周 勇，白文順，楊亮宇，張 健，孫亭亭，陳培富

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，云南 昆明 650201）

馬立克?。∕arek's Disease，MD）是雞的一種淋巴細胞增生性腫瘤病，對養(yǎng)雞業(yè)的健康發(fā)展危害很大。已有研究表明，雞主要組織相容性復(fù)合體（Major Histocompatibility Complex，MHC）的B-F和B-L 基因是MD抗性主效基因，其中單倍型B1、B4、B5、B12、B13、B15、B19 和B23 對MD較易感，B2、B6、B14 和B17 對MD有弱抗性，B21 對MD抗性最強[1]。目前，針對武定雞抗MD的研究還未見報道。本研究通過對20 個武定雞試驗雞群進行MHC-B單倍型分型，并通過測序分析和攻毒試驗確定武定雞特有的抗MD基因多態(tài)性位點，篩選出抗MD的試驗雞群，為培育武定雞抗MD品系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 選用購自云南省武定、祿勸等地的武定雞；MDV京-1 株由北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所提供；全基因組DNA提取試劑盒，2×TaqPlus PCR Master Mix，購自TIANGEN 公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，購自寶生物工程（大連）有限公司。引物參考Fulton 等[2]在微衛(wèi)星LEI0258 和MCW0371 位點處設(shè)計，由北京六和華大基因科技公司合成，引物序列如表1。

表1 LEI0258和MCW0371引物

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品采集 隨機選取120 日齡以上總數(shù)約2 000 只的20 個武定雞群，對每個雞群20%左右（10～40 只）試驗雞沿翅下靜脈采血，共400 只，保證各雞群采血雞公母各半。

表2 LEI0258和MCW0371的PCR目的產(chǎn)物與各標準單倍型

1.2.2 PCR 擴增微衛(wèi)星等位基因 血細胞DNA按TIANGEN 試劑盒操作說明書進行提取，并作為模板進行PCR 擴增，反應(yīng)體系：模板1 μL，上、下游引物各1 μL，2×Mix 12.5 μL，補ddH2O至25 μL；反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，57.2 ℃（LEI0258 引物）或59 ℃（MCW0371 引物）退火45 s，72 ℃延伸45 s，共35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.2.3 B單倍型分型 PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，結(jié)合表2 判定B單倍型[3]。將LEI0258 引物擴增的MD抗性與易感性單倍型純合子PCR 產(chǎn)物進行膠回收后送北京六和華大基因科技公司測序，測序結(jié)果比對GenBank 下載的標準B單倍型序列，以驗證分型的準確性并分析基因多態(tài)性。

1.2.4 雛雞攻毒試驗及抗MD品系的選育 將發(fā)現(xiàn)的MD抗性相關(guān)B單倍型純合子親本進行雜交，其F1 代雛雞（10 日齡）均不進行MD疫苗接種，按不同單倍型分為攻毒組和對照組，5 羽/單倍型。攻毒組每羽腹腔注射經(jīng)10 倍稀釋MDV京-1 株0.3 mL；對照組每羽腹腔注射生理鹽水0.3 mL。記錄發(fā)病與死亡情況，死亡雞及時剖檢，未死亡雞到90 日齡再全部剖檢，篩選MD發(fā)病率和死亡率最低的B單倍型純合子親本雞。

2 結(jié)果

2.1 PCR 擴增結(jié)果 微衛(wèi)星LEI0258 擴增獲得目的片段包括193、205、249、261、295、309、345、357、393 bp 和443 bp（圖1.A）；微衛(wèi)星MCW0371擴增獲得目的片段包括201、202、203、205、206 bp和209 bp（圖1.B）。

2.2 B單倍型分型與序列分析結(jié)果

圖1 武定雞LEI0258（A）和MCW0371（B）PCR擴增電泳分析

2.2.1 單倍型分型 試驗雞B單倍型分布情況（圖2），分析發(fā)現(xiàn)，MD易感單倍型占19.5%、弱抗占15.4%、抗性占17.9%，但出現(xiàn)頻率最高的B11及其余單倍型對MD有無抗性尚未知[2]。同時母雞組中發(fā)現(xiàn)B5/B5 試驗雞2 只，B11/B11 39 只，B14/B14 和B15/B15 各3 只，B21/B21 7 只，3 只不確定是否為單倍型純合子；公雞組中發(fā)現(xiàn)B5/B5 10只，B6/B6 1 只，B11/B11 27 只，B14/B14 5 只，B15/B15 2 只，B21/B21 8 只，2 只不確定是否為純合子。

2.2.2 微衛(wèi)星LEI0258 等位基因序列分析 部分MD抗性與易感單倍型純合子序列通過DNAStar 軟件分析，發(fā)現(xiàn)DNA測序結(jié)果與應(yīng)用微衛(wèi)星擴增對單倍型分型結(jié)果一致（圖3）。同時發(fā)現(xiàn)，MD抗性與易感單倍型在193～230 bp“TTCTTTCTTTCC”重復(fù)單元存在個數(shù)上的差異，易感單倍型在230～266 bp 由標準的“TTCTTTCTTTCC”部分變?yōu)椤癎GATTTTGAGCC”、“AAAAAAATCACC”或“ACAAAATGAGCC”，樣品3 和4 與MD易感單倍型B5 和B15 在237～240 bp由“GAGG”變?yōu)椤癟GAG”。

2.3 試驗雞攻毒結(jié)果及抗MD品系的初步篩選攻毒組B5/B5、B15/B15、B11/B11 試驗雞發(fā)病率分別為100%、100%、80%，死亡率分別為100%、80%、60%；B14/B14 和B21/B21 發(fā)病率為40%和20%，但無死亡。攻毒組發(fā)病雞剖檢發(fā)現(xiàn)心臟、腎臟、脾臟均有不同程度腫大，心臟、脾臟、肝臟表面都有明顯的白色腫瘤，腎臟出現(xiàn)花斑腎，剩余雞剖檢均無MD癥狀（圖4）；對照組沒有發(fā)現(xiàn)MD癥狀及病理變化，也無死亡雞出現(xiàn)。攻毒試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)B21/B21 對MD抗性最強，因此母雞組中7 只B21/B21 試驗雞和公雞組中8只B21/B21試驗雞，可作為武定雞抗MD品系。

圖2 試驗武定雞單倍型分布情況

圖3 武定雞微衛(wèi)星LEI0258等位基因序列分析截

3 討論

雞MHC與MD抗性密切相關(guān)，如無特定病原體BW/G（n）系雞群是通過檢測微衛(wèi)星LEI0258、MCW0371、MCW0312 和MHC-D等位基因并篩選純合子建立而成[3]。本研究通過檢測LEI0258 和MCW0371 等位基因?qū)ξ涠u進行單倍型分型，發(fā)現(xiàn)B1、B5、B6、B11、B13、B14、B15、B17、B21、B22和B27 等單倍型，特別是B21/B21 在試驗公雞和母雞中都存在，非常利于培育武定雞抗MD品系。由于大小相同的微衛(wèi)星等位基因可能存在差異[3]，本研究對部分微衛(wèi)星LEI0258 等位基因序列測定，驗證了PCR 擴增分型的正確性，同時發(fā)現(xiàn)武定雞在此遺傳位點特有的基因多態(tài)性。攻毒試驗進一步驗證B21 單倍型對MD抗性最強，且發(fā)現(xiàn)B11 單倍型對MD較為易感，提示武定雞總體上屬于MD易感品種。雞MHC基因在進化過程中相對穩(wěn)定[4]，對B21/B21 試驗雞擴大種群可建立一個武定雞抗MD品系。

[1]Gao CX，Han L X，Qu L D，et al.Specific TaqMan probed real-time quantitative RT-PCR methods and their application to differentiate the transcripts of duplicated B-F or B-L-Bgenes in chicken MHC[J].Veterinary Immunology and Immunopathology，2012，145（3-4）：590-596.

[2]Fulton JE，Juul-Madsen H R，Ashwell CM，et al.Molecular genotype identification of the Gallus gallus major histocompatibility complex[J].Immunogenetics，2006，58（5-6）：407-421.

[3]Sironi L，Williams JL，Stella A，et al.Genomic study of the response of chicken to highly pathogenic avian influenza virus[J].BMCProceedings，2011，5（Suppl 4）：S25.

[4]Kaufman J.Antigen processing and presentation：Evolution from a bird's eye view[J].Molecular immunology，2013，2（55）：159-161.