方志超 ，羅梓桐，黃 攀，刀麗梅，單文杰，林 雅，范財(cái)良，程方俊

（1.西南大學(xué)榮昌校區(qū)動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，重慶 榮昌402460 ；2.重慶市榮昌縣畜牧局，重慶榮昌 402460）

麥?zhǔn)匣【╒ibrio metschnikovii）又稱(chēng)梅氏弧菌，是廣泛存在自然界的致病性弧菌，也是國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的致病性弧菌。主要存在于海水，河水，水產(chǎn)品和食品中。近年來(lái)，已從水源，牛糞便、雞肝、蒼蠅中分離出該菌[1-2]。V.metschnikovii可引起人類(lèi)傷口感染、食物中毒、腹瀉和敗血癥，是公共衛(wèi)生學(xué)上重要的病原微生物。姜淑紅等[3-5]人都曾報(bào)道過(guò)麥?zhǔn)匣【鹑烁篂a，沈強(qiáng)[6]報(bào)道，從食物中檢測(cè)出麥?zhǔn)匣【?，并引起人的食物中毒。Hansen[7]等人報(bào)道麥?zhǔn)匣【鷮?dǎo)致敗血癥，呼吸道感染，傷口感染。在動(dòng)物方面，樸范澤[8]報(bào)道雛雞感染V.metschnikovii后出現(xiàn)突然發(fā)病、腹瀉以及嚴(yán)重腸炎，死亡率高。楊瑛等[9]發(fā)現(xiàn)，V.metschnikovii與豬鏈球菌2 型具有較強(qiáng)的協(xié)同致病作用，可引起豬的死亡。

16SrRNA基因普遍存在于原核生物中，不同細(xì)菌具有非常相似的保守區(qū)又具有其特異性可變區(qū)。16SrRNA長(zhǎng)約1 500 bp，便于測(cè)序和序列分析，因而它非常適合對(duì)細(xì)菌進(jìn)行鑒定和系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系研究，已經(jīng)被越來(lái)越多的學(xué)者接受[10]。本試驗(yàn)通過(guò)傳統(tǒng)細(xì)菌學(xué)鑒定和16SrRNA序列分析方法鑒定從牛上呼吸道分離出的3 株細(xì)菌，同時(shí)進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，了解其進(jìn)化關(guān)系。動(dòng)物致病性試驗(yàn)、藥物敏感性篩選為今后進(jìn)一步研究該菌致病情況、耐藥性以及指導(dǎo)臨床用藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源 用無(wú)菌棉簽采集重慶、四川某牛場(chǎng)肉牛的鼻腔黏液，放入已滅菌的LB營(yíng)養(yǎng)肉湯中，4 ℃保存，備用。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 健康家兔，20 日齡健康小鼠。

1.3 主要試劑和材料 實(shí)驗(yàn)室常規(guī)用品由西南大學(xué)榮昌校區(qū)預(yù)防獸醫(yī)教研室提供；微量生化管，購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒、PCR 產(chǎn)物凝膠回收試劑盒，均購(gòu)自廣州飛揚(yáng)生物技術(shù)公司；Mix DL-2 000 Marker、6×Loading Buffer、PCR 試劑盒Premix ExTaq、無(wú)菌雙蒸水，均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；藥敏紙片，購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.4 引物 參考細(xì)菌16SrRNA通用引物（正向：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；反向：5′-GGT TACCTTGTTACGACTT-3′），由上海百力格有限公司合成。

1.5 病原分離 將樣品接種到鮮血瓊脂培養(yǎng)基，置于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h，取單個(gè)菌落進(jìn)一步純化，經(jīng)純化的單個(gè)菌落保存于鮮血瓊脂斜面，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 培養(yǎng)特性及形態(tài)學(xué)觀察 將分離菌株接種于TCBS培養(yǎng)基，置于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)情況及菌落特征。挑取培養(yǎng)基上單個(gè)菌落涂片，進(jìn)行革蘭染色，然后鏡檢。

1.7 生化試驗(yàn) 將分離菌株分別進(jìn)行糖發(fā)酵試驗(yàn)（葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖）、吲哚試驗(yàn)、V-P 試驗(yàn)、M.R.試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)、枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)、氧化酶試驗(yàn)、硝酸鹽試驗(yàn)，置于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h～48 h，觀察并記錄結(jié)果。

1.8 16SrRNA基因的擴(kuò)增及測(cè)序 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 經(jīng)30 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

PCR 產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果照相保存。PCR 產(chǎn)物按照PCR 產(chǎn)物凝膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行膠回收，回收產(chǎn)物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.9 同源性分析和系統(tǒng)進(jìn)化分析 將分離菌株的16SrRNA基因序列通過(guò)NCBI 的Blast 檢索系統(tǒng)進(jìn)行同源性分析，并使用DNAStar 軟件與從Gen-Bank 數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的16SrRNA基因序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.10 藥敏試驗(yàn) 藥敏試驗(yàn)按照CLSI（Clinical and Laboratory Standards Institute）推薦的K-B法進(jìn)行，判定標(biāo)準(zhǔn)參照美國(guó)實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)（NCCLS）藥敏紙片擴(kuò)散法規(guī)標(biāo)準(zhǔn)。

1.11 致病性試驗(yàn) 將該分離菌株DF309-1 于馬丁肉湯中靜置培養(yǎng)18 h，0.2 mL（8.7×108CFU/mL）劑量小鼠腹腔注射。并設(shè)立對(duì)照組，觀察并記錄小鼠的生理狀況。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)特性及形態(tài)學(xué)觀察 分離出3 株細(xì)菌分別命名為FD39-1、ZC3、ZC4。分離菌株在鮮血培養(yǎng)基中呈圓形、光滑、凸起的中等菌落，具有β-溶血現(xiàn)象。在TCBS培養(yǎng)基中呈黃色菌落，經(jīng)革蘭染色為革蘭陰性彎曲桿菌。3 株分離菌株的生化特征見(jiàn)表1。

表1 分離菌株生化特征

2.2 16SrRNA基因的擴(kuò)增 經(jīng)16SrRNA基因擴(kuò)增，擴(kuò)得的凝膠電泳片段與目的片段大小一致（如圖1）。

圖1 分離菌株的擴(kuò)增結(jié)果

2.3 同源性分析與進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建 將3 株分離菌的16SrRNA序列分別通過(guò)Blast（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）在線(xiàn)比較，菌株FD39-1 與9株V.metschnikovii的相似性最高，為99%；菌株ZC3、ZC4 與18 株V.metschnikovii的相似性最高，為95%～96%。

選取GenBank 上登錄的V.metschnikovii 的16SrRNA序列，利用DNAStar 軟件分析，與3 株分離菌株進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建（如圖2）；ZC3 與ZC4 位于同一分支，與印度分離株HQ658055.1、山東青島分離株JX409930.1 進(jìn)化關(guān)系較近，但與FD39-1 進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)，雖然都屬于V.metschnikovii，但不是同一個(gè)進(jìn)化分支。菌株FD39-1 與韓國(guó)分離株KC634073.1（Vibrio sp.M12-1144）進(jìn)化關(guān)系較近。

2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 見(jiàn)表2。

2.5 致病性試驗(yàn)結(jié)果 接種FD39-1 菌株的小鼠主要表現(xiàn)為精神委頓，豎毛，活動(dòng)減少，食欲下降，腹瀉，24 h 全部死亡，剖檢小鼠可見(jiàn)腸絨毛脫落，腸壁化膿性炎癥。取腸內(nèi)容物均分離出該菌。對(duì)照組精神狀況良好，飼養(yǎng)1 周無(wú)死亡。

表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

本試驗(yàn)從肉牛上呼吸道分離到的3 株細(xì)菌在鮮血平板具有β-溶血現(xiàn)象，在TCBS培養(yǎng)基長(zhǎng)出黃色菌落，各項(xiàng)生化結(jié)果均與已報(bào)道的V.metschnikovii生化特性一致[1，11]；分子鑒定采用16SrRNA基因鑒定方法，結(jié)果顯示，3 株分離菌株FD39-1、ZC3、ZC4 的16SrRNA序列與V.metschnikovii的16SrRNA序列同源性分別為99.6%、95.9%、96.4%。結(jié)合培養(yǎng)形態(tài)特征和生化特征，可鑒定3株分離菌株為V.metschnikovii。利用DANStar 構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，顯示ZC3與ZC4進(jìn)化關(guān)系很近，與FD39-1 的進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)，不在同一個(gè)進(jìn)化分支，這是由于ZC3、ZC4 菌株來(lái)源于四川某牛場(chǎng)，而FD39-1 菌株來(lái)源于重慶某肉牛場(chǎng)，不同地區(qū)V.metschnikovii的進(jìn)化有所差異。ZC3 與ZC4 同印度分離株HQ658055.1、山東青島分離株JX409930.1 進(jìn)化關(guān)系較近，屬于同一族。菌株FD39-1與韓國(guó)分離株KC634073.1 進(jìn)化關(guān)系較近，位于第二族。

劉利芝[11]等人對(duì)V.metschnikovii耐藥狀況研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)丁胺卡那霉素、羥氨芐青霉素和克拉維酸、氨芐西林和舒巴坦、先鋒V、頭孢替坦、慶大霉素、四環(huán)素敏感；對(duì)氨芐青霉素、先鋒必、頭孢噻肟、復(fù)達(dá)欣、環(huán)丙沙星、妥布霉素耐藥；對(duì)哌拉西林中度敏感。李正義等[12]研究發(fā)現(xiàn)，V.metschnikovii對(duì)青霉素有耐藥性，對(duì)氨舒鈉和頭孢唑啉中度敏感，對(duì)頭孢替坦、頭孢他定、頭孢曲松、阿米卡星、妥布霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星和磺胺甲惡唑/甲氧芐啶敏感。本試驗(yàn)藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，菌株ZC3、ZC4 僅對(duì)頭孢曲松、洛美沙星、頭孢拉定敏感，環(huán)丙氟哌酸、青霉素等大多數(shù)藥物耐藥，耐藥性較為嚴(yán)重；菌株FD39-1 對(duì)先鋒霉素V、頭孢曲松、洛美沙星、紅霉素敏感，對(duì)青霉素、林克霉素耐藥，這與李正義、王欽升報(bào)道一致。分析認(rèn)為菌株ZC3、ZC4 來(lái)源于四川散養(yǎng)戶(hù)，可能由于抗生素濫用導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性較為嚴(yán)重，F(xiàn)D39-1 來(lái)源于重慶某集約化牛場(chǎng)，管理規(guī)范，用藥合理，因此沒(méi)有嚴(yán)重的耐藥性。

本試驗(yàn)中，采用小鼠進(jìn)行致病性試驗(yàn)，孫延釜[2]、張曉玫[4]、劉利芝[11]等人在研究V.metschnikovii毒力試驗(yàn)中均采用小鼠作為試驗(yàn)動(dòng)物，致病性試驗(yàn)中，接種FD39-1 菌株的小鼠先后發(fā)病，主要表現(xiàn)為精神委頓，豎毛，活動(dòng)減少，飲食下降，腹瀉，24 h 全部死亡，這與孫延釜[3]、劉利芝[11]等人的致病性試驗(yàn)結(jié)果一致，說(shuō)明菌株FD39-1 有很強(qiáng)的致病力。

麥?zhǔn)匣【╒.metschnikovii）主要存在于水產(chǎn)品以及食物中，是一種致病性弧菌，易引起食物中毒。本試驗(yàn)采用傳統(tǒng)細(xì)菌學(xué)鑒定方法和16SrRNA序列分析方法首次從肉牛上呼吸道分離并鑒定出3 株V.metschnikovii，證實(shí)V.metschnikovii存在于肉牛上呼吸道，可能肉牛上呼吸道潛在性病原，并可能成為食源性病原菌來(lái)源之一。因此對(duì)于V.metschnikovii的研究，不僅進(jìn)一步研究V.metschnikovii成為肉牛上呼吸道感染潛在性病原奠定基礎(chǔ)，在食品安全，公共衛(wèi)生方面也有重要意義。

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