阮 征 ，劉開武，吳建英，華 娟，夏 瑜，王蓮芳，胡小明，劉 杰，，黃海軍

（1.武漢市農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究所，湖北 武漢430208 ；2.武漢市重大動(dòng)物疫病防控中心，湖北 武漢 430023；3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430070）

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是豬群中流行的重要傳染病之一，可引起母豬的繁殖障礙(包括流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎、木乃伊胎等)、仔豬存活率急劇下降和育成豬呼吸道疾病。病原為豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV），該病毒為單股正鏈RNA病毒，屬于動(dòng)脈炎病毒屬。PRRSV有嚴(yán)格的宿主和細(xì)胞嗜性，豬肺泡巨噬細(xì)胞（Porcine alveolar macrophage，PAM）、Marc145 細(xì)胞和MA-104 細(xì)胞是其重要的靶細(xì)胞，PRRSV感染細(xì)胞需要首先與細(xì)胞受體結(jié)合，通過內(nèi)吞作用進(jìn)人細(xì)胞內(nèi)，在胞內(nèi)完成病毒的脫殼與基因組釋放[1-3]。

目前發(fā)現(xiàn)的PRRSV感染相關(guān)受體有硫酸乙酰肝素（Heparin Sulphate，HS）、唾液酸粘附素（Sialoadhesin，Sn）、波形蛋白（Vimentin）、CD163（Cluster of Differentiation 163）分子、CD151（Cluster of Differentiation 151）分子和NMMHCIIA（非肌肉肌球蛋白重鏈ⅡA）分子[4]。有關(guān)研究結(jié)果表明，CD151 能與PRRSV3′端非轉(zhuǎn)錄區(qū)（3′URT）發(fā)生結(jié)合，進(jìn)而導(dǎo)致PRRSV與細(xì)胞發(fā)生相互作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生感染。通過轉(zhuǎn)染使PRRSV非敏感細(xì)胞BHK-21 表達(dá)CD151會(huì)使該細(xì)胞允許PRRSV的感染，增殖程度高達(dá)100倍[5]。CD163 為一種SRCR 超家族的Hapten Hemoglobin 清道夫受體，是130 000 的細(xì)胞表面糖蛋白，在PRRSV感染巨噬細(xì)胞過程中介導(dǎo)病毒在細(xì)胞質(zhì)中的脫衣殼和病毒基因組的釋放[6-8]。

在實(shí)際生產(chǎn)中，PRRSV的體外增殖主要在Marc145細(xì)胞中進(jìn)行。本研究采用脂質(zhì)體介導(dǎo)方法，通過G418 篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Marc145 細(xì)胞，并利用單個(gè)細(xì)胞克隆技術(shù)，獲得了穩(wěn)定超表達(dá)CD151蛋白和（或）CD163 蛋白的Marc145 細(xì)胞株，并進(jìn)一步探討其在疫苗生產(chǎn)中的應(yīng)用，為最終獲得PRRSV高效增殖的新途徑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒和細(xì)胞 去內(nèi)毒素純化質(zhì)粒p IRES2-EGFP-CD151 和p IRES2-EGFP-CD163 由本實(shí)驗(yàn)室保存。Marc145 細(xì)胞由武漢中博生物股份有限公司提供，在本實(shí)驗(yàn)室傳代保存。

1.2 試劑 脂質(zhì)體2000 和G418，購(gòu)自Invitrogen 公司；胎牛血清，購(gòu)自Gibco 公司；DMEM培養(yǎng)基，購(gòu)自清大天一公司；胰蛋白酶、PBS（PH7.4），購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；RIPA裂解液、50*cooktail、PMSF（100 mmol/L）、磷酸化蛋白酶抑制劑、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、5*蛋白上樣緩沖液、ECL、顯影定影試劑，購(gòu)自谷歌生物技術(shù)有限公司；BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自Bio-rad 公司；蛋白Marker，購(gòu)自Therm（Fermentas）公司；PVDF膜（0.22 μm、0.45 μm），購(gòu)自Millipore 公司；BSA，購(gòu)自Roche 公司；TWEEN 20，購(gòu)自Amresco 公司；actin，購(gòu)自Santa cruz 公司；GAPDH，購(gòu)自Epitomics 公司；CD151、CD163 抗體，購(gòu)自Abcam 公司。

1.3 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的建立 待Marc145 細(xì)胞融合至70%～80%，按照Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑盒操作說明書進(jìn)行操作。轉(zhuǎn)染48 h 后，開始用G418（300 μg/mL）篩選3 d，逐漸增加篩選濃度至絕大部分細(xì)胞死亡，改為800 μg/mL 維持篩選6周。將獲得細(xì)胞采用極限稀釋法接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，交替使用常規(guī)培養(yǎng)基和G418（600 μg/mL）培養(yǎng)基培養(yǎng)單個(gè)細(xì)胞，至其長(zhǎng)出單個(gè)克隆，挑選單個(gè)細(xì)胞克隆繼續(xù)培養(yǎng)至分別建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CD151、CD163 和CD151/CD163 共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株。

1.4 熒光免疫細(xì)胞化學(xué)分析 分別培養(yǎng)未轉(zhuǎn)染的Marc145 細(xì)胞和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞（CD151、CD163 和CD151/CD163 共轉(zhuǎn)染），制作細(xì)胞爬片，進(jìn)行熒光免疫細(xì)胞化學(xué)分析。用PBS按一定比例稀釋好的一抗（CD163，Rabbit，1∶50；CD151，Rabbit，1∶50）覆蓋組織，4°C孵育過夜。用PBS洗滌3 次。滴加與一抗相應(yīng)種屬的熒光二抗（cy3 標(biāo)記山羊抗兔1∶100；cy3標(biāo)記山羊抗小鼠1∶100），覆蓋組織，避光室溫孵育50 min。滴加DAPI 染液，避光室溫孵育10 min。用PBS洗滌。稍甩干后將有細(xì)胞的一面朝下用抗熒光淬滅封片劑將玻片封固在載玻片上，于倒置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.5 Western Blot 分析 分別收集4 種細(xì)胞并提取總蛋白，將樣品加入點(diǎn)樣孔中，5%濃縮膠電泳，轉(zhuǎn)膜；5%的脫脂牛奶脫色；加一抗（CD163，Rabbit，1∶1 000；CD151，Rabbit，1∶1 000；Actin，Rabbit，1∶1 000），4 ℃過夜；再加二抗（1∶3 000），室溫下孵育30 min；膠片拍照。

1.6 細(xì)胞接種病毒 按照文獻(xiàn)[12]的方法，用細(xì)胞生長(zhǎng)液（含體積濃度為8%的小牛血清的DMEM培養(yǎng)基）對(duì)超表達(dá)CD151、CD163 或CD151/CD163共表達(dá)的Marc145 細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中進(jìn)行擴(kuò)繁培養(yǎng)，待細(xì)胞量足夠后，以0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞接種到轉(zhuǎn)瓶，置于轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速10 r/h。待細(xì)胞覆蓋率達(dá)到80%以上，移除細(xì)胞生長(zhǎng)液，按照0.001MOI 劑量接種PRRS病毒Ch-1R株，加入病毒維持液（含體積濃度為2%的小牛血清的DMEM），在37 ℃下繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞病變達(dá)到80%以上時(shí)收獲病毒液，隨后補(bǔ)入不含病毒的維持液，12 h 后再收毒，反復(fù)收毒5 次。按Reed-Muench 法計(jì)算TCID50值。將收獲的病毒液置于2 ℃～8 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.7 疫苗制備 將上述收獲的病毒液用100 kD截留分子量的超濾膜包濃縮10 倍，滅活劑與病毒液的體積比按1∶2 000 加入質(zhì)量濃度為37% 甲醛溶液進(jìn)行滅活后，再經(jīng)凝膠層析柱Sepharose 4FF柱層析得到純化疫苗，按抗原和油佐劑1∶1 比例加入油佐劑，乳化配制成滅活疫苗（油佐劑的配制為94%（V/V）白油、6%（V/V）的Span-80、2%（g/V）硬脂酸鋁）。

1.8 疫苗效力檢驗(yàn) 疫苗免疫接種：3 個(gè)試驗(yàn)組分別將疫苗按2 mL/頭的劑量接種4～6 周仔豬10頭，同時(shí)設(shè)對(duì)照組（非免疫10 頭）。血清抗體檢測(cè)：在免疫前和免疫后28 d 采集豬血清，檢測(cè)對(duì)PRRS病毒中和抗體效價(jià)。攻毒保護(hù)試驗(yàn)：免疫后28 d，用PRRS病毒（含量為105.5TCID50/mL 的病毒液）1∶10 稀釋后給每頭豬肌肉接種3 mL，繼續(xù)飼養(yǎng)觀察21 d，撲殺剖檢。

2 結(jié)果與分析

2.1 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的建立 在熒光顯微鏡下穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CD151、CD163 和CD151/CD163 共轉(zhuǎn) 染的細(xì)胞均表達(dá)強(qiáng)烈的綠色熒光蛋白（見中插彩版圖1）。擴(kuò)繁培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)微生物學(xué)檢測(cè)合格后，在液氮中進(jìn)行保藏，建立了種子細(xì)胞庫(kù)和工作細(xì)胞庫(kù)。

2.2 病毒受體在細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后Marc145 細(xì)胞中的表達(dá)情況 結(jié)果表明，無論是單一轉(zhuǎn)染還是共轉(zhuǎn)染，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后的Marc145 細(xì)胞表面紅色熒光強(qiáng)度增加明顯，預(yù)示其表達(dá)CD151 或（和）CD163 的水平明顯提高（見中插彩版圖2）。

2.3 Western Blot 分析病毒受體在細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后Marc145 細(xì)胞中的表達(dá)情況 利用Western Blot 檢測(cè)相關(guān)細(xì)胞表面受體蛋白CD151 和CD163 的表達(dá)情況（圖3）。結(jié)果顯示，跟對(duì)照組（未轉(zhuǎn)染組）相比，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染單一受體蛋白或CD151、CD163 共轉(zhuǎn)染細(xì)胞中目的蛋白表達(dá)水平均高于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞組，共轉(zhuǎn)染組較單一轉(zhuǎn)染組同一目的蛋白水平略低。

圖3 Western blot分析結(jié)果

表1 疫苗效力檢測(cè)結(jié)果

2.4 超表達(dá)受體蛋白的細(xì)胞制備疫苗效果分析利用超表達(dá)受體蛋白CD151 或（和）CD163 的Marc145 細(xì)胞接種PRRS病毒Ch-1R 株后，收獲病毒效價(jià)可達(dá)到108.0以上，較對(duì)照組（未轉(zhuǎn)染細(xì)胞組）提高10 倍以上。所制備的疫苗免疫接種動(dòng)物后對(duì)PRRS病毒中和抗體效價(jià)與對(duì)照組（未轉(zhuǎn)染組）水平相當(dāng)。攻毒保護(hù)試驗(yàn)中通過剖檢未見病變情況，且疫苗吸收完全，達(dá)到部頒標(biāo)準(zhǔn)（1∶16）。

3 討論

PRRS病毒與細(xì)胞上的受體結(jié)合是實(shí)現(xiàn)其侵染靶細(xì)胞的先決條件。目前已經(jīng)確定的PRRS病毒的細(xì)胞受體有6 種，分別是硫酸乙酰肝素（Heparin Sulphate，HS）、唾液酸粘附素（Sialoadhesin，Sn）、波形蛋白（Vimentin）、CD163（Cluster of Differentiation 163）分子、CD151（Cluster of Differentiation 151）分子和NMMHCIIA（非肌肉肌球蛋白重鏈ⅡA）分子。

已有多個(gè)研究小組報(bào)道，實(shí)驗(yàn)室條件下通過構(gòu)建超表達(dá)載體提高了病毒感染的滴度，但是尚未在疫苗制備上進(jìn)行驗(yàn)證。PRRSV非敏感細(xì)胞系BHK-21 和CRFK 在轉(zhuǎn)染重組Vimentin 后接種PRRSV，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染Vimentin 的陽(yáng)性細(xì)胞都能檢測(cè)到病毒RNA，而轉(zhuǎn)入半乳糖苷酶的陰性對(duì)照細(xì)胞中都檢測(cè)不到病毒RNA，可見PRRSV非敏感細(xì)胞由于Vimentin 的轉(zhuǎn)入獲得了易感性，表明Vimentin 可以 與PRRSV的N 蛋白結(jié) 合，是PRRSV受體復(fù)合物的一部分，Vimentin 可能與PRRSV感染Marc145 細(xì)胞有關(guān)。Welch 等報(bào)道轉(zhuǎn)染CD163 分子至PRRSV非敏感細(xì)胞系PK-15 中可以使此細(xì)胞獲得感染PRRSV和產(chǎn)生子代病毒粒子的能力。通過轉(zhuǎn)染使PRRSV非敏感細(xì)胞BHK-21 表達(dá)CD151 會(huì)使該細(xì)胞允許PRRSV的感染，增殖程度高達(dá)100 倍。最近有研究發(fā)現(xiàn)，將CD209 的基因?qū)隑HK-21 細(xì)胞后能使BHK-21 細(xì)胞中產(chǎn)生的子病毒對(duì)Marc145 的感染能力增強(qiáng)。

本研究將CD151 和CD163 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到Marc145細(xì)胞中，并通過其感染PRRS病毒Ch-1R（Ch-1a）株，實(shí)現(xiàn)了病毒培養(yǎng)滴度的顯著提高，最終在GMP 生產(chǎn)車間進(jìn)行小規(guī)模試驗(yàn)，所生產(chǎn)的不同類型疫苗均能達(dá)到部頒標(biāo)準(zhǔn)，為下一步將該技術(shù)更好地應(yīng)用到生產(chǎn)實(shí)踐中去提供了依據(jù)。

[1]韓明遠(yuǎn)，沈青春，張志剛，等.影響豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染與增殖的因素[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010，31（1）：87-91.

[2]蒲靜.PRRSV對(duì)豬肺泡巨噬細(xì)胞天然免疫功能影響的分子機(jī)制[D].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2005.

[3]安同慶.豬繁殖與呼吸綜合征與宿主細(xì)胞受體之間相互作用的研究及病毒遺傳變異分析[D].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2007.

[4]蔣成蘭，邢鳳，徐云華，等.豬NMMHCⅡA基因功能區(qū)的克隆及表達(dá)特征分析[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2012，43（10）：1519-1524.

[5]Shanmukhappa K，Kim JK，Kapil S.Role of CD151，Atetraspanin in porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection[J].Virol J，2007，4：62.

[6]Welch SK，Calvert JG.Abrief reviewof CD163 and its role in PRRSVinfection[J].Virus Research，2010，154（1-2）：98-103.

[7]Lee Y J，Park CK，Nam E，et al.Generation of a porcine alveolar macrophage cell line for the growth of porcine reproductiveand respiratory syndrome virus[J].Journal of Virological Methods，2010，163：410-415.

[8]De Vries W，Haasnoot J，van der Velden J，et al.Increased virus replication in mammalian cells by blocking intracellular innate defense responses [J].Gene Therapy，2008，15：545-552.

[9]薛慶善.體外培養(yǎng)的原理與技術(shù)[M].北京：科學(xué)出版社，2001.

[10]Kim JK，F(xiàn)ahad AM，Shanmukhappa K，et al.Defining the cellular target（s）of porcine reproductive and respiratory syndrome virus blocking monoclonal antibody 7G10[J].JVirol，2006，80（2）：689-696.

[11]王偉偉，張璐，馬曉春，等.波形蛋白介導(dǎo)豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染Marc145 細(xì)胞作用的初步研究[J].病毒學(xué)報(bào)，2011，27（5）：456-461.

[12]Calvert JG，Slade DE，Shields SL，et al.CD163 expression confers susceptibility to porcine reproductive and respiratory syndrome viruses[J].JVirol，2007，81（14）：7371-7379.

[13]Van Gorp H，Van Breedam W，Van Doorsselaere J，et al.Identification of the CD163 protein domains involved in infection of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus[J].JVirol，2010，84（6）：3101-3105.

[14]Lee Y J，Lee C.Deletion of the cytoplasmic domain of CD163 enhances porcine reproductive and respiratory syndrome virus replication[J].Arch Virol，2010，155（8）：1319-1323.

[15]Huang Y W，Dryman BA，Li W，et al.Porcine DCSIGN：molecular cloning，gene structure,tissue distribution and binding characteristics[J].Dev Comp Immunol，2009，33（4）：464-480.