敬曉棋，劉健鵬，馮 平，閆海龍，屈 雷

（1.榆林學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，陜西 榆林719000 ；2.榆林市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，陜西 榆林 719000）

奶牛、奶山羊乳房炎的發(fā)生與飼養(yǎng)環(huán)境、營(yíng)養(yǎng)水平、經(jīng)營(yíng)管理、動(dòng)物的遺傳、泌乳性能、胎次、傳染性微生物以及非傳染性環(huán)境微生物等多種因素有關(guān)的疾病，但微生物是導(dǎo)致動(dòng)物乳房炎發(fā)生的最主要原因。奶山羊、奶牛乳房炎的乳腺內(nèi)感染，以典型的乳腺炎癥反應(yīng)和病理學(xué)變化為特征，常導(dǎo)致產(chǎn)奶量下降和奶品質(zhì)的降低。此外，持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間的急性炎癥常常造成泌乳性腺泡細(xì)胞損傷和組織的壞死，甚至永久性的產(chǎn)奶量下降。乳用動(dòng)物乳房炎不僅嚴(yán)重影響奶產(chǎn)業(yè)發(fā)展，而且對(duì)人類的健康和食品安全造成巨大最威脅。

S.aureus是自然界廣泛存在的一種能夠引起人和動(dòng)物多種疾病的病原微生物，是奶牛、奶山羊等乳用動(dòng)物臨床和亞臨床型乳房炎最主要的病原菌之一[1]。由于S.aureus較弱的抗原性、耐藥菌株的不斷出現(xiàn)以及與乳腺之間復(fù)雜的相互作用等[2]，使S.aureus乳房炎的防控和研究工作進(jìn)展較為緩慢。通過(guò)動(dòng)物模型進(jìn)行S.aureus乳房炎發(fā)生、發(fā)展過(guò)程及乳腺免疫機(jī)制的研究，可為乳房炎的預(yù)防、治療提供新的視角和有益的參考。

盡管奶牛、奶山羊是研究乳房炎和乳腺免疫機(jī)制的最佳模型動(dòng)物，然而奶牛、奶山羊高昂的成本以及試驗(yàn)對(duì)生產(chǎn)管理的影響，使其難以在乳房炎免疫機(jī)制研究中大量的用作模型動(dòng)物，因此小鼠成為此類研究合適的選擇[2]。

本試驗(yàn)擬以亞臨床乳房炎主要病原-S.aureus建立亞臨床小鼠乳房炎模型，并通過(guò)病理組織切片進(jìn)行鑒定，為將來(lái)進(jìn)行乳腺免疫等的相關(guān)研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 小鼠 6 周齡的C57BL/6 小鼠，購(gòu)自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，于西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心飼養(yǎng)。小鼠飼養(yǎng)環(huán)境恒溫（22°C）、恒濕，每天光照12 h，自由飲水和采食。小鼠適應(yīng)新環(huán)境1 周后，雌雄合籠交配。分娩后1 周時(shí)，仔鼠不少于5 只的母鼠用于S.aureus乳房炎模型建立。

1.2 菌株 本試驗(yàn)所用金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是從陜西關(guān)中地區(qū)患慢性乳房炎的關(guān)中奶山羊乳汁分離，經(jīng)中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定為金黃色葡萄球菌，并由西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3S.aureus乳腺內(nèi)注射 33 只泌乳7～12 日齡C57BL/6 的小鼠用于本次試驗(yàn)，其中30 只為試驗(yàn)組，其余3 只為生理鹽水對(duì)照。參考Brouillette and Malouin[3]的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行小鼠乳腺內(nèi)S.aureus注射，具體如下。乳腺內(nèi)注射前2 h 將小鼠與仔鼠分離，小鼠按150～200 mg/kg 的劑量腹腔注射氯胺酮，待小鼠麻醉后進(jìn)行乳腺內(nèi)注射。將小鼠用紙膠帶仰面固定于泡沫板上，對(duì)其腹部第4 對(duì)和第5 對(duì)乳腺用70%酒精消毒，用32G 針頭通過(guò)乳導(dǎo)管將1×107CFU 的S.aureus緩慢注入乳腺，每個(gè)乳頭50 μL。對(duì)照組注射等量的無(wú)菌生理鹽水。小鼠放回籠子，自然蘇醒。

1.4 感染小鼠狀態(tài)觀察 分別于感染后2，4，8，12，18，24，36，48，60，72 h 觀察小鼠精神狀態(tài)、采食、飲水、眼睛有無(wú)分泌物及腹部有無(wú)腫脹等。

1.5 組織切片制作與觀察 制作好的組織切片在生物顯微鏡下觀察，并通過(guò)Nikon DS-U2/L2 Controler成像系統(tǒng)和NIS-Elements F 3.22 成像軟件（Nikon）拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 感染小鼠狀態(tài)觀察S.aureus感染乳腺組織后24 h 內(nèi)，小鼠精神狀態(tài)未見(jiàn)異常，采食、飲水表現(xiàn)正常；36 h 和48 h 時(shí)，小鼠精神略顯沉郁，有正常的采食和飲水行為，腹部略有腫脹；60 h 時(shí)小鼠精神狀態(tài)、飲水、采食均與正常小鼠無(wú)異，腹部中腫脹消失；72 h 時(shí)小鼠表現(xiàn)與60 h 相似，但腹部明顯扁平。48 h 時(shí)剖檢小鼠，乳腺呈淡粉紅色，切開(kāi)乳腺組織后有少量乳汁滲出。

2.2 乳腺組織形態(tài)觀察 組織切片顯示，對(duì)照組小鼠乳腺結(jié)構(gòu)完整，連接緊密，腺泡腔充滿乳汁，除了乳腺上皮細(xì)胞外，乳腺組織內(nèi)無(wú)其他細(xì)胞存在（圖1）。乳腺感染S.aureus的小鼠，在感染后2 h 時(shí)乳腺組織結(jié)構(gòu)與對(duì)照相似，腺泡結(jié)構(gòu)完整，連接緊密，腺泡腔內(nèi)乳汁中可見(jiàn)個(gè)別淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)（圖2）；4 h 時(shí)腺泡腔淋巴細(xì)胞增多，腺泡壁可見(jiàn)向乳汁遷移的淋巴細(xì)胞（圖3）；8 h 時(shí)大量淋巴細(xì)胞向腺泡腔內(nèi)遷移，乳汁中出現(xiàn)較多淋巴細(xì)胞（圖4）；12 h（圖5）、18 h（圖6）時(shí)，乳腺形態(tài)與8 h相似，但出現(xiàn)大量淋巴細(xì)胞向腺泡腔內(nèi)遷移，乳汁中出現(xiàn)大量淋巴細(xì)胞；24 h（圖7）、36 h（圖8）時(shí)腺泡腔出現(xiàn)大量的淋巴細(xì)胞，但少數(shù)細(xì)胞形態(tài)不完整，可能是衰老或死亡的細(xì)胞；48 h 時(shí)乳腺質(zhì)存在大量免疫細(xì)胞浸潤(rùn)（圖9）；60 h 時(shí)乳腺質(zhì)存在大量免疫細(xì)胞浸潤(rùn)，部分乳腺上皮被脂肪組織所替代（圖10）；72 h 時(shí)，乳腺組織加劇退化，腺泡萎縮、裂解，較多上皮被脂肪組織替代（圖11）。

3 討論

3.1 小鼠乳房炎模型 盡管反芻動(dòng)物和嚙齒動(dòng)物類在乳腺上存在一些差異，但小鼠仍然是研究乳腺免疫和病理反應(yīng)的最理想的模型動(dòng)物，也是最為經(jīng)濟(jì)的研究模型。目前，小鼠模型已逐漸應(yīng)用于多種不同病原菌或菌體成分誘導(dǎo)的乳房炎的乳腺病理、免疫反應(yīng)機(jī)制及乳房炎控制等方面的研究，特別是S.aureus和E.coli等病原性乳房炎的研究[3-4]。Chandler[5]首次成功的建立了小鼠S.aureus乳房炎模型，并進(jìn)行了病理組織學(xué)等鑒定和研究。此后，小鼠乳房炎模型開(kāi)始逐漸應(yīng)用于S.aureus乳腺內(nèi)感染的病理組織學(xué)[6]、細(xì)菌毒力因子作用[7]、乳房炎疫苗免疫保護(hù)[8]及抗生素治療[9]等研究。

S.aureus主要引起奶牛和奶山羊的慢性、亞臨床型乳房炎，而以小鼠為模型的乳房炎研究多是建立急性型模型，檢測(cè)時(shí)間也基本上在24 h 以內(nèi)。Tuchscherr，Buzzola，Alvarez，Caccuri，Lee and Sordelli[10]等建立了慢性的小鼠乳房炎模型，試驗(yàn)在感染后持續(xù)進(jìn)行了12 d 的指標(biāo)檢測(cè)，但他們所用的菌株為缺失CP5 和CP8 嚢膜多糖的S.aureus株，并不能完全反映乳腺對(duì)S.aureus正常的免疫應(yīng)答。本試驗(yàn)所用菌株為陜西省關(guān)中地區(qū)奶山羊亞臨床型乳房炎乳汁分離所得，經(jīng)鑒為正常的S.aureus，并成功建立亞臨床型的小鼠乳房炎模型。

圖1 對(duì)照組小鼠乳腺結(jié)構(gòu)完整，上皮細(xì)胞連接緊密，腺泡內(nèi)充滿乳汁

圖2 S.aureus感染后2 h,腺泡結(jié)構(gòu)完整，乳汁中可見(jiàn)個(gè)別免疫細(xì)胞

圖3 S.aureus感染后4 h，腺泡腔內(nèi)存在少量淋巴細(xì)胞，腺泡壁上看見(jiàn)遷移的免疫細(xì)胞

圖4 S.aureus感染后8 h，腺泡腔有較多淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，腺泡壁大量遷移免疫細(xì)胞

圖5 S.aureus感染后12 h，腺泡腔有大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，腺泡壁存在大量遷移免疫細(xì)胞

圖6 S.aureus感染后18 h，腺泡腔有較多淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，腺泡壁大量遷免疫細(xì)胞

圖7 S.aureus感染后24 h，腺泡腔出現(xiàn)大量的免疫細(xì)胞

圖8 S.aureus感染后36 h，腺泡腔出現(xiàn)大量的免疫細(xì)胞

圖9 S.aureus感染后48 h，腺泡間質(zhì)出現(xiàn)大量的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)

圖10 S.aureus感染后60 h，腺泡間質(zhì)有免疫細(xì)胞浸潤(rùn)，腺泡腔存在免疫細(xì)胞

圖11 S.aureus感染后72 h，乳腺組織萎縮、退化，部分乳腺上皮被脂肪組織所替代

3.2 金黃色葡萄球菌性乳房炎 引起奶牛、奶山羊乳房炎的微生物包括革蘭陰性腸桿菌屬、葡萄球菌屬、鏈球菌屬、諾卡菌屬、克萊伯菌屬及支原體等137 種[11]，但大腸桿菌、金黃色葡萄球菌是臨床中最為常見(jiàn)病原。乳房炎病原調(diào)查顯示，乳腺內(nèi)感染大腸桿菌時(shí)一般表現(xiàn)為急性的臨床型乳房炎，具有典型的乳房腫脹、發(fā)熱、疼痛、乳汁黏稠、變黃等局部炎癥反應(yīng)，嚴(yán)重的還表現(xiàn)全身性癥狀[12]。而S.aureus的乳腺內(nèi)感染既可以引起急性的、臨床型乳房炎，但大多數(shù)情況下為慢性的、亞臨床型的隱性乳房炎。亞臨床型乳房炎除乳中體細(xì)胞數(shù)增多、乳品質(zhì)改變外，一般無(wú)明顯的乳腺局部或全身性炎癥反應(yīng)，只有通過(guò)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)才能夠確診。臨床中以S.aureus性隱性乳房炎多見(jiàn)，且由于其無(wú)明顯的臨床和病理學(xué)變化以及長(zhǎng)期的抗生素治療，而導(dǎo)致養(yǎng)殖場(chǎng)巨大的經(jīng)濟(jì)損失，并對(duì)人的食品安全和健康構(gòu)成巨大的威脅。

本試驗(yàn)以S.aureus為乳腺感染病原，利用C57BL/6 小鼠建立了小鼠S.aureus性亞臨床乳房炎模型。小鼠乳腺內(nèi)注射S.aureus后24 h 內(nèi)，小鼠精神狀態(tài)未見(jiàn)異常，采食、飲水表現(xiàn)正常；36 h和48 h 時(shí)，小鼠精神略顯沉郁，有正常的采食和飲水行為，腹部略有腫脹；60 h 時(shí)小鼠精神狀態(tài)、飲水、采食均與正常小鼠無(wú)異，腹部中腫脹消失；72 h 時(shí)小鼠表現(xiàn)與60 h 相似，但腹部明顯扁平。整個(gè)試驗(yàn)期間，小鼠未出現(xiàn)腹部明顯腫脹、發(fā)紅、精神沉郁等臨床乳房炎的局部和全身癥狀，在一定程度上表明我們成功的建立了小鼠S.aureus性亞臨床乳房炎模型。

病理組織切片結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠乳腺結(jié)構(gòu)完整，連接緊密，腺泡腔充滿乳汁，除乳腺上皮細(xì)胞外，乳腺內(nèi)未見(jiàn)其他細(xì)胞存在（圖3）。感染后2 h 無(wú)對(duì)照小鼠乳腺組織結(jié)構(gòu)完整，但乳汁中以可見(jiàn)個(gè)別免疫細(xì)胞（圖4），表明S.aureus感染乳腺2 h 即有免疫細(xì)胞趨化進(jìn)入組織。乳腺內(nèi)注射S.aureus后4 h、8 h、12 h 和18 h 可見(jiàn)腺泡腔內(nèi)免疫細(xì)胞逐漸增多，且有大量的細(xì)胞突出于腺泡壁內(nèi)（圖5，6，7，8），可能是正在遷移的免疫細(xì)胞，表明感染S.aureus18 h 內(nèi)，乳腺的天然免疫防御啟動(dòng)并逐漸加強(qiáng)。感染S.aureus后24 h、36 h 腺泡腔內(nèi)可見(jiàn)到大量的免疫細(xì)胞（圖9，10），48 h、60 h 乳腺間質(zhì)出現(xiàn)明顯的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)，部分乳腺組織開(kāi)始萎縮（圖11，12），這可能是細(xì)菌感染后天然免疫反應(yīng)完全啟動(dòng)，免疫細(xì)胞清除侵入的病原微生物和死亡細(xì)胞。S.aureus乳腺內(nèi)注射后72 h，乳腺組織繼續(xù)退化、萎縮，此時(shí)不能夠從組織切片區(qū)分出上皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞（圖1）。

本試驗(yàn)中，S.aureus感染乳腺組織后72 h 內(nèi)，小鼠外觀無(wú)明顯改變，僅有輕微的局部癥狀，也無(wú)全身癥狀出現(xiàn)，組織切片顯示2 h 即開(kāi)始有免疫細(xì)胞進(jìn)入乳腺，并隨時(shí)間浸潤(rùn)細(xì)胞逐漸增多，表明我們成功建立起S.aureus性小鼠亞臨床型乳房炎，可用于乳房炎早期天然免疫和其后適應(yīng)性免疫及其他的相關(guān)研究。

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