；再次，水產(chǎn)環(huán)境中的病原微生物尤其是弧菌屬各菌種的進化關(guān)系緊密，16S rRNA基因、23S rRNA基因及其中間序列的序列相似度極高，僅依靠其作為探針容易出現(xiàn)假陽性結(jié)果[5]。

本研究初步構(gòu)建了以4種弧菌的種特異性基因和毒力相關(guān)基因為檢測對象的基因芯片檢測體系。利用此體系來檢驗雜交溫度、雜交時長、探針濃度及熒光標(biāo)記物質(zhì)濃度對芯片雜交效果的影響，為芯片的經(jīng)濟性、便捷性優(yōu)化提供理論支持。同時，對芯片的點樣液配方進行了比較及優(yōu)化，為提高基因芯片的實際運用性能提供數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌株來源和全基因組DNA提取

本研究使用的菌株保存于國家海洋局第一海洋研究所免疫與疾控實驗室的近海微生物資源庫。其中創(chuàng)傷弧菌VibriovulnificusVIB310、擬態(tài)弧菌V.minmicusVIB298由中國海洋大學(xué)張曉華教授饋贈，鰻弧菌V.anguillarumMVM425由華東理工大學(xué)張元興教授饋贈，溶藻弧菌V.anlginolyticusCGMCC1.1607、哈維弧菌V.harveyiCGMCC1.1601、副溶血弧菌CGMCC1.1997購自中國普通微生物菌種保藏管理中心。

采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(Omega)提取細(xì)菌全基因組DNA，并用分光光度計測定提取的DNA濃度，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 引物和探針的設(shè)計

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中多種弧菌的熱休克蛋白編碼基因hsp60的基因序列，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計針對弧菌hsp60基因的簡并引物，引物序列見表1。使用ClustalX 2.0和MEGA 5.0軟件對多種弧菌的hsp60基因、跨膜轉(zhuǎn)運蛋白編碼基因toxR的基因序列進行序列比對分析，選擇弧菌種間的特異區(qū)段，使用AlleleID 7.0軟件設(shè)計探針，探針要求選自序列的高可變區(qū)、長度約為30～50個脫氧核糖核苷酸堿基(nt)、解鏈溫度(Tm)約60 ℃、GC含量為40%～60%，另在5′端使用氨基修飾。使用NCBI的在線BLAST工具檢測所設(shè)計探針的特異性，以避免非特異性雜交。引物和探針均交由上海生工生物工程股份有限公司合成。

表1 實驗中用到的引物序列

1.3 多重PCR擴增和標(biāo)記

以溶藻弧菌、副溶血弧菌、哈維氏弧菌、創(chuàng)傷弧菌的全基因組DNA為模板，擴增hsp60、toxR基因片段。多重PCR擴增體系為：10×PCR reaction buffer 2.5 μL，25 mmol/L MgCl22 μL，2.5 mmol/L dNTP 4 μL，TaqDNA聚合酶 2 U，待檢樣品全基因組DNA 100 ng，VIB-hsp60正反向引物均8 pmol，其余正反向引物均各10 pmol，雙蒸水補足25 μL。PCR反應(yīng)的條件為：94 ℃ 7 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，以上3個步驟循環(huán)35次；72 ℃ 7 min，4 ℃保存。

構(gòu)建熒光標(biāo)記PCR體系：PCR產(chǎn)物5 μL， 100 μmol/L Cy3標(biāo)記的隨機引物1.5 μL，雙蒸水補足19 μL，上述混合物經(jīng)95 ℃變性3 min，置于冰上冷激3 min；加入Klenow酶 1 μL，10×Klenow buffer 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTP mixture 2.5 μL。PCR標(biāo)記反應(yīng)的條件為：37 ℃ 90 min，72 ℃ 10 min。-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 基因芯片的制備

使用1×TE緩沖液將合成的探針濃度稀釋至10 μmol/L，與點樣液(晶芯，上海博奧)等比例混合。使用芯片點制儀(Nanoplotter 1.0，GeSiM)、Nano級點樣針點制探針于醛基芯片(百奧)上，點制參數(shù)為每張芯片4個陣列，每個陣列包括4×7共28個點，點制6種檢測探針，1種陽性質(zhì)控探針，每種探針重復(fù)點樣3次，點間距為1 mm，點樣陣列見圖1。

點制之后的芯片放置于37 ℃濕盒內(nèi)，水合雜交12 h，使用0.2% SDS清洗，0.2% NaBH4封閉，清洗甩干。

注：PC為陽性質(zhì)控探針；va-hsp60,vp-hsp60,vv-hsp60分別為溶藻弧菌、副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌的hsp60基因檢測探針；va-toxR,vp-toxR,vh-toxR分別為溶藻弧菌、副溶血弧菌、哈維氏弧菌的toxR基因檢測探針圖1 基因芯片點樣陣列Fig.1 Spotting array of DNA microarray

1.5 不同芯片點樣液的效果探究

以溶藻弧菌的va-hsp60探針(5 μmol/L)為實驗對象，分別使用24種不同的點樣液配方(表2)與之混合點制芯片，檢測菌液濃度為4×107CFU/mL的溶藻弧菌。根據(jù)雜交熒光信號強度、雜交點的完整度、有無漂散等條件篩選出較優(yōu)的點樣液配方。

對初次試驗效果較好的配方進行更優(yōu)濃度配比篩選，設(shè)置13種不同濃度梯度的配方(表2)，仍按照上述檢測流程進行雜交實驗，篩選較優(yōu)配方。

表2 本實驗設(shè)計的點樣液配方

注：配方1～24為初次點樣液實驗配方；配方25～37為進一步優(yōu)化的點樣液實驗配方

1.6 芯片的雜交及檢測

在芯片探針區(qū)加入預(yù)雜交混合液(V預(yù)雜交液∶V100 μg/mL變性鮭精DNA=1∶10)，加樣量10 μL/cm2，60 ℃濕盒中預(yù)雜交1 h，離心甩干。配制雜交混合液：將雜交液與熒光標(biāo)記產(chǎn)物按V雜交液∶V熒光標(biāo)記產(chǎn)物=1∶1比例混合，加入10 μmol/L陽性質(zhì)控1 μL，95 ℃變性3 min，置于冰上冷激3 min。在基因芯片的點樣區(qū)加入雜交混合液，置于60 ℃濕盒中雜交2 h。使用洗液Ⅰ(1×SSC、0.2% SDS)、Ⅱ(0.2×SSC)、Ⅲ(0.1×SSC)各清洗15 min，離心甩干。使用GenePix Pro 4000B微陣列掃描儀進行掃描，掃描波長為532 nm，飽和熒光信號值為65 535。使用GenePix Pro 6.0軟件對掃描圖像進行分析，檢測陣列中各點的熒光信號強度和信噪比(Signal Noise Rate, SNR)。

1.7 芯片雜交條件探究

由于1.2節(jié)中所設(shè)計的多條探針的解鏈溫度不同，但是需要在相同雜交溫度下雜交，因此需要設(shè)置梯度雜交溫度來確定最優(yōu)的雜交溫度。分別設(shè)置42，50，55，60，65，70 ℃的雜交溫度梯度，基因芯片點樣陣列如圖2所示，其他雜交條件與1.6節(jié)所述保持一致，進行芯片雜交檢測熒光信號值，以確定同一芯片上不同探針的最優(yōu)雜交溫度。

分別設(shè)置0.5，1，2，4 h的雜交時長梯度，使用1.4節(jié)中構(gòu)建的基因芯片分別檢測創(chuàng)傷弧菌的hsp60基因、溶藻弧菌的hsp60基因、哈維氏弧菌的toxR基因。其他雜交條件與1.6節(jié)所述保持一致，進行芯片雜交檢測熒光信號值，確定最優(yōu)雜交時長。

注：空白處無探針;PC為陽性質(zhì)控探針；va-hsp60為溶藻弧菌hsp60基因探針；vp-toxR為溶藻弧菌toxR基因探針；vp-hsp60為副溶血弧菌hsp60基因探針；vp-toxR為副溶血弧菌toxR基因探針；vh-toxR為哈維弧菌toxR基因探針；vv-hsp60為創(chuàng)傷弧菌hsp60基因探針圖2 不同雜交溫度實驗所用基因芯片F(xiàn)ig.2 Spotting array of DNA microarray for hybridization duration

1.8 芯片經(jīng)濟性優(yōu)化

以溶藻弧菌的hsp60基因為實驗對象，使用DNA質(zhì)量濃度分別為0.15,1.5,15,150 ng/μL的PCR產(chǎn)物與37.5,75,150,300 pmol的cy3標(biāo)記的隨機引物進行1.3節(jié)中的熒光標(biāo)記PCR反應(yīng)。對標(biāo)記產(chǎn)物分別使用濃度為0.062 5,0.125,0.25,0.5,1,2,4,8 μmol/L的va-hsp60探針進行雜交檢測，根據(jù)熒光信號強度與PCR產(chǎn)物濃度、cy3標(biāo)記的隨機引物濃度及va-hsp60探針濃度之間的變化關(guān)系，在保證熒光信號可檢出、對芯片靈敏度影響不大的前提下，選擇較為經(jīng)濟的試劑用量。

1.9 優(yōu)化后的芯片特異性和靈敏性檢測

使用經(jīng)過優(yōu)化后的基因芯片檢測流程對1.3節(jié)中不同弧菌的hsp60、toxR基因擴增片段的熒光標(biāo)記產(chǎn)物分別進行雜交檢測，用于評價芯片的特異性。

對1.1節(jié)中提取的溶藻弧菌CGMCC 1.1607全基因組DNA按照10倍梯度稀釋至100 ag/μL，并進行PCR擴增，同時按照上述雜交步驟對不同稀釋度組使用芯片進行檢測。

1.10 統(tǒng)計分析

采用SPSS 20統(tǒng)計軟件，對實驗結(jié)果進行顯著性差異分析，顯著性水平等于5%。

2 結(jié) 果

2.1 不同點樣液的雜交效果

初次試驗了24種點樣液對探針、熒光信號的影響(圖3)。當(dāng)探針濃度為5 μmol/L時，配方8，9，11，12，16，17的熒光信號較強。結(jié)合探針點的完整度、探針點直徑、雜交信號強度、有無漂散情況，優(yōu)選出二甲基亞砜(DMSO)和Na2HPO4的混合液濃度梯度配方進行進一步的探究。設(shè)置13組DMSO溶液與Na2HPO4溶液的混合液濃度梯度配方，配制點樣液進行雜交檢測。如圖4所示，0.1 mol/L Na2HPO4和25% DMSO混合時va-hsp60探針的雜交信號強度更高。

(a)不同點樣液點樣陣列和掃描圖像

(b)不同點樣液的雜交信號信噪比圖3 不同點樣液對va-hsp60雜交結(jié)果的影響Fig.3 Results of hybridization on DNA microarray assay for different spotting solutions mixed with probe va-hsp60

圖4 不同濃度梯度的DMSO與Na2HPO4混合液的雜交結(jié)果Fig.4 Results of hybridization on DNA microarray with a mixed spotting solution of DMSO and Na2HPO4

2.2 雜交時長對芯片檢測的影響

不同雜交時長對溶藻弧菌hsp60基因的芯片檢測效果的影響如圖5所示，當(dāng)雜交時長小于2 h時，檢測到的熒光強度值隨雜交時長的增加而增加；當(dāng)雜交時長大于2 h時，芯片的熒光強度呈現(xiàn)降低趨勢；雜交時長為2 h時，芯片的熒光強度最高。由此可知，雜交時間越長，探針?biāo)Y(jié)合的熒光標(biāo)記產(chǎn)物越多，檢測到的熒光信號強度越高，更容易檢測出微量的目的基因。但當(dāng)雜交時長超過一定限度(在本文中為2 h)時，熒光染料會受到光漂白、氧化等外部條件的影響造成檢測出的熒光信號強度下降。綜合考量，選擇2 h作為較優(yōu)雜交時長。

注：1～4分別代表雜交時長為0.5,1,2,4 h 圖5 不同雜交時長條件下va-hsp60探針雜交信號的熒光信號強度Fig.5 Fluorescence intensities of probe va-hsp60 hybridized for different periods of time

2.3 雜交溫度對芯片檢測的影響

不同雜交溫度對不同探針雜交效果的影響如圖6所示，4種探針的熒光信號強度隨雜交溫度的升高均呈現(xiàn)降低的趨勢。不同雜交溫度下，基因芯片檢測創(chuàng)傷弧菌hsp60基因的掃描結(jié)果如圖7所示(另兩種結(jié)果類似故未列)，當(dāng)雜交溫度為42 ℃時，最左一列的va-hsp60，vp-hsp60探針出現(xiàn)非特異性信號，但隨著雜交溫度升高，該非特異信號逐漸減弱至消失；而作為檢測目標(biāo)的vv-hsp60探針的雜交信號在42 ℃時接近飽和，隨雜交溫度升高而逐漸降低，綜合目標(biāo)探針和非特異探針的雜交情況，選擇60 ℃作為最適雜交溫度。

圖6 不同雜交溫度條件下va-hsp60，vh-toxR，vv-hsp60三種探針雜交熒光信號強度Fig.6 Fluorescence intensities of va-hsp60, vh-toxR and vv-hsp60 hybridized at different temperatures

圖7 不同雜交溫度條件下基因芯片的雜交情況Fig.7 Results of probe vv-hsp60 hybridized in different temperatures

2.4 芯片經(jīng)濟性優(yōu)化

以溶藻弧菌的hsp60基因為實驗對象，對探針、PCR產(chǎn)物、Cy3標(biāo)記的隨機引物設(shè)置濃度梯度分別進行芯片檢測，以探究雜交信號強度同以上三者之間的關(guān)系(圖8)。當(dāng)探針濃度為4 μmol/L時，芯片最低可以檢測濃度介于0.15～1.5 ng/μL之間PCR產(chǎn)物；當(dāng)PCR產(chǎn)物濃度較高時(大于15 ng/μL)，使用300 pmol和150 pmol的Cy3標(biāo)記的隨機引物均可使雜交信號飽和；當(dāng)PCR產(chǎn)物濃度較低時(1.5 ng/μL)，使用150 pmol的Cy3標(biāo)記的隨機引物熒光信號強度仍在20 000左右，足以滿足檢測需求。因此，選擇150 pmol作為Cy3標(biāo)記的隨機引物的實驗標(biāo)準(zhǔn)用量。

如圖9所示，當(dāng)Cy3標(biāo)記的隨機引物濃度為150 pmol時，芯片的熒光強度信號隨探針濃度的降低呈現(xiàn)非線性的降低趨勢。當(dāng)探針濃度在0.25～8 μmol/L的范圍內(nèi)時，除15 ng/μL濃度組外，其他濃度組芯片的信號強度變化均不大，而且當(dāng)PCR產(chǎn)物質(zhì)量濃度為15 ng/μL 時，探針濃度為1 μmol/L時，信號強度仍為35 000左右，可以滿足檢測需求。因此選擇1 μmol/L作為探針的實驗標(biāo)準(zhǔn)濃度。

圖8 探針濃度為4 μmol/L時，不同濃度的PCR產(chǎn)物與Cy3標(biāo)記的隨機引物的標(biāo)記產(chǎn)物的熒光信號強度Fig.8 Fluorescence intensity of labeled products of different concentrations PCR products with Cy3-random primer when the concentration of probe was 4 μmol/L

注：1～8分別代表探針濃度為8，4，2，1，0.5,0.25,0.125,0.0625 μmol/L；9代表空白圖9 Cy3標(biāo)記的隨機引物為150 pmol時，不同濃度的模板DNA與探針的雜交熒光信號強度Fig.9 Fluorescence intensity of different concentrations of template DNA hybridized with probe when the Cy3-random primer was 150 pmol

2.5 優(yōu)化后的芯片特異性檢驗

以副溶血弧菌、溶藻弧菌、哈維弧菌、創(chuàng)傷弧菌、鰻弧菌(未列)、擬態(tài)弧菌(未列)的hsp60基因、toxR基因擴增片段的熒光標(biāo)記產(chǎn)物與芯片各個陣列分別進行雜交。如圖10所示，所設(shè)計的探針的特異性良好，只與目的菌種的基因結(jié)合，未與近似弧菌的基因發(fā)生非特異性雜交。

2.6 優(yōu)化后的芯片靈敏度檢測

對溶藻弧菌的全基因組DNA進行梯度稀釋，進行PCR擴增、電泳檢測，并按照上述芯片檢測流程對不同的稀釋組進行檢測。結(jié)果顯示，PCR擴增并通過瓊脂糖凝膠的檢測方法的檢出限約為1 pg全基因組DNA(圖11)，而芯片可以檢測出低至10 fg的全基因組DNA(圖12)。對10 fg全基因組DNA的雜交熒光強度與陰性對照組進行差異顯著性分析，得出10 fg全基因組DNA的雜交熒光強度與對照組之間的差異顯著(P<0.05)。

注：泳道M為DSTM 2000 DNA Marker；泳道1～8分別為1 ng，100 pg，10 pg，1 pg，100 fg，10 fg，1 fg，100 ag溶藻弧菌全基因組DNA；泳道9為陰性對照。圖11 梯度濃度溶藻弧菌的全基因組DNA PCR檢測結(jié)果Fig.11 Sensitivity of PCR assay in detecting whole genome DNA of V. alginolyticus

注：1～8分別代表模板濃度為1 ng, 100 pg, 10 pg, 1 pg, 100 fg, 10 fg, 1 fg, 100 ag;9為空白圖12 梯度濃度溶藻弧菌的全基因組DNA基因芯片檢測結(jié)果Fig.12 Sensitivity of DNA microarray assay in detecting whole genome DNA of V. alginolyticus

3 討 論

水產(chǎn)養(yǎng)殖動物自身的微生物種群結(jié)構(gòu)復(fù)雜，其和養(yǎng)殖環(huán)境中的菌種共同作用影響?zhàn)B殖動物健康狀態(tài)，此外水產(chǎn)環(huán)境還存在多種菌種共感染的現(xiàn)象，因此需要檢測通量高、檢測效率高的檢測方法提前預(yù)警、快速診斷[2,13]。目前，傳統(tǒng)的生理生化鑒定方法較為可靠，但過程繁瑣、費時費力，難以檢測處于“活的不可培養(yǎng)狀態(tài)”(VBNC)的細(xì)菌[14]。PCR技術(shù)檢測手段多樣，但其檢測靈敏度往往受限于瓊脂糖凝膠的靈敏度[15]，且檢測大量、復(fù)雜樣本的能力有限。針對特定病原菌表面抗原的免疫檢測技術(shù)特異性高、便攜性好，但也存在檢測菌種單一的問題[16]。

基因芯片技術(shù)是基于堿基互補配對原則，通過固定于固相載體的核苷酸序列識別結(jié)合特定基因序列。從最早的使用放射性同位素標(biāo)記的大型芯片(如Southern blotting)到平面芯片(如硅質(zhì)玻片)，再到三維芯片(如懸浮微珠芯片)，其自動化水平、檢測效率和靈敏度已經(jīng)取得巨大的進步[17]。其中點陣打印平面芯片的打印密度已可以達(dá)到每張芯片30 000個點甚至更多，如此巨大的檢測通量潛力對于檢測復(fù)雜樣本中多樣化的DNA優(yōu)勢明顯[18]。

基因芯片檢測技術(shù)的能力在實驗室條件下已經(jīng)得到驗證，但制約其推廣應(yīng)用的因素之一就是經(jīng)濟性不佳?；蛐酒械狞c樣液、經(jīng)過修飾的探針和熒光標(biāo)記物是要長期大量使用的耗費品，成本較高。本文研究了檢測芯片的熒光信號強度同探針濃度、熒光標(biāo)記物濃度、模板DNA濃度三者之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在一定范圍內(nèi)，芯片的熒光信號強度同三者均大致呈線性關(guān)系，這和Breslauer等[19]、Santalucia[ 20]構(gòu)建的雜交動力學(xué)模型預(yù)測的結(jié)果一致，這就為合理降低探針、熒光標(biāo)記物的使用量提供了理論基礎(chǔ)。在不至于影響靈敏度的前提下，熒光標(biāo)記物的建議使用量為150 pmol，探針的建議濃度(1 μmol/L)較已有報道的最低探針濃度[21]減少了三分之一。

點樣液直接影響探針在芯片的固定率、探針承載量，進而影響芯片的檢測靈敏度和檢測通量。Dawson[21]曾將3～4 μmol/L的寡核苷酸探針溶于3×SSC進行點制芯片；DMSO在基因芯片的應(yīng)用范圍也很廣泛[22-23]。本文試驗了37種點樣液配方對雜交結(jié)果的影響，除已有報道的配方12，13，16，21等配方外，還設(shè)置了新配方和混合配方。經(jīng)過雜交檢測實驗，從中優(yōu)選出配方35(25% DMSO和0.1 mol/L Na2HPO4溶液的混合配方)作為點樣液配方，該配方相比于其他已報道配方，探針點徑更小(<1 μm)、點陣規(guī)則圓滑、無黏連，且探針在醛基芯片上結(jié)合率高，更小的點徑使得表面積有限的芯片可以承載更多探針，提升芯片的檢測通量。

探針是基因芯片檢測技術(shù)的關(guān)鍵。為避免假陽性和假陰性的結(jié)果，在設(shè)計探針時，所選擇的目的基因的序列片段要在分析現(xiàn)有細(xì)菌全基因組信息的基礎(chǔ)上合理選擇，要求既能區(qū)分種間差異，又能包含種內(nèi)堿基突變的情況。寡核苷酸探針的長度一般在25～80 nt之間選擇，長探針(>50 nt)的解鏈溫度更高，允許有一定的錯配情況存在，其能夠結(jié)合更多的、有堿基突變的目的基因序列，使得雜交的信號值和靈敏度更高，但相對特異性降低[17]；與之相反，短探針(<30 nt)檢測單核苷酸多態(tài)性(SNP)的能力強，特異性更高，可以檢測同一菌種的不同表型，但由于核苷酸鏈短，結(jié)合非特異性序列片段的能力易受雜交溫度等條件影響，加之存在空間位阻現(xiàn)象，使得總體檢測靈敏度受限[24-25]。Relógio等[4]通過對比認(rèn)為長度為30 nt的探針能夠維持較好的平衡?；谝陨显瓌t，本文針對6種病原性細(xì)菌的13種基因設(shè)計優(yōu)選出31種探針序列(另文發(fā)表)，探針序列長度多在35～55 nt之間，對于個別長度小于20 nt的探針，通過在探針5′端添加15個寡聚T(胸腺嘧啶脫氧核糖核苷酸)的連接體延伸探針長度、降低空間位阻，檢測結(jié)果顯示所設(shè)計的探針特異性均達(dá)到100%。

基于多重PCR擴增技術(shù)的基因芯片的檢測效果還受PCR的擴增效率、熒光標(biāo)記效率、探針和熒光標(biāo)記物的濃度、雜交條件等條件影響。在雜交過程中，探針和靶基因的結(jié)合會受雜交溫度、雜交時長的直接影響。雜交溫度較低時，探針可能和存在較大序列差異的非目的產(chǎn)物結(jié)合，產(chǎn)生交叉雜交信號；當(dāng)雜交溫度過高時，目的基因片段和探針的結(jié)合會減少，從而降低信號強度而影響靈敏度[4]。雜交時間的長短同樣影響目的基因片段和探針的結(jié)合。在本文中，雜交溫度為60 ℃時，非特異性信號基本消失，特異雜交信號強度適中(如vv-hsp60探針的熒光信號強度為8 504，信噪比為11.192)；雜交時間為2 h時，熒光強度最高。芯片檢測溶藻弧菌全基因組DNA的靈敏度約為10 fg，高出PCR檢測方法約2個數(shù)量級，和已報道的其他檢測芯片的最低靈敏度量級持平[15]。

16S rRNA基因因其進化的相對保守性，已廣泛地用于細(xì)菌的分類鑒定[26]，也經(jīng)常被用為基因芯片的檢測對象[2, 23, 27]。Urakawa等[5]分析了弧菌屬34種弧菌的16S rRNA基因序列，認(rèn)為34種弧菌的16S rRNA基因的相似度大于90%。高度的序列相似性導(dǎo)致難以尋找到足夠特異的探針，以至于有較高概率出現(xiàn)假陽性結(jié)果[25]。本文選擇編碼熱休克蛋白家族的hsp60基因作為探針，hsp60基因作為一種在細(xì)菌中廣泛存在的管家基因，其保守程度較16S rRNA基因低，依據(jù)其作為分子鑒定靶標(biāo)可更好地辨別進化關(guān)系較近的細(xì)菌[28]。而且隨著相關(guān)研究的深入，更多、更特異的毒力基因?qū)⒈患尤氲交驒z測的靶標(biāo)中來，使檢測結(jié)果更加有針對性[29]。

基因芯片技術(shù)以其快速、自動化、檢測通量較高、靈敏度高、擴展性強的特點已在微生物檢測領(lǐng)域展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景[24, 27, 30]。本文基于多重PCR技術(shù)，以初步構(gòu)建的基因芯片檢測平臺，進行一系列經(jīng)濟性優(yōu)化和流程改良，優(yōu)化后的基因芯片特異性、靈敏度良好，且經(jīng)濟性高。在已建立的芯片檢測平臺上可以逐步完善加入更多病原菌的毒力相關(guān)基因以及養(yǎng)殖環(huán)境微生物群落的特征基因，來快速、準(zhǔn)確檢測養(yǎng)殖環(huán)境、水產(chǎn)品中的細(xì)菌種類，這為食品病原菌快速診斷、水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境的疾病預(yù)防控制提供了一個可行的方向。

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Received: July 24, 2014

Optimization of DNA Microarray Detection System for Aquaculture Pathogenic Vibrios

ZHU Peng-fei1, LI Yi1, 2, WANG Zong-ling1, QU Ling-yun1

(1.TheFirstInstituteofOceanography,SOA, Qingdao 266061, China;2.CollegeofMarineLifeSciences,OceanUniversityofChina, Qingdao 266003, China)

DNA microarray has shown potential advantages in pathogen detection. In this study, spotting and hybridization protocols are optimized on an aquaculture pathogen detection DNA microarray, which targets the heat shock protein 60 encoded gene(hsp60) and toxin transcriptional activator encoded gene(toxR) of common pathogenic vibrios. Experimental variables including oligo probe concentration, Cy3 labelled random primer concentration, spotting buffer formula, hybridization temperature and duration were examined. As a result, optimized system contains the use of 1 μmol/L oligo probe in a mixed buffer of 0.1 mol/L Na2HPO4and 25% DMSO, 150 pmol Cy3 labelled random primer and 2 hours hybridization at 60 ℃. The specificity and detection limit of optimized DNA microarray is 100% and 10 fg of genome DNA ofVibrioalginolyticus, respectively. The results of this study indicate that the established detection system is cost-effective and efficient in the aquaculture pathogen detection.

vibrio; DNA microarray; spotting buffer; optimization

2014-07-24

國家海洋局海洋公益性行業(yè)科研專項——重要魚類增養(yǎng)區(qū)致病細(xì)菌基因芯片檢測技術(shù)研究開發(fā)與示范(201105007-1)；國家科技支撐計劃——海洋水產(chǎn)病毒實用化檢測及預(yù)警技術(shù)的建立與應(yīng)用(2012BAD17B01)

朱鵬飛(1989-)，男，河南永城人，碩士研究生，主要從事海水養(yǎng)殖動物病原微生物學(xué)研究.E-mail：zpf@fio.org.cn

*通訊作者：曲凌云(1975-)，女，山東榮成人，研究員，博士，主要從事海水養(yǎng)殖動物病原微生物學(xué)與海洋微生物學(xué)研究. E-mail: qly@fio.org.cn

(王佳實 編輯)

Q503; Q93-332; S917.1

A

1671-6647(2015)02-0257-13