陳圣毅，史 寶，柳學(xué)周*，徐永江，李曉曉，王珊珊，王妍妍

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 黃海水產(chǎn)研究所,山東 青島 266071；2.農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266071;3.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306)

條石鯛促性腺激素α亞基的克隆與表達(dá)特性分析

陳圣毅1,2,3，史 寶1,2，柳學(xué)周1,2*，徐永江1,2，李曉曉1,2,3，王珊珊1,2，王妍妍1,2

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 黃海水產(chǎn)研究所,山東 青島 266071；2.農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266071;3.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306)

采用同源性克隆和cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)方法，從條石鯛(Oplegnathidaefasciatus)垂體中獲得了全長(zhǎng)為897 bp的GtHα cDNA序列，其中包含249 bp的5′非編碼區(qū)、399 bp的開放閱讀框和249 bp的3′非編碼區(qū)。該基因編碼由132個(gè)氨基酸組成的前體蛋白，其中前38個(gè)氨基酸為信號(hào)肽，在第122和124Cys中間間隔了一個(gè)組氨酸(His)，形成CXC型趨化因子的特征結(jié)構(gòu)，肽鏈中包括10個(gè)保守Cys殘基和2個(gè)N-糖基化位點(diǎn)。氨基酸同源性和進(jìn)化分析表明，條石鯛GtHα與鱸形目魚類的進(jìn)化關(guān)系較近，與鱸形目魚類GtHα的同源性為87%～98%，與其他脊椎動(dòng)物GtHα的同源性為53%～87%。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，GtHα mRNA在垂體、腦、性腺中的表達(dá)量較高，在心、肝臟、胃、腸、肌肉、幽門盲囊中微量表達(dá)，在脾臟、頭腎、鰓、腎臟中不表達(dá)，其中在垂體中的表達(dá)量最高；周期表達(dá)發(fā)現(xiàn)：垂體中GtHα mRNA在卵巢發(fā)育的Ⅴ期達(dá)到最大值，卵巢中GtHα mRNA在卵巢發(fā)育的Ⅳ期達(dá)到最大值，而腦組織中GtHα mRNA在卵巢發(fā)育的Ⅴ期達(dá)到最低值，表明GtHα對(duì)卵母細(xì)胞發(fā)育的調(diào)控可能同時(shí)通過自分泌和旁分泌兩種途徑進(jìn)行。本研究為條石鯛生殖調(diào)控機(jī)制及人工繁育技術(shù)研究提供了基礎(chǔ)資料。

條石鯛；促性腺激素α亞基；cDNA克?。槐磉_(dá)；卵巢發(fā)育周期

魚類的生殖活動(dòng)主要受到下丘腦-腦垂體-性腺軸的調(diào)控，其中促性腺激素(Gonadotropin Hormone，GtH)起著重要的調(diào)控作用。GtH是由腦垂體中促性腺激素細(xì)胞分泌的一種糖蛋白激素，對(duì)性類固醇激素的分泌、生殖周期的啟動(dòng)以及生殖細(xì)胞的產(chǎn)生、成熟、排放等過程起著重要的調(diào)節(jié)作用[1-3]。在哺乳動(dòng)物中，存在兩種類型的GtH，分別是促濾泡激素(Follicle-stimulating Hormone, FSH)和促黃體激素(Luteinizing Hormone，LH)。FSH、LH、促甲狀腺激素(Thyroid-stimulating Hormone，TSH)和絨毛膜促性腺激素(Chorionic Gonadotropin，CG)都是GPHs家族的成員[4]，所有的GPHs都由2個(gè)不同的α亞基和β亞基組成，其中α亞基在4種激素中都是相同的，而β亞基具有種的特異性，只有2個(gè)亞基結(jié)合在一起才能發(fā)揮特定的生物學(xué)活性[5]。GtHα在整個(gè)脊椎動(dòng)物中是高度保守的，它在卵子的產(chǎn)生、成熟、排放以及類固醇激素信號(hào)傳導(dǎo)方面發(fā)揮著重要作用[6]。目前，已從青魚(Mylopharyngodonpiceus)[7]、鯽魚(Carassiusauratus)[8]、斑馬魚(Daniorerio)[9]、大麻哈魚(Oncorhynchusketa)[10]、銀大馬哈魚(Oncorhynchuskisutch)[11]、半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)[12]、鯉魚(Cyprinuscarpio)[13]、鳙魚(Hypophthalmichthysnobilis)[14]、西伯利亞鱘(Acipenserbaerii)[15]、團(tuán)頭魴(Megalobramaamblycephala)[16]、草魚(Ctenopharyngodonidellus)[17]等多種硬骨魚腦垂體中分離出2種GtH。

條石鯛(Oplegnathidaefasciatus)隸屬于鱸形目(Perciformes)，石鯛科(Oplegnathidae)，石鯛屬(Oplegnathus)[18]，在我國黃海、東海和臺(tái)灣沿海等海域均有分布。條石鯛肉質(zhì)細(xì)嫩、口感獨(dú)特、體色艷麗，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和觀賞價(jià)值，條石鯛還適合網(wǎng)箱、池塘、工廠化等多種養(yǎng)殖模式，是一種理想的增養(yǎng)殖魚種。我國自21世紀(jì)初開始條石鯛人工繁育技術(shù)研究，并先后對(duì)條石鯛的形態(tài)學(xué)、成魚消化道結(jié)構(gòu)特征、胚胎和仔稚魚形態(tài)特征以及人工養(yǎng)殖條件等進(jìn)行了研究，促進(jìn)了條石鯛養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[19-20]。近年來，對(duì)條石鯛的繁殖生物學(xué)和人工繁育技術(shù)進(jìn)行了深入的研究，促進(jìn)了條石鯛養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，但是關(guān)于條石鯛繁殖內(nèi)分泌學(xué)方面的研究報(bào)道并不多見。本研究克隆了條石鯛GtHα全長(zhǎng)，對(duì)其cDNA序列進(jìn)行了同源性比較和系統(tǒng)進(jìn)化分析，同時(shí)分析了GtHα的表達(dá)特性，為條石鯛生殖內(nèi)分泌機(jī)制研究提供了基礎(chǔ)資料，也為下丘腦多肽激素如促性腺激素釋放激素(Gonadotropin-releasing hormone，GnRH)調(diào)控GtHα mRNA表達(dá)和信號(hào)傳導(dǎo)通路的研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

條石鯛取自青島忠海水產(chǎn)有限公司(2012-04—12)，共取人工培育的3齡以上性成熟的條石鯛雌魚(全長(zhǎng)27.23～31.11 cm，體重478.2～671.7 kg)16尾。條石鯛培育水溫15～26 ℃，鹽度28～32，pH 8.0～8.2，溶解氧6 mg/L以上，日換水率300%～500%。

1.2 樣品采集

分別于2012-04，2012-05，2012-06，2012-08完成條石鯛親魚取樣，每次取樣4尾。實(shí)驗(yàn)魚活體打包充氧運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，用MS222(200 mg/L)麻醉后解剖，取其腦、垂體、卵巢、心臟、胃、幽門盲囊、腸、脾臟、腎臟、鰓、肌肉、肝臟組織快速投入液氮(-196 ℃)中，后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存，用于總RNA的提取。同時(shí)，用Davidson固定液固定部分卵巢組織，24 h后轉(zhuǎn)入70%的酒精保存，用于組織學(xué)觀察，確定卵巢發(fā)育時(shí)期。

1.3 卵巢的組織學(xué)分析

卵巢組織通過梯度酒精(70%～100%)脫水、二甲苯透明、石蠟包埋后利用LEICA RM 2235型切片機(jī)切成6 μm切片，烘干后H.E染色，中性樹脂封片，在顯微鏡(NIKON 90i)下觀察、拍照。卵巢各發(fā)育期的確定參考劉筠等[21]的分類方法。

1.4 RNA提取

利用RNAiso Plus (TaKaRa)從垂體、心臟、卵巢等13個(gè)組織中提取總RNA。利用超微量紫外檢測(cè)儀(Nanodrop 2000D)檢測(cè)總RNA的純度和濃度，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的質(zhì)量。

1.5 條石鯛GtHα cDNA核心序列的克隆

根據(jù)NCBI上已報(bào)道的其他鱸形目魚類的GtHα全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)了特異性引物(表1)。以條石鯛垂體總RNA為模板，根據(jù)PrimeScript?RT-PCR Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)中的操作說明反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。然后用GtHα特異性引物擴(kuò)增GtHα核心序列，PCR條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，59.8 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖電泳檢測(cè)、切膠回收、純化后連接到pEASY-T1載體(北京全式金生物技術(shù)有限公司)上并轉(zhuǎn)移至Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞(北京全式金生物技術(shù)有限公司)中，37 ℃條件下振蕩培養(yǎng)12～14 h，篩選陽性克隆菌株送至華大基因公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行分析比對(duì)。

1.6 條石鯛GtHα cDNA的5′-RACE和3′-RACE

根據(jù)克隆得到的條石鯛GtHα cDNA核心序列設(shè)計(jì)了GtHα的RACE引物(表1)，以垂體總RNA為模板，根據(jù)Clontech SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit 反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)中的操作說明分別合成5′-cDNA和3′-cDNA。然后分別以5′-cDNA和3′-cDNA為模板，以GtHα-outGSP5和GtHα-outGSP3為引物，根據(jù)Smart RACE Advantage 2 PCR 試劑盒(Clontech)中的操作說明進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR條件：94 ℃ 30 s; 68 ℃ 30 s, 15個(gè)循環(huán),Tm每個(gè)循環(huán)降低0.5 ℃, 72 ℃延伸2 min; 然后94 ℃ 30 s, 60 ℃ 30 s, 72 ℃ 60 s, 28個(gè)循環(huán)。

將第一次PCR產(chǎn)物稀釋40倍后作為模板，分別以GtHα-NGSP5和GtHα-NGSP3為引物進(jìn)行巢式PCR，PCR條件同第一次PCR。用1%的瓊脂糖電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物,然后切膠回收、連接轉(zhuǎn)化、篩選陽性克隆并測(cè)序。

表1 實(shí)驗(yàn)中所用的主要引物

1.7 序列分析

測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中利用BLAST進(jìn)行同源性比對(duì)。利用DNAstar軟件進(jìn)行序列拼接、預(yù)測(cè)蛋白分子量和等電點(diǎn)；利用ExPASy中的Translate Tool進(jìn)行氨基酸序列翻譯；利用SignalP 4.0 Server進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)；利用Clustal X進(jìn)行氨基酸同源性比較；利用MEGA 5.0中的Neighbor-joining法(自展值為1 000)進(jìn)行分子進(jìn)化分析；利用SOPMA進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；利用I-TASSER進(jìn)行蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。

1.8 條石鯛GtHα基因的組織表達(dá)與周期表達(dá)

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法(Mastercycler?eprealplex實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀)檢測(cè)GtHα mRNA在條石鯛不同組織中的相對(duì)表達(dá)量和在卵巢發(fā)育不同時(shí)期中腦、垂體、性腺組織中的表達(dá)水平變化。根據(jù)1.6得到條石鯛GtHα cDNA全序列，設(shè)計(jì)特異性引物Q-GtHα F1和Q-GtHα R1，以Q-β-actin F和Q-β-actin R作為內(nèi)參引物(表1)，用SYBR GreenⅡ熒光染料(TaKaRa)進(jìn)行熒光定量檢測(cè)，用比較閾值法測(cè)定不同組織的相對(duì)表達(dá)量。每種組織取3尾魚，每尾魚設(shè)定3個(gè)平行。

以各組織RNA為模板，根據(jù)PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)中的操作說明合成cDNA。Real-time PCR程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s；57.5 ℃ 28 s，共40個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行溶解曲線分析。

根據(jù)Ct值計(jì)算引物的擴(kuò)增效率并進(jìn)行溶解曲線的分析，以確定引物和擴(kuò)增參數(shù)是否達(dá)到進(jìn)行熒光定量檢測(cè)組織相對(duì)表達(dá)量的要求(0.80.98)。根據(jù)各組織的Ct值，以2-ΔΔCt計(jì)算出不同組織中GtHα mRNA與內(nèi)參基因β-actin的相對(duì)表達(dá)豐度。結(jié)果表示為Mean±SD(平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差)，利用SPSS16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)，設(shè)定差異顯著水平P為0.05，當(dāng)P<0.05時(shí)即差異顯著，當(dāng)P<0.01時(shí)即差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 條石鯛卵巢各發(fā)育時(shí)期的特征

對(duì)各實(shí)驗(yàn)組的雌性條石鯛卵巢進(jìn)行組織切片觀察,確定其性腺發(fā)育時(shí)期：1)在4月份，卵母細(xì)胞體積增大，卵細(xì)胞多為圓形，細(xì)胞核嗜堿性，核仁多靠近核膜分布。初期近細(xì)胞膜細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)數(shù)量不等的液泡，其數(shù)目和大小隨著卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)而增加，并逐漸向核中央靠近。以Ⅲ時(shí)相卵母細(xì)胞為主的卵巢稱為Ⅲ期卵巢(圖1a)。2)5月份，卵母細(xì)胞隨著營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不斷積累，細(xì)胞體積繼續(xù)增大，胞質(zhì)中儲(chǔ)存著大量卵黃顆粒和油球。卵母細(xì)胞外有兩層濾泡細(xì)胞，隨著發(fā)育的進(jìn)行，放射帶越來越模糊，并且逐漸縮小，以Ⅳ時(shí)相卵母細(xì)胞為主的卵巢稱為Ⅳ期卵巢(圖1b)。3)6月份，卵母細(xì)胞呈圓球形，直徑可以達(dá)到326.1～370.2 μm。由于卵黃顆粒的大量積累和融合，此時(shí)的核仁已經(jīng)消失，卵母細(xì)胞已經(jīng)脫離濾泡膜進(jìn)入卵巢腔，以Ⅴ時(shí)相卵母細(xì)胞為主的卵巢稱為Ⅴ期卵巢(圖1c)。4)8月份，由于親魚剛剛產(chǎn)完卵，卵巢萎縮，呈皺縮厚后囊狀，卵巢壁上的平滑肌纖維松弛，厚度明顯增加。此時(shí)相的卵母細(xì)胞呈圓球形，卵黃顆粒已經(jīng)相互融合，核膜消失，此時(shí)為Ⅵ期卵巢(圖1d)。

圖1 條石鯛卵巢發(fā)育不同時(shí)期的形態(tài)圖Fig.1 The morphological characteristicsin ovarian development stages of female Oplegnathus fasciatus

2.2 條石鯛GtHα的序列分析和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

條石鯛GtHα cDNA全長(zhǎng)為897 bp，編碼132個(gè)氨基酸，包括1個(gè)399 bp開放閱讀框、1個(gè)249 bp的5′非編碼區(qū)和一個(gè)249 bp的3′非編碼區(qū)，在Genbank注冊(cè)號(hào)為KM507036。第1～38個(gè)氨基酸為信號(hào)肽，第39～132個(gè)氨基酸為成熟肽。成熟肽序列包含了10個(gè)保守的Cys殘基，分別位于第49，52，69，72，73，100，101，122，124，127氨基酸殘基處，在第122和124Cys殘基中間間隔了1個(gè)His，形成CXC型趨化因子的特征結(jié)構(gòu)(圖2)。此外，在GtHα氨基酸序列中發(fā)現(xiàn)了2個(gè)N-糖基化位點(diǎn)(NIT)和(NHT)(圖3)，在3′端非編碼區(qū)內(nèi)含有1個(gè)加尾信號(hào)ATTAAA(圖2)。

通過SOPMA軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析顯示，在GtHα蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)中，α-螺旋占41.67%，β-轉(zhuǎn)角占4.55%，無規(guī)則卷曲占40.15%，延伸鏈占13.64%(圖3)。通過I-TASSER軟件預(yù)測(cè)了條石鯛GtHα蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)(圖4)。結(jié)果表明存在典型的CXC趨化因子的空間結(jié)構(gòu)，它包含1個(gè)N末端環(huán)狀結(jié)構(gòu)(loop)，3個(gè)反向平行的β鏈以及1個(gè)C末端的α螺旋。該蛋白的分子量為14.59 kDa，等電點(diǎn)為8.41。

注：黑色陰影部分表示起始密碼子；方框部分表示終止密碼子；下劃線部分表示加尾信號(hào)；橢圓部分表示10個(gè)半胱氨酸圖2 條石鯛GtHα cDNA全長(zhǎng)以及推斷的氨基酸序列Fig.2 The cDNA sequence and its deduced amino acid sequence of gonadotropin hormone common-alpha subunit from Oplegnathus fasciatus

圖4 I-TASSER軟件對(duì)條石鯛GtHα蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果Fig.4 Tertiary structure of Oplegnathus fasciatus GtHα protein analyzed by I-TASSER

2.3 條石鯛GtHα氨基酸的同源性比較及系統(tǒng)進(jìn)化分析

將條石鯛的GtHα氨基酸序列與其他物種的GtHα氨基酸序列進(jìn)行同源性比較，結(jié)果表明：條石鯛的GtHα與鱸魚(Dicentrarchuslabrax)的同源性最高，為98%；與鱸形目真鯛(Pagrusmajor)、棘池蝶蚌(Acanthopagrusschlegelii)、條紋鱸(Moronesaxatilis)、花鱸(Lateolabraxjaponicus)、斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides)、羅非魚(Oreochromisniloticus)、小丑魚(Amphiprionmelanopus)的同源性分別為96%，94%，94%，97%，97%，87%，87%；與其他脊椎動(dòng)物GtHα氨基酸序列的同源性在53%～87%(圖5)。

通過MEGA5.0軟件構(gòu)建了條石鯛GtHα氨基酸序列的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果表明：條石鯛與鱸形目魚類的親緣關(guān)系較近，與硬骨魚類構(gòu)成一個(gè)大分支，與鱸魚和條紋鱸聚為1個(gè)小分支，這與上述Blast的分析結(jié)果一致(圖6)。

注：細(xì)框部分代表半胱氨酸殘基位點(diǎn)；粗框部分代表N-糖基化位點(diǎn)圖5 條石鯛GtHα氨基酸序列與其他物種GtHα氨基酸序列的比較Fig.5 Amino acid sequence alignment of gonadotropin hormone common-alpha subunit from Oplegnathus fasciatus with other species

注：條石鯛用直線標(biāo)出圖6 條石鯛GtHα氨基酸序列與其他脊椎動(dòng)物GtHα的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.6 Phylogenetic tree based on the amino acid sequences of GtHα, showing the relationship between Oplegnathus fasciatus and other known vertebrates

2.4 條石鯛GtHα在不同組織中的表達(dá)分布

采用Real time PCR法，以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參，檢測(cè)GtHα mRNA在條石鯛不同組織中的表達(dá)分布情況。結(jié)果表明：GtHα mRNA在除脾臟、頭腎、鰓、腎臟的所有組織都有表達(dá)，但在表達(dá)量上有明顯差異，GtHα mRNA在垂體中的表達(dá)量與其他組織差異極顯著(P<0.01)。而GtHα mRNA在腦和性腺的表達(dá)量相對(duì)于心、肝臟、胃、腸、肌肉、幽門盲囊差異顯著(P<0.05)，而在胃、幽門盲囊、腸、和肌肉之間的表達(dá)差異不顯著(P>0.05)。

2.5 GtHα在條石鯛卵巢發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)水平

利用熒光定量PCR法檢測(cè)了GtHα在雌性條石鯛卵巢發(fā)育不同時(shí)期垂體、卵巢、腦中的相對(duì)表達(dá)水平。與腦和性腺相比，垂體中的GtHα mRNA在卵巢發(fā)育各個(gè)時(shí)期都有較高的表達(dá)水平。利用SPSS 16.0軟件顯著性檢驗(yàn)分析得出，GtHα mRNA在各繁殖周期垂體、腦、卵巢組織的表達(dá)水平差異顯著(P<0.05)。

在垂體組織中，GtHα mRNA在Ⅲ～Ⅴ期的相對(duì)表達(dá)量逐漸上升，到Ⅴ期時(shí)達(dá)到最高水平，到Ⅵ期時(shí)顯著下降(圖8)；在卵巢組織中，GtHα mRNA在Ⅲ～Ⅳ期的相對(duì)表達(dá)量急劇上升，到Ⅳ期時(shí)達(dá)最高水平，在Ⅴ期又急劇下降，達(dá)到最低值，在Ⅵ期又開始慢慢回升(圖8)；在腦組織中，GtHα mRNA在Ⅲ～Ⅴ期的相對(duì)表達(dá)量逐漸下降，到Ⅴ期時(shí)達(dá)最低水平，并明顯低于其他發(fā)育期水平，之后在Ⅵ期時(shí)又開始上升(圖9)。

注：P：垂體；B：腦；O：卵巢；Sp：脾；HK：頭腎；G：鰓；St：胃；L：肝臟；PC：幽門盲囊；I：腸；H：心臟；K：腎；M：肌肉圖7 條石鯛GtHα mRNA在不同組織中的相對(duì)表達(dá)水平Fig.7 The relative expression level of GtHα mRNA in various tissues of Oplegnathus fasciatus

注：Ⅲ：Ⅲ期卵巢；Ⅳ：Ⅳ期卵巢；Ⅴ：Ⅴ期卵巢；Ⅵ：Ⅵ期卵巢；凡無相同字母表示差異顯著(P<0.05)圖8 卵巢和垂體中GtHα mRNA在條石鯛卵巢不同發(fā)育時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量Fig.8 The relative expression of GtHα mRNA of ovarian and pituitary in different ovarian development stage of Oplegnathus fasciatus

注：Ⅲ：Ⅲ期卵巢；Ⅳ：Ⅳ期卵巢；Ⅴ：Ⅴ期卵巢；Ⅵ：Ⅵ期卵巢；凡無相同字母表示差異顯著(P<0.05)圖9 腦中GtHα mRNA在條石鯛卵巢不同發(fā)育時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量Fig.9 The relative expression of GtHα mRNA of brain in different ovarian development stage of Oplegnathus fasciatus

3 討 論

利用RT-PCR和RACE法從條石鯛垂體中擴(kuò)增出了全長(zhǎng)897 bp的GtHα cDNA序列。序列分析發(fā)現(xiàn)，在其成熟肽序列中存在10個(gè)保守的Cys和2個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，這些保守部分可能參與了促性腺激素亞型和受體結(jié)合[22]。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，條石鯛與多數(shù)鱸形目魚類在1個(gè)分支節(jié)點(diǎn)上，這與形態(tài)學(xué)上得出的分類進(jìn)化地位相一致。此外，還發(fā)現(xiàn)GtHα在硬骨魚類和哺育動(dòng)物中高度保守，這可能是因?yàn)樗心X垂體中的糖蛋白類激素都可以與其結(jié)合，GtHα在較高的進(jìn)化選擇壓力下形成了保守的結(jié)構(gòu)。本研究從條石鯛腦垂體中克隆到1種GtHα，這與莫桑比克羅非魚(Oreochromismossambicus)[23]和中華鱘(Acipensersinensis)[24]均只有1種GtHα亞基的報(bào)道一致。

采用實(shí)時(shí)定量熒光PCR方法檢測(cè)了GtHα在各組織中的相對(duì)表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)GtHα mRNA主要在垂體中表達(dá)，該特征與其他硬骨魚類的相同[25]，表明垂體是其主要分泌的部位；研究還發(fā)現(xiàn)GtHα mRNA在腦、性腺中的表達(dá)量較低，在心臟、肝臟、胃、腸、肌肉、幽門盲囊中微量表達(dá)，這種多組織表達(dá)特性暗示GtHα除通過垂體分泌參與卵母細(xì)胞的發(fā)育成熟調(diào)控之外，還可能有更為廣泛的生理功能。Mittelholzer等[26]采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)到大西洋鱈魚(Gadus morhua)的GtHα mRNA在垂體、腦、性腺、肝臟和鰓中表達(dá)；但是在檢測(cè)的心、頭腎、肌肉、腸、脾臟中沒有發(fā)現(xiàn)GtHα mRNA的表達(dá)。一些學(xué)者運(yùn)用RT-PCR和免疫細(xì)胞化學(xué)染色法證明了GtHα在一些魚類[27-28]、哺乳動(dòng)物(包括人類)[29]垂體之外的組織中存在著表達(dá)。GtHα lpha在不同組織的表達(dá)特征，說明了促性腺激素存在多種調(diào)控機(jī)制。

采用Real Time PCR法檢測(cè)了GtHα在條石鯛卵巢發(fā)育不同時(shí)期表達(dá)水平變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：條石鯛垂體中的GtHα mRNA在Ⅴ期達(dá)到最大值，表明GtHα在卵黃生成和卵母細(xì)胞成熟階段發(fā)揮作用，這與雌性鮭科魚周期表達(dá)的結(jié)果相一致[30]。Santos等[31]在研究虹鱒(Oncorhynchusmykiss)時(shí)也發(fā)現(xiàn)GtHⅠmRNA的表達(dá)量在卵黃形成階段逐步上升，在即將排卵時(shí)，垂體中GtHⅡ的濃度急劇增大，達(dá)到最大值，表明GtH Ⅰ和GtHⅡ在虹鱒生殖的不同時(shí)期有不同程度的合成與分泌，因而對(duì)性腺的發(fā)育和配子的產(chǎn)生起著不同的生理功能。Shimizu等[32]在研究底鳉(Fundulusheterocliutus)時(shí)發(fā)現(xiàn)產(chǎn)卵期垂體中2種GtH細(xì)胞都很豐富，表明卵母細(xì)胞的最終成熟需要2種GtH的參與。對(duì)于GtHα在條石鯛生殖周期垂體中的這種表達(dá)特性是否是由垂體中GtHⅡ的大量分泌而引起的，以及調(diào)控GtHα在條石鯛生殖周期垂體中表達(dá)量不同的具體機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

本研究還發(fā)現(xiàn)，卵巢中GtHα mRNA表達(dá)水平在Ⅳ期達(dá)到最大值，而在Ⅴ期達(dá)到最低值，這可能暗示著GtHα mRNA直接參與了卵黃的早期發(fā)育。GtH是性腺產(chǎn)生性激素的主要調(diào)控者：一方面，垂體分泌的GtH通過血液遷移到性腺中，與其受體GtHR結(jié)合以促進(jìn)性腺成熟；另一方面，GtH可能是通過調(diào)節(jié)芳香化酶基因的表達(dá)和芳香化酶的活性來刺激卵巢自身分泌雌二醇進(jìn)一步來調(diào)節(jié)性腺的發(fā)育、配子的生成以及卵母細(xì)胞的最后成熟[33]。Liu等[34]在研究羅非魚(Oreochromismossambicus)時(shí)也發(fā)現(xiàn)卵巢中GtHα mRNA在Ⅳ期達(dá)到最大值，表明卵巢中GtHα mRNA可能在魚類生殖、細(xì)胞增殖以及早期卵巢分化和成熟中發(fā)揮重要作用。這些結(jié)果表明條石鯛的內(nèi)分泌調(diào)節(jié)系統(tǒng)可能具有更為復(fù)雜的作用模式。此外，關(guān)于GtH對(duì)魚類生殖調(diào)控的內(nèi)部機(jī)制以及GtH自身分泌調(diào)控的內(nèi)部機(jī)制問題，仍需要進(jìn)一步研究和探討。

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Received: March 5, 2014

Cloning and Expression Pattern of Gonadotropin Hormone Common-alpha Subunit inOplegnathusfasciatus

CHEN Sheng-yi1,2,3, SHI Bao1,2, LIU Xue-zhou1,2*,XU Yong-jiang1,2,LI Xiao-xiao1,2,3, WANG Shan-shan1,2, WANG Yan-yan1,2

(1.YellowSeaFisheriesResearchInstitute,ChineseAcademyofFisherySciences,Qingdao 266071,China;2.KeyLaboratoryofSustainableDevelopmentofMarineFisheries,MinistryofAgriculture,QingdaoKeyLaboratoryforMarineFishBreedingandBiotechnology, Qingdao 266071,China;3.CollegeofFisheriesandLifeScience,ShanghaiOceanUniversity, Shanghai 201306,China)

A full length cDNA sequence of gonadotropin hormone common alpha subunit was cloned from the pituitary of Oplegnathus fasciatususing by homology cloning and RACE techniques. The GtHα cDNA sequence consisted of 897 base pairs nucleotides, including 249 base pairs at 5′ untranslation region, 249 base pairs at 3′ untranslation region and an open reading frame with 399 base pairs nucleotides. The cDNA sequence encoded a precursor protein of 132 amino acids preceded by a signal peptide of 38 amino acids residues. The putative peptide contained ten cysteine residues and two N-glycosylation sites residues. A histidine residue in the middle of 122 and 124 cysteine formed a CXC chemokine characteristic structure. Sequences comparison and phylogenetic analysis showed that the GtHα ofOplegnathusfasciatushad higher identity to their orthologs of Perciformes (87%～98%) than to other vertebrates (53%～87%). The qRT-PCR results suggested that the level of GtHα mRNA was higher in pituitary, ovary, brain and trace expression in heart, liver, stomach, intestine, muscle and pyloric caecum.However, it was not found in kidney, Head kidney, spleen and gill by Real-time Quantitative PCR technique. The level of GtHα mRNA was highest in pituitary. The reproductive cycle expression showed that the level of GtHα mRNA in pituitary was maximum in the stage Ⅴ of ovarian development and that in ovary was maximum in the stage Ⅳ. However, the level in brain was lowest in the stage Ⅴ suggesting the regulation of GtHα in the ovarian development may through both autocrine and paracrine pathways. This research provides a reference to the reproductive regulation mechanism and artificial breeding technigues ofOplegnathusfasciatus.

Oplegnathusfasciatus；gonadotropin hormone common-alpha subunit；molecular cloning; expression; ovarian development cycle

2014-03-05

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃——新養(yǎng)殖海水種類苗種繁育技術(shù)(2012AA10A413)；國家自然科學(xué)基金——半滑舌鰨膜孕激素受體(mPR-like)及其對(duì)卵母細(xì)胞成熟過程的作用 (31201982) ；山東省優(yōu)秀中青年科學(xué)家科研獎(jiǎng)勵(lì)基金——孕酮受體膜組分1在半滑舌鰨卵巢發(fā)育成熟過程中的作用 (BS2013SW042)

陳圣毅(1988-) ，男，湖北武漢人，碩士研究生，主要從事魚類繁殖生理學(xué)方面研究.E-mail:shengyichen88@163.com

*通訊作者：柳學(xué)周(1959-)，男，山東青島人，研究員，主要從事魚類繁育理論與增養(yǎng)殖技術(shù)方面研究.E-mail: liuxz@ysfri.ac.cn

(王佳實(shí) 編輯)

Q418

A

1671-6647(2015)02-0207-12